中藥紫花地丁黃酮碳苷類化學成分的超高效液相色譜-電噴霧離子源-四極桿飛行時間串聯質譜研究

秦 艷，尹建兵，杜冬生，曹 捷，尹成樂，程志紅*

(1.復旦大學 藥學院 生藥學教研室，上海 201203；2.浙江省醫療器械不良事件監測中心，浙江 杭州 311121)

中藥紫花地丁黃酮碳苷類化學成分的超高效液相色譜-電噴霧離子源-四極桿飛行時間串聯質譜研究

秦 艷1，尹建兵2，杜冬生1，曹 捷1，尹成樂1，程志紅1*

(1.復旦大學 藥學院 生藥學教研室，上海 201203；2.浙江省醫療器械不良事件監測中心，浙江 杭州 311121)

采用超高效液相色譜-電噴霧離子源-四極桿飛行時間串聯質譜(UPLC-ESI-QTOF-MS/MS)方法，以中藥紫花地丁中分離得到的5個黃酮碳苷化合物為對照品，研究了黃酮二糖碳苷類化合物在ESI-QTOF-MS/MS質譜中的裂解規律。研究進一步證實了文獻報道的黃酮二糖碳苷C-6位取代糖基較C-8位糖更易優先發生裂解；但同時發現結構中如果含有不穩定構象的糖基取代時，該規律不再適用。通過對照品的質譜裂解規律，并結合文獻和高分辨質譜數據，成功表征和鑒定了紫花地丁中21個黃酮二糖碳苷類以及4個黃酮氧苷類成分。該方法能快速、靈敏、準確地對中藥中微量黃酮碳苷類成分的結構進行表征和鑒定。

紫花地丁；黃酮碳苷；四極桿飛行時間質譜；液相色譜-質譜聯用

紫花地丁為堇菜科堇菜屬植物紫花地丁ViolayedoensisMakino的干燥帶根全草，其性寒，味苦、辛；具有清熱解毒和涼血消腫的功效，用于治療疔瘡腫毒、癰疽發背、丹毒和毒蛇咬傷等[1]。該植物主要含有黃酮及其苷類、香豆素及其苷類和倍半萜類等多種化學成分[2-4]。其中黃酮類成分具有顯著的抗菌和抗氧化等活性[2,5]，是紫花地丁最為重要的活性成分之一。紫花地丁中的黃酮類成分主要為碳苷類[2,6]，這類成分不同于黃酮氧苷，其糖部分很難水解，且由于苷元和糖端基碳之間C—C鍵的旋轉，造成了該類化合物核磁共振(NMR)信號的嚴重展寬[7]，不利于該類化合物的結構解析。一般需在較高的樣品量和高溫NMR(大于60 ℃)中才能獲得分辨率較好的NMR信號。因此對于該類化合物的結構研究，采用傳統的NMR法是一個巨大的挑戰。而采用靈敏度高的液相色譜-質譜聯用法分析和檢測中藥中的微量黃酮碳苷類成分具有重要的科學意義。

筆者所在課題組前期采用高效液相色譜-電噴霧離子源-離子阱-多級質譜(HPLC-ESI-IT-MSn)法對紫花地丁中的黃酮碳苷類成分進行了分析，發現了該類成分在離子阱質譜中的裂解規律[8]。但該方法是在HPLC中分離，且經MS5級裂解對黃酮碳苷化合物進行結構鑒定。而關于紫花地丁中的該類化合物在超高效液相色譜(UPLC)并結合四極桿飛行時間(QTOF)高分辨質譜中的裂解行為，尚未見報道。本研究首先對從紫花地丁中分離鑒定的5個黃酮碳苷類化合物進行了UPLC-ESI-QTOF-MS/MS分析；結合文獻研究，總結了黃酮二糖碳苷類化合物在ESI-QTOF-MS中的裂解規律，并應用該質譜裂解規律和高分辨質譜數據進一步分析和鑒定了紫花地丁中的黃酮碳苷類成分。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Waters AcquityTMUPLC system(配備有Acquity UPLC Sample Manager、FTN Acquity UPLC PDA Detector、Waters XevoTMG2QTOF-MS和Masslynx、Markerlynx工作站)；KQ5200E型超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Elix/RIOS純水系統(美國密理博公司)。

圖1 紫花地丁中5個主要黃酮碳苷的化學結構Fig.1 Chemical structures of five standard flavone di-C-glycosides isolated from Viola yedoensis

紫花地丁藥材購自上海華宇藥業有限公司，產地為浙江，經作者鑒定為堇菜科植物紫花地丁ViolayedoensisMakino 的干燥帶根全草；標本(DH2008082905)保存于復旦大學藥學院生藥學教研室。對照品：芹菜素-6,8-二-C-β-D-葡萄糖苷(S1)、芹菜素-6-C-α-L-阿拉伯糖-8-C-β-D-木糖苷(S2)、芹菜素-6-C-β-D-葡萄糖-8-C-α-L-阿拉伯糖苷(S3)、芹菜素-6,8-二-C-α-L-阿拉伯糖苷(S4)、芹菜素-6-C-β-D-葡萄糖-8-C-β-L-阿拉伯糖苷(S5)和山奈酚-3-O-β-D-槐糖-7-O-α-L-鼠李糖苷(S6)均由本實驗室自制，其化學結構式(圖1)經NMR,MS和UV等多種方法鑒定[2,9]。乙腈、甲醇(色譜純，德國Merck公司)。

1.2 對照品與供試品溶液的制備

取各對照品約1.0 mg，加入甲醇2 mL，溶解，搖勻，即得各對照品溶液。取干燥紫花地丁藥材，粉碎，過100目篩，精密稱取粗粉2.0 g，精密加入75%甲醇水溶液40 mL，精密稱定，超聲提取30 min后，放冷，精密稱定，以甲醇補足失重，過濾；精密吸取續濾液20.0 mL，減壓濃縮至干。以75%甲醇水溶液將樣品完全溶解，并轉移定容至5 mL量瓶中，搖勻，經微孔濾膜(0.22 μm)過濾，取續濾液，作為供試品溶液。

1.3 色譜條件

ThermoScientific Hypersil C18- GOLD柱(100 mm × 2.1 mm，1.9 μm)；流動相：乙腈(A)-0.1%乙酸水溶液(B)，線性梯度洗脫：0～3 min，5%～10%A；3～5 min，10%～12%A；5～10 min，12%～15%A；10～12 min，15%～18%A；12～14 min，18%～100%A；14～15 min，100%A；檢測波長為230 nm,272 nm和342 nm；柱溫35 ℃；流速0.5 mL/min；進樣量1 μL。

1.4 質譜條件

ESI離子源；毛細管電壓：3.0 kV；錐孔電壓：40 V(ESI+)，55 V(ESI-)；萃取電壓：4.0 V；離子源溫度：120 ℃；脫溶劑氣(氮氣)溫度：450 ℃；錐孔氣(氮氣)流量：150 L/h(ESI+)，50 L/h(ESI-)；脫溶劑氣流量：600 L/h；MS/MS條件：碰撞能量：30 keV；每0.2 s采集1次圖譜；質量掃描范圍：100～1 000m/z。

1.5 黃酮碳苷類化合物質譜裂解碎片的命名

圖2 黃酮二糖碳苷的質譜特征離子及裂解示意圖Fig.2 Fragment nomenclature and MS fragmentation mechanism proposed for an apigenin 6,8-di-C-glycoside

2 結果與討論

2.1 黃酮碳苷類單體化合物的紫外光譜特征

圖3 黃酮碳苷S1(a)及黃酮氧苷S6(b)的UV圖譜Fig.3 UV spectra of a flavone C-glycoside(S1，a) and a flavonol O-glycoside(S6，b)

本研究選取了從紫花地丁中分離鑒定的黃酮碳苷類成分S1和黃酮氧苷類成分S6，在200～400 nm波長范圍分別對其紫外光譜進行掃描(見圖3)。結果顯示，黃酮碳苷類化合物S1有3個特征吸收帶：347，271，227 nm；而黃酮氧苷S6有兩個特征吸收帶：355 nm和266 nm。這些黃酮碳苷和氧苷的UV特征吸收與文獻報道一致[11]。利用兩者的紫外特征圖譜，可初步鑒別和區分黃酮碳苷和氧苷類化合物。本文選擇PDA檢測器的三通道檢測230，272，342 nm作為黃酮碳苷類成分的特征檢測波長。在上述波長下，黃酮氧苷類化合物也同樣會被檢測到。

2.2 質譜條件的優化

圖5 芹菜素-6-C-β-D-葡萄糖-8-C-α-L-阿拉伯糖苷(S3)在不同碰撞能量時的MS/MS圖Fig.5 ESI-QTOF MS(A)and MS/MS spectra(B-E) of apigenin 6-C-β-D-glucosyl-8-C-α-L-arabinoside(S3) in different collision energy B.20 keV，C.25 keV，D.30 keV，E.35 keV

2.2.2 MS/MS碰撞能量的考察在ESI負離子模式下，對黃酮碳苷類化合物二級質譜中不同碰撞能量進行考察，以對照品芹菜素-6-C-β-D-葡萄糖-8-C-α-L-阿拉伯糖苷(S3)為例，該化合物在20 keV和25 keV的碰撞能量下基本不發生裂解或裂解碎片較少(圖5B和C)；當碰撞能量增至30 keV時(圖5D)，產生黃酮碳苷類的特征性碎片離子峰，且碎片峰強度適中；繼續提高碰撞能量至35 keV時(圖5E)，產生的特征性碎片離子種類和30 keV時較為相近，鑒于其主要特征離子峰(如m/z473和443)強度已顯著降低，因此選擇碰撞能量為30 keV對黃酮碳苷類化合物進行MS/MS分析。

2.3 黃酮二糖碳苷對照品的ESI-QTOF-MS/MS碎片離子結構分析

以上黃酮碳苷對照品S1-S4的質譜裂解行為與文獻[8,12]報道的一致：六碳糖主要產生0,2裂解脫120 amu和0,3裂解脫90 amu的峰，而五碳糖主要產生0,2裂解脫90 amu和0,3裂解脫60 amu的峰。且C-6位上連接的糖較C-8位上連接的糖更容易優先發生碎裂，因此MS/MS中脫1個糖的碎片離子一般為C-6位上的糖產生的，然后再發生C-8位上糖的裂解。這在S3中表現的最為明顯：其MS/MS二級質譜中有豐度較高的來源于C-6位六碳糖裂解產生的[M-120-H]-和[M-90-H]-碎片離子，而來源于其C-8位五碳糖的特征碎片離子[M-60-H]-的豐度非常弱(表1)，說明C-6位的葡萄糖先裂解，在此基礎上又發生了C-8位上阿拉伯糖的裂解。

圖6 芹菜素-6-C-β-D-葡萄糖-8-C-α-L-阿拉伯糖苷(S3，A)和芹菜素-6-C-β-D-葡萄糖-8-C-β-L-阿拉伯糖苷(S5，B)的MS/MS圖Fig.6 ESI-QTOF MS/MS spectra of apigenin 6-C-β-D-glucosyl-8-C-α-L-arabinoside(S3，A)and apigenin 6-C-β-D-glucosyl-8-C-β-L-arabinoside(S5，B)

表1 黃酮二糖碳苷類對照品的主要質譜碎片離子峰

2.4 紫花地丁中黃酮碳苷類化合物的UPLC-QTOF-MS/MS檢測與結構表征

使用上述優化的UPLC-QTOF-MS/MS法對紫花地丁75%甲醇提取物中的黃酮苷類化合物進行結構表征。圖7為紫花地丁75%甲醇提取物典型的PDA色譜圖和總離子流圖。對這些化合物的質譜MS1-2行為進行分析，對其碎片離子進行歸屬，并根據其裂解規律、PDA特征圖譜(表2～4)、對照品的保留時間和高分辨質譜給出的精確分子量，對這些黃酮碳苷類化合物進行了結構表征，共發現黃酮碳苷類化合物21個。

表2 紫花地丁中黃酮-6,8-di-C-六碳糖苷和黃酮6,8-di-C-五碳糖苷類化合物的色譜及質譜信息

紫花地丁75%甲醇提取物中共檢出7個黃酮雙五碳糖碳苷類化合物：P14,P18～P22和P24(表2)。其中6個化合物P14,P18-P21和P24的分子量和裂解行為非常一致：一級質譜均給出準分子離子峰m/z533[M-H]-(基峰)；二級質譜產生m/z443[M-90-H]-,m/z473[M-60-H]-，m/z353[M-180-H]-和m/z383[M-150-H]-的五碳糖裂解產生的特征碎片離子，推測這些化合物中含有2個五碳糖，且分別連接在C-6和C-8位上。根據其苷元的特征碎片離子m/z353，推測其苷元均為芹菜素。因此，鑒于以上質譜數據，推定這6個化合物均為芹菜素6,8-雙-C-五碳糖苷。通過與對照品的保留時間、PDA圖譜和MS/MS數據對比分析，可以進一步鑒定P19為芹菜素-6,8-雙-C-α-L-阿拉伯糖苷(S4)，P24為芹菜素-6-C-α-L-阿拉伯糖-8-C-β-D-木糖苷(S2)(表2)。

表3 紫花地丁中黃酮-6,8-C-六碳糖-五碳糖苷化合物的色譜及質譜信息

(續表3)

化合物P26的準分子離子峰為m/z575.141 1[M-H]-，MS/MS中存在豐度較強的m/z515[M-42-18-H]-碎片峰，推測可能是脫乙酰基產生的特征碎片離子。此外，由碎片離子m/z425[M-60-90-H]-和m/z335[M-60-90-90-H]-，進一步推測出該結構中含有2個C-五碳糖。鑒于相對高強度的脫乙酰基峰，并結合前期采用離子阱技術對紫花地丁黃酮碳苷類化合物的研究結果[8]，推測乙酰基連在C-6位的五碳糖上，因此可推測P26的結構為芹菜素-6-C-(2′′′-乙酰基)五碳糖-8-C-五碳糖苷(表4)。

表4 紫花地丁中乙酰基取代的黃酮碳苷類化合物的色譜及質譜信息

2.5 紫花地丁中黃酮氧苷類的檢測與表征

表5 紫花地丁中黃酮氧苷類化合物的色譜及質譜信息

3 結 論

本研究采用UPLC-ESI-QTOF-MS/MS法首次對從中藥紫花地丁中分離鑒定的5個黃酮二糖碳苷化合物進行了質譜裂解規律分析。通過這些黃酮二糖碳苷的二級質譜碎片分析，可以確定黃酮苷元的類型、C-6和C-8位取代糖基的類型和位置。利用該方法所建立的質譜裂解規律，共從紫花地丁75%甲醇提取物中鑒定出21個黃酮碳苷類化合物，全部為黃酮二糖碳苷，其中只有6個化合物是先前通過傳統柱色譜分離得到。這些化合物的苷元主要為芹菜素、木犀草素和金圣草黃素/香葉木素。此外，在碎片峰的歸屬上，盡管QTOF-MS/MS法沒有IT-MSn法對離子的親緣關系提供更為直接的證據，但是憑借其給出的二級質譜碎片信息也可實現對黃酮碳苷結構的鑒定。加之ESI-QTOF-MS/MS法也是目前主流的液質聯用工具之一，本文的研究表明結合其高分辨技術和MS/MS二級裂解研究，可以實現中藥中黃酮二糖碳苷的結構表征和鑒定研究。

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Characterization of Flavone di-C-glycosides in Viola yedoensis by Ultrahigh Performance Liquid Chromatography-Electrospray Ionization-Quadrupole Time of Flight-Mass Spectrometry

QIN Yan1，YIN Jian-bing2，DU Dong-sheng1，CAO Jie1，YIN Cheng-le1，CHENG Zhi-hong1*

(1.Department of Pharmacognosy，School of Pharmacy，Fudan University，Shanghai 201203，China；2.Center for Medical Device Events Monitoring of Zhejiang，Hangzhou 311121，China)

MS/MS fragmentation patterns of five flavone di-C-glycoside standards fromViolayedoensiswere studied by ultrahigh performance liquid chromatography-electrospray ionization-quadrupole time of flight-mass spectrometry(UPLC-ESI-QTOF-MS/MS) in the negative ion mode.The fragmentation pathways of C-6 and C-8 sugars in these flavone di-C-glycosides were consistent with those reported earlier.The results of our study also suggested that the configurations of sugars at C-8 obviously influenced the fragmentation behaviors.The fragmentation behaviors of these flavone di-C-glycoside standards were successfully used to characterize flavoneC-glycosides inV.yedoensis.Total of 21 flavone di-C-glycosides along with 4 flavonolO-glycosides were identified or tentatively identified on the base of their MS/MS data，accurate molecular weights，or by comparing with reference standards.The UPLC-ESI-QTOF-MS/MS method is rapid，sensitive and accurate,and could be used for the characterization of flavoneC-glycosides in traditional Chinese medicines.

Violayedoensis；flavoneC-glycoside；quadrupole time of flight-mass spectrometry(QTOF-MS)；liquid chromatography-mass spectrometry(LC-MS)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.01.002

2016-09-28；

2016-11-10

國家自然科學基金面上項目(81073025)

*通訊作者：程志紅，博士，副研究員，研究方向：中藥藥效物質基礎及質量控制研究，Tel：021-51980157，E-mail：chengzhh@fudan.edu.cn

O657.63；TQ460.72

A

1004-4957(2017)01-0009-09