Smad3對非小細胞肺癌A549細胞和宮頸癌HeLa細胞遷移的影響

韋榮飛，李夢媛，楊星九，朱瑞敏，徐大模，高 苒

(中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，北京協和醫學院比較醫學中心，北京 100021)

Smad3對非小細胞肺癌A549細胞和宮頸癌HeLa細胞遷移的影響

韋榮飛，李夢媛，楊星九，朱瑞敏，徐大模，高 苒*

(中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，北京協和醫學院比較醫學中心，北京 100021)

目的 過表達、敲低或抑制Smad3的活性，探討Smad3對非小細胞肺癌A549細胞和宮頸癌HeLa細胞遷移的影響。方法 設計擴增Smad3基因全長編碼序列cDNA的引物，通過分子克隆技術構建pCMV-Myc-Smad3過表達載體，同時設計并合成靶向Smad3的siRNA序列，在A549和HeLa細胞中過表達或敲低Smad3，或者利用Smad3的抑制劑SIS3 2 μM處理細胞，采用細胞劃痕的方法研究Smad3對A549和HeLa細胞遷移的影響。結果 利用分子克隆技術成功構建pCMV-Myc-Smad3過表達載體。過表達Smad3促進A549和HeLa細胞的遷移。敲低Smad3抑制A549和HeLa細胞的遷移。SIS3抑制Smad3的活性導致A549和HeLa細胞的遷移速率變慢。結論 Smad3促進A549和HeLa細胞的遷移。

Smad3；過表達載體；RNA干擾；SIS3；細胞遷移

TGF-β(transforming grpwth factor beta，轉化生長因子β)信號通路是調節細胞生長的重要的信號通路，機體對TGF-β信號通路響應的敏感性降低，將會導致腫瘤的形成[1]。經典的TGF-β信號通路由TGF-β I型和II型受體(TGFBR1，TGFBR2)介導，TGFBR1和TGFBR2與TGF-β結合后能夠磷酸化下游R-Smads(receptor-activated Smads)蛋白，包括Smad2和Smad3[2,3]。激活的R-Smads蛋白隨后與Smad4結合并轉移至細胞核中調控基因的轉錄[4-6]。正常的生理條件下，在多種組織器官中，包括乳房組織，Smad3能夠抑制細胞的增殖并促進細胞凋亡，而在乳腺癌晚期，Smad3能夠促進乳腺癌細胞的轉移[7]。2015年，Rodney B Luwor等在MolecularCancer雜志發表文章揭示，與非遷移細胞相比，遷移的人乳腺癌MDA-MB-231細胞中，Smad3具有更高的活性[8]。除了乳腺癌細胞，Smad3是否也能影響其他類型的癌細胞的遷移呢？為探討該科學問題，我們通過構建pCMV-Myc-Smad3過表達載體，檢測過表達Smad3后對宮頸癌HeLa細胞和非小細胞肺癌A549細胞遷移的影響。同時，通過RNAi干擾及Smad3抑制SIS3處理細胞敲低Smad3的蛋白水平或抑制Smad3的活性，進一步驗證Smad3對宮頸癌HeLa細胞和非小細胞肺癌A549細胞遷移的影響。

1 材料和方法

1.1 細胞及主要試劑

載體構建PCR引物由上海維基生物科技有限公司合成；Taq polymerase、dNTP購自寶生物工程(大連)有限公司；限制性內切酶Sal I、Not I及T4 DNA連接酶購自美國NEB公司；感受態細胞DH5α購自天根生化科技(北京)有限公司；質粒提取盒購自德國Qiagen公司；胎牛血清、DMEM、胰酶購自美國Gibco公司；RIPA裂解液購自Sigma公司；蛋白Marker及發光底物購自Thermo公司；Lipofectamine 2000及RNAiMax轉染試劑購自Life Technologies公司。HEK-293T、HeLa和A549細胞系為本實驗室所凍存。

1.2 實驗方法

1.2.1 pCMV-Myc-Smad3過表達載體的構建

1.2.1.1 Smad3 DNA目的片段的獲得

提取HeLa細胞的總RNA，并進行cDNA擴增；根據CDS序列(NM_005902.3)設計含有Sal I和Not I限制性內切酶位點的引物序列；以反轉錄的Smad3 cDNA作為模板，擴增Smad3 DNA目的片段，條件為95℃預變性5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min 20 s，共35個循環，72℃ 5 min。將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，紫外燈下切割含有目的條帶的凝膠塊，利用凝膠回收試劑盒回收目的片段。

1.2.1.2 酶切

利用Sal I和Not I限制性內切酶對PCR獲得的Smad3 DNA目的片段及pCMV-Myc-vector進行酶切，酶切條件為37℃ 過夜。將酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，紫外燈下切割含有目的條帶的凝膠塊，利用凝膠回收試劑盒回收目的片段。

1.2.1.3 連接及轉化

利用T4 DNA連接酶將酶切回收后的Smad3 DNA片段和線性pCMV-Myc-vector進行連接，連接條件為16℃過夜。連接產物轉化感受態DH5α細胞，在含有氨芐霉素的LB平板上篩選克隆。挑取陽性克隆，過夜搖菌擴增。

1.2.1.4 質粒提取、酶切鑒定及測序

利用質粒提取試劑盒提取陽性菌中的質粒。采用Sal I和Not I限制性內切酶對重組質粒pCMV-Myc-Smad3進行雙酶切鑒定，并以1%瓊脂糖凝膠電泳驗證片段大小，同時對重組質粒進行基因測序鑒定。

1.2.1.5 HeLa細胞和A549細胞的培養

HEK-293T、HeLa和A549細胞培養基為含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM高糖培養基。培養于37℃，5% CO2的細胞培養箱。

1.2.1.6 質粒的表達檢測

用胰酶將HEK-293T細胞消化成單細胞懸液并對24孔板進行鋪板，24 h后，通過Lipofectamine 2000將0.8 μg的pCMV-Myc-vector和重組質粒pCMV-Myc-Smad3分別轉染。24 h后，RIPA裂解液裂解細胞，加入等體積的2×loading buffer，沸水煮15 min，得到蛋白樣品。隨后利用Myc標簽抗體進行Western blot檢測重組質粒pCMV-Myc-Smad3的表達情況。

1.2.2 劃痕實驗

用胰酶將HeLa和A549細胞消化成單細胞懸液并對6孔板進行鋪板，24 h后，通過Lipofectamine 2000或RNAiMax轉染試劑將3 μg的重組質粒pCMV-Myc-Smad3或Smad3的siRNA分別進行轉染。40 h后，用20 μL槍頭沿直線對6孔板中長滿的細胞進行劃痕，0 h、24 h及48 h時分別拍照記錄細胞的遷移情況。Smad3抑制劑SIS3(工作濃度2 μM)加入細胞培養基中培養細胞，劃痕及記錄方法同上。

1.3 統計學方法

細胞遷移劃痕實驗每個時間點隨機選取5個視野拍照，并利用ZEN 2軟件測量劃痕間距，以時間點0 h劃痕寬度作為標準即100%，其他時間點劃痕間距與0 h劃痕間距的比值即為該時間點劃痕兩側的相對距離(百分比)，相對距離越小，則說明相對遷移速率越大。利用Graphpad Prism 7對結果進行t檢驗，P< 0.05表示有統計學意義。

2 結果

2.1 pCMV-Myc-Smad3過表達載體的構建

Smad3蛋白由425個氨基酸組成，其主要包含兩個結構域：MH1和MH2結構域(圖1A)。MH1和MH2對于Smad3正常生物學功能的發揮至關重要。我們以cDNA作為模板，用引物Smad3-F/R(表1)進行擴增，選擇Sal I和Not I分別為上下游內切酶切割位點(圖1B)，得到與預期片段大小相符的特異性片段(圖2A)。利用Sal I和Not I對PCR產物進行酶切后，通過T4 DNA連接酶將酶切產物連接至pCMV-Myc載體上。經測序比對及圖2B酶切鑒定結果顯示，Smad3 DNA全長片段已成功插入pCMV-Myc載體上。如圖2C，Western blot結果顯示，與HEK-293T細胞中只轉染了Myc-vector的對照組相比，轉染Myc-Smad3過表達質粒24 h后，在約55 kDa大小處檢測到Smad3的過表達條帶，表明pCMV-Myc-Smad3過表達載體構建成功。

表1 pCMV-Myc-Smad3過表達載體構建所需引物

注：(A)為Smad3蛋白的結構示意圖，主要包括MH1和MH2結構域；(B)為pCMV-Myc-Smad3過表達載體構建示意圖，其中，選取Sal I和Not I分別為上下游限制性內切酶切割位點。圖1 Smad3蛋白和pCMV-Myc-Smad3過表達載體構建示意圖 Note.(A)indicates the structure diagram of Smad3, including MH1 and MH2 domain;(B)indicates the plasmid profile of pCMV-Myc-Smad3.Fig.1 Structure diagram of Smad3 and pCMV-Myc-Smad3 plasmid construction.

注：(A)為利用引物Smad3-F/R擴增Smad3 DNA片段；(B)為Sal I/Not I酶切鑒定pCMV-Myc-Smad3質粒；(C)為HEK-293T細胞中轉染pCMV-Myc-Smad3過表達質粒，Myc-vector作為陰性對照，利用Myc標簽抗體進行Western blot檢測Smad3的過表達情況。圖2 pCMV-Myc-Smad3過表達載體的構建及蛋白表達檢測Note.(A)indicates PCR for amplification of Smad3 DNA;(B)indicates the restriction enzyme digestion for pCMV-Myc-Smad3 by Sal I + Not I;(C)indicates the detection of protein expression level of pCMV-Myc-Smad3 in HEK-293T by Western blot.Fig.2 Construction of pCMV-Myc-Smad3 plasmid

2.2 Smad3抑制劑SIS3對非小細胞肺癌A549細胞和人宮頸癌HeLa細胞遷移的影響

SIS3是Smad3的抑制劑，其能有效抑制Smad3的磷酸化，進而阻止Smad3進入細胞核參與基因的轉錄調控。為研究SIS3對細胞遷移的影響，首先，在A549細胞中檢測SIS3對Smad3的抑制作用，以證明SIS3的活性。如圖3所示，SIS3能夠有效抑制Smad3的磷酸化。與DMSO處理組相比，含2 μM SIS3的DMEM培養基培養細胞，劃痕后0、24、48 h，A549(圖4A)和HeLa(圖4B)細胞遷移結果顯示，SIS3能夠有效抑制細胞的遷移。

注：上圖分別為2 μM SIS3處理A549細胞(A)和HeLa細胞(B)后進行劃痕，0、24、48 h時拍照觀察細胞的遷移情況并進行統計學分析，DMSO處理組作為對照組。與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P < 0.001。圖4 Smad3抑制劑SIS3能夠有效抑制A549細胞和HeLa細胞的遷移Note. The above results indicate the inhibitor of Smad3, SIS3, significantly inhibits cell migration of A549 (A) and HeLa (B) cells;*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，compared with the normal group.Fig.4 The inhibitory effect of SIS3 on cell migration of A549 and HeLa cells

注：上圖為Western blot檢測A549細胞中Smad3抑制劑SIS3對Smad3活性(磷酸化)的抑制作用。圖3 Smad3抑制劑SIS3對Smad3活性的抑制效應Note. The above result shows the inhibitor of Smad3, SIS3, has significant inhibitory effect on Smad3 activity. Fig.3 The inhibitory effect of SIS3 on Smad3

2.3 敲低或過表達Smad3對A549和HeLa細胞遷移的影響

如圖5所示，與對照組相比，通過RNAi干擾技術敲低A549(圖5A)和HeLa(圖5B)細胞中內源的Smad3后，劃痕后0、24、48 h細胞遷移結果顯示，敲低Smad3明顯抑制細胞的遷移。相反，在A549(圖5A)和HeLa(圖5B)細胞中過表達Smad3，劃痕后0、24、48 h細胞遷移結果顯示，過表達Smad3明顯促進細胞遷移。以上結果表明，Smad3促進A549和HeLa細胞的遷移。

注：上圖分別為A549細胞(A)和HeLa細胞(B)中敲低或過表達Smad3后進行劃痕，0、24、48 h時拍照觀察細胞的遷移情況并進行統計學分析，Con組作為對照組。與對照組比較，*P< 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。圖5 敲低或過表達Smad3能夠明顯抑制或促進A549細胞和HeLa細胞的遷移Note. The above results show silencing of endogenous Smad3 or overexpression of Smad3 in A549 (A) or HeLa(B)cells can effectively inhibits or promotes cell migration;*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，compared with the normal group.Fig.5 Knockdown or overexpression of Smad3 inhibits or promotes cell migration

3 討論

癌癥是導致人類死亡的主要疾病之一，其中，約90%以上的癌癥患者死于癌細胞的轉移。近年來，人們對腫瘤形成的分子機制展開了大量的研究，為人類治療癌癥提供了多個潛在的治療靶點[9-11]。前期報道揭示，TGF-β與多種腫瘤的發展密切相關，包括神經膠質瘤、乳腺癌等[12-14]。在正常的生理條件下，TGF-β信號能夠抑制上皮細胞的增殖，然而，在腫瘤的發展進程中，TGF-β則誘導腫瘤細胞的增殖、侵襲及血管生成[15,16]。Smad3是TGF-β信號通路中的一個重要分子，前期報道揭示，在乳腺癌晚期，Smad3異常活化，促進乳腺癌細胞的轉移[7,8]。SIS3作為Smad3的抑制劑，能夠抑制TGF-β1誘導的Smad3的磷酸化及Smad3-Smad4的相互作用，進而抑制相關基因的轉錄[17]。本研究通過過表達、敲低Smad3或利用SIS3處理A549和HeLa細胞抑制內源Smad3的活性，然后檢測細胞遷移能力的變化，從而闡明Smad3對非小細胞肺癌和宮頸癌細胞遷移的影響，結果顯示，Smad3促進A549和HeLa細胞的遷移。Smad3調控細胞遷移的詳細作用機制有待深入研究。

綜上所述，結合前期相關報道，我們發現，Smad3不僅能夠促進乳腺癌細胞的遷移，也能促進非小細胞肺癌和宮頸癌細胞的遷移。這提示，在人類多種腫瘤類型中，Smad3促進腫瘤細胞的遷移具有一定的普遍性。因此，后續靶向Smad3活性抑制藥物的開發將具有很大的臨床應用前景，也為腫瘤治療提供新的途徑。

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Effect of Smad3 on cell migration of A549 and HeLa cells

WEI Rong-fei, LI Meng-yuan, YANG Xing-jiu, ZHU Rui-min, XU Da-mo, GAO Ran*

(Institute of Laboratory Animal Science, Chinese Academy of Medical Sciences &Comparative Medical Center, Peking Union Medical College, Beijing 100021，China)

Objective To investigate the effect of Smad3 on cell migration of A549 and HeLa cells. Methods Primers for pCMV-Myc-Smad3 plasmid construction and siRNA targeting Smad3 were designed and synthesized. pCMV-Myc-Smad3 plasmid was constructed with molecular cloning techniques. Overexpression of Smad3 with Myc-tag or silencing of endogenous Smad3, and then scratch assay was used to detect the migration ability of A549 and HeLa cellsinvitro. Results pCMV-Myc-Smad3 plasmid was successfully constructed. Overexpression of Smad3 significantly up-regulated the migration rate of A549 and HeLa cells. Conversely, in the same cells, silencing of endogenous Smad3 or treatment with Smad3 inhibitor, SIS3, down-regulated the migration rate. Conclusions Smad3 promotes cell migration of A549 and HeLa cells.

Smad3; Overexpression vector; RNAi; SIS3; Cell migration

協和青年基金資助，中央高校基本科研業務費專項資金資助(3332016077)；中國醫學科學院醫學實驗動物研究所基本科研業務費專項資助(2016ZX310033)；北京市優秀人才培養項目(2015000020124G073)。

韋榮飛(1990-)，女，助理研究員，研究方向：免疫與腫瘤。E-mail: weirongfei2010@163.com

高苒(1980-)，女，副研究員，研究方向：腫瘤學、免疫學。E-mail: E-mail: gaoran26@hotmail.com

研究報告

R-332

A

1671-7856(2017) 01-0011-05

10.3969.j.issn.1671-7856.2017.01.003

2016-06-14