厄洛替尼引起皮膚不良反應的小鼠模型建立

宋亞中，徐央波，鄧 博， 崔慧娟*，彭艷梅，劉戴維，王塏涵， 劉 凡，段 樺，邱鈺芹，李 嬙

(1.北京中醫藥大學，北京 100029；2.中日友好醫院，北京 100029)

厄洛替尼引起皮膚不良反應的小鼠模型建立

宋亞中1，徐央波1，鄧 博2， 崔慧娟2*，彭艷梅1，劉戴維1，王塏涵1， 劉 凡1，段 樺1，邱鈺芹1，李 嬙1

(1.北京中醫藥大學，北京 100029；2.中日友好醫院，北京 100029)

目的 厄洛替尼(商品名：特羅凱)是治療非小細胞肺癌的一種新型靶向藥物，近些年來臨床應用甚廣，但副作用較多，其中以皮疹最為多見，且最令患者難以接受。本研究旨在觀察應用特羅凱前后小鼠在表皮、病理、免疫組化等方面的改變，復制特羅凱所致皮疹的動物模型,為臨床外用藥物治療皮疹提供模型。方法 使用BALB/c雌性小鼠 20只，隨機分成4組。實驗組(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組)用濃度為10 g/L的特羅凱溶液按100 mg/kg灌胃，對照組(Ⅰ組)以等體積去離子水灌胃，每天1次。于給藥前24 h在小鼠頭頸、背、腰處脫毛,實驗結束后剪取頸部、背部、腰部皮膚并觀察實驗組、對照組小鼠在肉眼皮膚、病理切片、免疫組化等方面的改變。結果 (1)四組小鼠之間在毛發再生天數、毛發完全再生天數、脫屑時間、出現皮疹時間、毛孔擴張數等5方面的差異存在統計學意義(P< 0.01或P< 0.05)；(2)Ki67：四組間差異無統計學意義(P> 0.05)。結論 (1)此次實驗印證了許多研究者關于“EGFRIs導致的皮疹為一種炎癥反應”的觀點；(2)該皮疹模型可靠實用，具有可重復性，適用于“EGFRIs所致皮疹動物模型”的大批建立，可推廣以供臨床、試驗、研究所用。

厄洛替尼；皮疹；皮膚；病理；免疫組化

肺癌的死亡率占全球腫瘤相關死亡的首位，而非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占肺癌總數的 80%～85%，目前的治療主要包括手術、化療、放療、分子靶向治療及生物免疫治療等[1]。分子靶向藥物主要為表皮生長因子受體抑制劑(epidermal growth factor receptor inhibitors,EGFRIs),包括單克隆抗體和EGFR酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor,TKI)等，其中TKI類藥物使用范圍甚廣。厄洛替尼(商品名：特羅凱)、吉非替尼(商品名：易瑞沙)是較早在中國上市的TKI類藥物,也是表皮生長因子受體抑制劑(Epidermal growth factor receptor inhibitors EGFRIs)的代表藥物。但其諸多不良反應不容忽視。50%以上接受治療的患者會發生皮膚毒性[2]。其中，痤瘡樣皮疹是最常見的EGFRIs皮膚毒性反應[3]。雖然Perez-Soler R等[4]認為：出現皮疹的患者(75%)的生存期顯著優于未出現皮疹的患者，且一項Meta分析也顯示：患者皮疹越嚴重，療效會越好[5]。但皮疹會繼發瘙癢、疼痛、皮膚受損等不適癥狀，嚴重影響患者生活質量，甚至有些患者因此而停藥，影響靶向藥物的繼續治療。所以如何減少或治療靶向藥所致的皮疹等皮膚不良反應，是臨床亟待解決的問題。目前仍缺乏行之有效、機制明確的應對藥物，因此本實驗望有效復制EGFRIs類藥物所致的皮疹動物模型，為臨床盡早研發治療此類皮疹的藥物提供動物模型基礎。鑒于目前主要的TKI類藥物為特羅凱、易瑞沙等，且二者的抗瘤機制基本相同，主要通過抑制多種上皮細胞腫瘤中過度表達的EGFR受體來抑制腫瘤增殖、血管生成、轉移來促進腫瘤細胞凋亡[6]，而特羅凱導致的皮疹等不良反應均高于易瑞沙[7]，所以本實驗將特羅凱定為實驗用藥。

1 材料和方法

1.1 動物實驗基礎

參考David Surguladze等[8]在2009年報道的方法進行了模型復制，2013年4月至2015年1月進行了以下動物實驗研究。

1.2 實驗動物

SPF級BALB/c雌性小鼠20只,5周齡，體重17～23 g，購自北京維通利華實驗動物公司[SCXK(京)2012-0001]。飼養、無菌手術環境為中日友好醫院SPF動物房[SYXK(京)2008-0019]。溫度為20～26℃，相對濕度為50%～60%，并按照實驗動物的3R原則給予人道關懷。

1.3 藥物和試劑

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組

將BALB/c雌性小鼠按隨機法分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4組，每組5只。

1.4.2 飼養

將特羅凱片用滅菌去離子水配置成10 g/L的溶液，按100 mg/kg對實驗組(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組)進行灌胃，每天1次；對照組(Ⅰ組)用等體積去離子水按100 mg/kg每天灌胃。

1.4.3 取材

于給藥前24 h 對每只小鼠頭頸、背、腰等處進行脫毛。Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組小鼠分別于連續灌胃21 d、7 d、14 d、21 d后取頸部、背部、腰部等處皮膚。

1.5 主要檢測指標

當采用集中外售的方式時，由于需要用車輛進行運輸，增加了運輸成本，且外售需委托有資質的固廢處置公司進行處理，需交付一定處置費用，這無疑給公司帶來了一定的處置成本；當采用回爐處理時，由于砷濾餅含硫較高，會造成放熱，影響爐溫、渣溫以及煙氣溫度，而且會使閃速爐的冰銅品位有小范圍的波動，與此同時，回爐處理時，造成砷的循環，致使廢酸中砷含量增長較快。

1.5.1 皮膚肉眼改變

實驗開始后每日觀測小鼠日?；顒忧闆r及皮毛改變。包括：背部剃毛部位紅腫、皮疹和鼠毛重新生長、鼠毛質地等情況；未剃毛部位鼠毛卷曲、脫落等情況。

1.5.2 皮膚病理改變

四組小鼠(共20只)分別取材后，蘇木精-伊紅(HE)染色及油紅O染色觀察頸、肩背、腰部皮膚組織。包括毛囊擴張、堵塞，嗜中性膿液簇等情況。

1.5.3 免疫組化檢測Ki67

標本經4%甲醛溶液固定> 6 h，脫水、石蠟包埋，采用免疫組化法檢測Ki67的表達。參考Olaussen KA等[9]的方法,根據染色程度和染色細胞百分數進行評判。已知陽性的乳腺癌組織切片作為陽性對照，以磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照。Ki67陽性染色定位于細胞核，隨機計數5個高倍視野的陽性細胞百分比，以其平均值作為評定依據。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 皮膚肉眼改變

觀察發現：對照組(Ⅰ組)小鼠剃毛后鼠毛生長較快，在2周時完全恢復，頸、肩部未出現皮疹。實驗組(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組)小鼠平均第4天見皮膚脫屑，第8天可見背部散在紅色皮疹，第13天皮疹消失，毛發生長緩慢，3周時仍未完全恢復(參見圖1)。與文獻報道[8，10]相符。四組小鼠在毛發再生天數(其中Ⅱ與Ⅳ差異顯著(P < 0.01))、毛發完全再生天數(其中Ⅱ與Ⅳ、Ⅲ與Ⅳ P < 0.05)、出現脫屑時間(其中：Ⅰ與Ⅱ、Ⅰ與Ⅲ P < 0.05)、出現皮疹時間(其中，Ⅰ與Ⅲ、Ⅰ與Ⅳ P < 0.05)等四個方面有差異，總體上有統計學意義(P < 0.05或P < 0.01)(參見表1)

2.2 皮膚病理改變結果

與對照組相比，實驗組蘇木精-伊紅(HE)染色可見毛囊周圍中性粒細胞增多伴堵塞、膿樣嗜中性粒細胞在毛囊管外面集群所致的毛囊炎癥(參見圖2D、d)。與文獻報道[8，11，12]相符。

與對照組相比，實驗組油紅O染色可見擴張、膨脹的的卵泡明顯增多(參見圖2E、e)。與文獻報道[8，11，12]相符。毛孔擴張數：四組間有差異，總體上有統計學意義(P < 0.01)(其中：Ⅰ與Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ差異顯著 P < 0.01)(參見表2)。

2.3 免疫組化檢測Ki67

Ki67：實驗組Ki67稍高于對照組[13，14](參見圖2F、f)。四組間無明顯差異，無統計學意義(P > 0.05)(參見表2)。

3 討論

EGFRIs所致皮膚毒性反應眾多，其中痤瘡樣皮疹最為常見、嚴重。其機制尚未明確，目前相關研究如下：LacoutureME等[15]認為厄洛替尼(特羅凱)所致皮疹病理表現可分成4個階段：(1)皮紅腫和皮膚敏感性增加；(2)炎性細胞因子分泌和局部浸潤；(3)T淋巴細胞增多的丘疹膿皰；(4)硬皮癥。病理表現主要為：(1)表皮炎性細胞浸潤并包繞過度角化和擴張的毛囊管；(2)表皮層化膿性毛囊炎伴上皮細胞層破裂。LenzHJ等[16]通過皮疹活檢發現：病理多表現為毛囊周圍炎和化膿性毛囊炎。錢軍等[17]通過對患者皮膚組織活檢發現 ,EGFRI相關皮疹表現為真皮上層、卵泡破裂層和上皮棘層松解層的一種混合性炎性反應。CunninghamD等[18]認為：EGFRI引起基底角質細胞生長停滯和過早成熟分化，并伴有中性粒細胞的釋放。LacoutureME等[19]認為中性粒細胞釋放的某些酶導致角質細胞凋亡，凋亡的細胞積聚在真皮下導致皮膚進一步的損傷, 最終形成觸痛、丘疹膿皰和甲溝炎。Guttman-YasskyE等[20]在EGFRI患者的皮膚組織中檢測到單核細胞，樹突狀細胞，巨噬細胞，T淋巴細胞的浸潤，提示EGFRIs相關的皮疹最終可能與炎癥相關。

此次實驗用鼠為BALB/c雌性小鼠，主要考慮雄性小鼠之間通常有打斗、抓撓，不易于飼養、管理，且易出現抓痕等難于與皮疹等皮膚不良反應相鑒別，而雌性小鼠則較少出現上述現象，故本次實驗暫用雌性小鼠，但我們將在后續研究中進一步比較探究不同性別小鼠的實驗結果。實驗組用藥后在表皮出現毛發生長緩慢甚至脫落、脫屑、紅疹等，在病理上表現為毛囊周圍中性粒細胞群集伴堵塞而形成的毛囊炎、毛囊擴張，且對照組、實驗組之間在毛發再生天數、毛發完全再生天數、脫屑時間、出現皮疹時間、毛孔擴張數等5方面的差異存在統計學意義(P < 0.01或P < 0.05)，結合上述研究，本實驗用濃度為10g/L的特羅凱溶液按100mg/kg對小鼠灌胃致其出現皮疹等不良反應，此模型在表皮組織、病理切片上的表現與DavidSurguladze等的文獻報道基本相符，且可靠實用、具有可重復性，提示“EGFRIs所致皮疹”的動物模型建立基本成功，同時也印證了許多研究者關于“EGFRIs導致的皮疹為一種炎癥反應”的觀點。但四組小鼠在Ki67測試方面無統計學意義(P > 0.05)。結合既往研究：

表1 四組小鼠用特羅凱(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組)、去離子水(Ⅰ組)干預前后毛發、皮膚變化出現的時間(±s，n=5)

注：與對照組(Ⅰ組)相比,*P< 0.05；與實驗組(Ⅳ組)相比：△P< 0.05,■P< 0.01。

Note. Compared with control group(Ⅰ組)，*P< 0.05. Compared with experimental group(Ⅳ組)，△P< 0.05,■P< 0.01.

注：(A)對照7 d組；(B)對照12 d組；(C)對照16 d組；(a)實驗7 d組；(b)實驗12 d組；(c)實驗16 d組圖1 對照組和實驗組小鼠在毛發和皮膚的變化Note.(A)Control group at 7 days.(B)Control group at 12 days.(C)Control group at 16 days.(a)Experimantal group at 7 days.(b)Experimantal group at 12 days.(c)Experimantal group at 16 days.Fig.1 Control group and experimantal group mice′s change in hairs and skins

注：(D)對照組；(d)實驗組(HE染色,×100)。(E)對照組；(e)實驗組(油紅O染色，×100)。(F)對照組；(f)實驗組(免疫組化，×40)。圖2 對照組、實驗組小鼠皮膚組織在病理切片和免疫組化等方面的變化Note.(D)Control group.(d)Experimantal group ( HE staining，×100).(E)Control group.(e)Experimantal group( Oil Red O staining，×100).(F)Control group.(f)Experimantal group( Immunohistochemical staining，×40).Fig.3 Pathological and immunohistochemical changes of the skin tissue of mice in control group and experimantal group

組別Groups毛囊擴張ThenumberofporeexpansionKi67Ⅰ組ⅠGroup220±084025±014Ⅱ組ⅡGroup1940±152#025±061Ⅲ組ⅢGroup2080±148#026±002Ⅳ組ⅣGroup2280±228#026±006

注：與對照組(Ⅰ組)相比#P< 0.01。

Note. Compared with control group(Ⅰ組)，#P< 0.01.

Mario.E在2006年闡明：基底層中角質形成細胞的EGFR受抑制會導致生長受限和過早分化，表現為細胞核相關抗原(Ki67)下調。吳萍等[13]的研究也表明：EGFR和Ki67在腫瘤發生、發展過程中呈協同作用。正常表皮中Ki67僅在基底層有弱陽性表達[14]，該指標可以反應皮膚角質形成細胞的增殖是否受到影響。Ki67表達于所有活躍的細胞周期階段，并隨細胞周期改變[21]。Ki67單克隆抗體只標記G1后期、S期和G2期、M期細胞核抗原，且Ki67抗原半衰期短，這些特點使Ki67 成為優質的細胞增殖標記物[22]。此次動物實驗并未得出特羅凱用藥前后Ki67有統計學上的差異，可能與樣本量稍小、小鼠取材前剃毛等因素存在相關性，抑或二者之間本無聯系，臨床有待進一步研究及驗證。

隨著靶向藥物在臨床中的應用逐漸增多，其導致的皮疹等不良反應在臨床中也越發常見。但目前我們對特羅凱等靶向藥物所致皮疹的原因、發病機制尚未明確，故無有效的、針對性強的藥物。本文參考國內外相關文獻，復制TKI類藥物所致的皮疹動物模型，并通過觀察小鼠用特羅凱前后在肉眼皮膚、病理切片、免疫組化等方面的改變對其進行驗證，同時，進一步探討了特羅凱的發病機制，為評價外用藥、特別是中成藥的有效性及作用機理提供動物模型。

(致謝：本實驗由中日友好醫院提供實驗室、資金及設備，在此向中日友好醫院表示感謝。并向提供部分資金資助的北京市科學技術委員會表示感謝。感謝導師崔慧娟教授的悉心指導，感謝鄧博、徐央波、彭艷梅師姐及其他同門在實驗過程中的幫助)

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The establishment of mouse model of Erlotinib-induced skin adverse reactions

SONG Ya-zhong1, XU Yang-bo1, DENG Bo2, CUI Hui-juan2*, PENG Yan-mei1, LIU Dai-wei1, WANG Kai-han1,LIU Fan1,DUAN Hua1,QIU Yu-qin1,LI Qiang1

(1.Beijing University Of Chinese Medicine，Beijing 100029，China；2.China-Japan Friendship Hospital，Beijing 100029，China)

Objective Erlotinib (Trade Name: Tarceva) is a new targeted drug for the treatment of non-small cell lung cancer (NSCLC) that has a wide clinical application in recent years, but commonly carries many side effects, among which the most common and unbearable one is rash. The aim of this study is to observe the changes of epidermis, pathology, immunohistochemistry and other aspects before and after the application of Tarceva in mice and try to copy the rash animal models caused by Tarceva and thus to provide models for the clinical topical medications of rash. Methods 20BALB/c female mice were randomly divided into four groups.The experimental group(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ group) was given 100 mg/kg dosage with the concentration of 10 g/L erlotinib solution by gavage, and the control group (I group)with an equal volume of deionized water by gavage once daily. The hairs from the head,neck and back of each mouse were removed 24 hours prior to the administration,and at the end of the experiment, clipping the skin in the neck, back and waist ,then observed differences between the experimental group and the control group in mice skin, biopsy, immunohistochemistry and the like. Results (1)There were statistically significance (P< 0.01 orP< 0.05) in the four groups of mice in five aspects as hair regrowth days, days of the complete regrowth of hair, desquamation time , the time of appearance of rash and the number of pore expansion；(2)Ki67:There were no statistically significant differences among the four groups(P> 0.05).Conclusions (1)This experiment confirms many researchers’ point of view that “the rash induced by EGFRIs is an inflammatory response”(2)A mouse model of rash induced by FGFRIs is successfully established，and this is a reliable，practical and reproducible model which applies to a large number of establishment of "EGFRIs drug-induced rash in animal models",and can be popularized for clinical,experimental and institutional uses.

Erlotinib；Rash；Skin；Pathology；Immunohistochemistry

中日友好醫院院內課題(2013-MS-42)；北京市科技計劃首都臨床特色應用研究專項(Z151100004015168)。

宋亞中(1989-)，男，碩士研究生，專業：中西醫結合腫瘤內科。E-mail：18800100355@163.com

崔慧娟(1963-)，女，教授，博士生導師，研究方向：中西醫結合腫瘤內科及靶向藥物所致皮疹等不良反應。E-mail： cuihj1963@163.com

研究報告

R-332

A

1671-7856(2017) 01-0016-06

10.3969.j.issn.1671-7856.2017.01.004

2016-06-13