不同時間點不同應激方法致大鼠焦慮樣行為的研究

趙洪慶，韓遠山，杜 青，楊 琴，王宇紅*，楊 蕙，孟 盼

(1. 湖南中醫藥大學，湖南省中藥粉體與創新藥物省部共建國家重點實驗室培育基地，長沙 410208； 2. 湖南中醫藥大學第一附屬醫院，長沙 410007)

不同時間點不同應激方法致大鼠焦慮樣行為的研究

趙洪慶1，韓遠山2，杜 青1，楊 琴2，王宇紅1*，楊 蕙2，孟 盼1

(1. 湖南中醫藥大學，湖南省中藥粉體與創新藥物省部共建國家重點實驗室培育基地，長沙 410208； 2. 湖南中醫藥大學第一附屬醫院，長沙 410007)

目的 從不同時間點比較幾種不同的應激方法建立焦慮大鼠模型的生物學特點，為尋找最合適的造模方法提供實驗依據。方法 70只大鼠隨機分為正常組、空瓶應激組、慢性情緒應激(chronic emotional stress, CES)組、束縛應激3 h組、束縛應激6 h組，分別進行造模，于實驗第7 d、14 d、21 d分別采用高架十字迷宮和場景恐懼測試測定大鼠的焦慮樣行為，曠場測試考察大鼠的焦慮或抑郁樣行為，強迫游泳實驗測定大鼠的抑郁樣行為，采用Elisa試劑盒檢測大鼠海馬組織中5-HT、DA含量。結果 焦慮樣行為學測試結果表明，第14天起，空瓶應激組、CES組、束縛應激6 h組大鼠開始產生焦慮樣行為，此后焦慮樣行為愈發明顯，強迫游泳實驗結果表明，束縛6 h組大鼠的不動時間于第7 d起即顯著增加(P< 0.05)。同時，與正常大鼠比較，空瓶應激組和CES組大鼠海馬5-HT、DA含量于第14天開始顯著上升(P< 0.05或P< 0.01)。結論 在上述幾種焦慮模型中，束縛應激3 h焦慮樣行為不明顯；束縛應激6 h可能由于應激時間過長，表現出抑郁樣行為?？掌繎ず虲ES能成功建立焦慮大鼠模型，且其焦慮行為表征有一定差異，可根據不同的實驗目的選擇對應的模型方法。

焦慮模型；空瓶應激；慢性情緒應激；慢性束縛應激

焦慮癥是以焦慮為主要特征的神經癥，臨床表現為沒有事實根據也無明確客觀對象的緊張擔心、恐懼不安等情緒。隨著人們工作和生活節奏的加快，焦慮癥的發病率呈明顯上升趨勢，已成為世界性的公共衛生問題。流行病學調查顯示，焦慮癥的終生患病率為5%，而用于該病的費用約占精神類疾病支出總費用的30%[1]。對焦慮癥發病機制的研究已成為目前醫學關注的熱點，而尋找一種客觀、規范、重復性好的動物模型，是研究疾病的重要基礎。目前，建立焦慮動物模型多采用慢性心理應激的方法，主要包括不確定性空瓶飲水應激、慢性情緒應激(chronic emotional stress, CES)、慢性束縛應激三大類[2]。本研究旨在建立上述三類焦慮動物模型，并基于不同時間點，從動物行為學到腦內單胺遞質含量進行比較研究，尋找最合適的焦慮動物應激模型。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠70只，雄性，200～220 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[SCXK(湘)2013-0004]，飼養于湖南中醫藥大學第一附屬醫院SPF級實驗動物中心[SYXK(湘)2015-0003]。大鼠購入后先適應性飼養5 d，實驗期間大鼠均在室溫(24±2)℃、相對濕度(50±5) %環境下喂養。并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。

1.2 試劑與儀器

大鼠5-HT、DA酶聯免疫分析(Elisa)試劑盒購自Sigma公司；DL-1高架十字迷宮購自長沙肯基科技發展有限公司；5417R低溫高速離心機購自Eppendorf公司；MultiskanMK3型酶標儀購自Thermo公司；斯金納箱購自Panlab公司；大鼠束縛器購自安徽正華生物儀器公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組與造模

70只SD大鼠共分為5個組，包括正常組、空瓶應激組、CES組、束縛應激3 h組，束縛應激6 h組，每組14只。除正常組外，各模型組均按各自造模方法進行造模(具體造模方法如下)，分別于實驗第7 d、14 d、21 d進行行為學測試，并于行為學測試完成后麻醉部分大鼠，斷頭取腦，在冰盤上迅速剝離雙側海馬，液氮中速凍保存，待測單胺類遞質5-HT、DA含量。

空瓶應激組：采用不確定性空瓶飲水應激模型，進行定時喂水訓練7 d。定時喂水訓練為每日2次，時間分別為8:00～8:10和18:00～18:10，此兩個時間段內給動物飲水，其他時間不再給水。7 d后開始進行應激實驗，在上述兩個時間段內隨機選取一個作為空瓶應激時間點，給動物以空水瓶誘發其情緒應激，另一個時間段給動物飲水[3]。

CES組：采用慢性應激的方法，動物每籠4只，應激方法包括光照或黑暗24 h，擁擠24 h，孤養24 h，每天下午3:00～6:00禁食或禁水1 h，電擊(20次，持續5 s，10 mA，間隔30 s)，45°傾籠24 h，每天采用1種應激，同種應激不連續出現[4]。

慢性束縛應激3 h組：將動物束縛于特制的束縛器上，每日上午束縛1次，每次3 h[5]。

慢性束縛應激6 h組：將動物束縛于特制的束縛器上，每天9:00～15:00進行束縛，共6 h[6]。

1.3.2 高架十字迷宮實驗

將大鼠放入迷宮的中央平臺處，使其頭部正對封閉臂，釋放后記錄以下指標：① 進入開放臂次數(OE)；② 進入封閉臂次數(CE)③ 進入開放臂時間(OT)；④ 進入封閉臂時間(CT)。由上述指標計算出：① 進入開放臂的比例(OE%)：OE/(OE+CE)×100%；② 開放臂停留時間比例(OT%)：OT/(OT+CT)×100%。每只大鼠測試5 min。

1.3.3 曠場測試

將大鼠放入到一個長寬高為80 cm×80 cm×40 cm的黑色敞箱中，敞箱底面平均劃分為25個小方格。實驗前30 min將待測大鼠放入測試房間，大鼠從敞箱中央放入，觀察記錄大鼠4 min內水平運動格數以及垂直豎立次數，計算水平和垂直得分的總和。

1.3.4 場景恐懼測試

測試前1 d對大鼠進行訓練，大鼠在斯金納箱適應2 min后，給予30 s的噪音(5 kHz, 75 dB)，在噪音結束最后2 s同時給予電擊(50 V)，大鼠繼續呆在箱內30 s，然后取出放回籠內，24 h后進行測試，將大鼠放入斯金納箱，2 min后給予60 s的噪音，記錄60 s內大鼠的不動(freezing)時間百分比[7]。

1.3.5 強迫游泳實驗

將大鼠放入高、直徑為50 cm×20 cm的圓柱形水缸中，水深約40 cm，水溫保持在(25±2)℃。實驗開始后1 min為適應時間，適應結束后記錄5 min內大鼠的不動時間(大鼠兩前爪停止游動，身體呈漂浮狀態記為不動)。

1.3.6 Elisa檢測

試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附試驗。往預先包被5-HT、DA抗體的微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經過溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺與腦內單胺遞質含量呈正相關。用酶標儀在450 nm波長下測定光密度值。

1.4 統計學方法

使用SPSS 16.0軟件對數據進行統計，實驗數據以均數±標準差(±s)表示。組間差異比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊時采用LSD檢驗法，方差不齊時采用Dunnett’s T3進行兩兩比較，P< 0.05表示有統計學意義。

2 結果

2.1 高架十字迷宮實驗結果

結果見表1。從第14天開始，空瓶應激組、CES組、束縛應激6 h組大鼠的OE%值、OT%值均顯著下降，差異都統計學意義(P< 0.01或P< 0.05)。其中，CES組大鼠在開臂中的次數及停留時間均明顯比其他組少，大鼠爬到封閉臂后即進入不動狀態。

2.2 曠場測試結果

結果見表2。與正常組比較，空瓶應激組、CES組、束縛應激6 h組大鼠的自主活動次數均在14 d開始顯著下降，其中，CES組下降的最為顯著，其活動次數類似于抑郁模型大鼠。此外，束縛應激3 h組大鼠活動次數有所下降，但結果無統計學意義。

表1 各組大鼠高架十字迷宮結果比較(±s，n=8, %)

注：與正常組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. Compared with control group，*P< 0.05，**P< 0.01.

表2 各組大鼠自主活動情況(±s，n=8, num)

Tab.2 Comparison of thelocomotor activity results in each group

表2 各組大鼠自主活動情況(±s，n=8, num)

組別Groups7d14d21d正常組Controlgroup817±16．2573±26．7520±16．3空瓶組Emptybottlegroup475±15．6265±12．1?246±9．3?CES組CESgroup820±21．834±1．5??31±0．8??束縛3h組3hrestraintgroup848±18．0447±22．8460±15．7束縛6h組6hrestraintgroup775±23．8378±19．8?177±10．8?

注：與正常組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. Compared with control group，*P< 0.05，**P< 0.01.

表3 各組大鼠場景恐懼freezing時間比(±s，n=8, %)

注：與正常組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. Compared with control group，*P< 0.05，**P< 0.01.

表4 各組大鼠強迫游泳不動時間比較(±s，n=8, s)

Tab.4 Comparison of immobile time in forced swimming testin each group

表4 各組大鼠強迫游泳不動時間比較(±s，n=8, s)

組別Groups7d14d21d正常組Controlgroup53±2．5105±2．1185±7．8空瓶組Emptybottlegroup100±2．185±3．4197±13．4CES組CESgroup95±2．5177±6．6216±9．3束縛3h組3hrestraintgroup81±3．0183±7．7190±13．5束縛6h組6hrestraintgroup147±7．5?416±11．9??620±25．6??

注：與正常組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. Compared with control group，*P< 0.05，**P< 0.01.

表5 各組大鼠腦海馬組織5-HT、DA含量(±s, n=6, pg/mg)

注：與正常組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. Compared with control group，*P< 0.05，**P< 0.01.

2.3 場景恐懼測試結果

結果見表3。與正常組比較，各模型組大鼠從第14天開始freezing時間顯著增加，并且趨于穩定。各模型組之間freezing時間差別不大，無統計意義。

2.4 強迫游泳實驗結果

結果見表4。與正常組比較，束縛應激6 h組大鼠從第7天開始不動時間顯著增加，并隨著造模時間的增加，不動時間增加。其余組與正常組比較均無統計學意義，表明該組大鼠無明顯的抑郁樣行為。

2.5 Elisa檢測結果

結果見表5。與正常組比較，21 d時空瓶應激組和CES組大鼠腦海馬組織5-HT、DA含量明顯上升，其中CES組上升最為顯著。同時，與正常組比較，束縛應激3 h和6 h組大鼠腦內的5-HT、DA含量與正常組差別不大，其中束縛應激6 h組5-HT、DA含量均有逐漸下降趨勢。

3 討論

慢性應激是焦慮抑郁等情緒疾病的重要發病因素之一，也是建立情緒類疾病動物模型的常用方法。本實驗通過對比分析三類不同的焦慮動物模型應激方法，通過不同時間點摸索各應激模型的特點，從動物行為學及腦內神經遞質改變兩方面，尋找一種模擬臨床疾病特征的焦慮動物模型。

高架十字迷宮是以動物在新環境下的探究特性和對高懸空曠環境的恐懼特性之間形成的矛盾心理來模仿人類的焦慮狀態，是經典的動物焦慮行為測試儀器。本實驗研究發現，除束縛3 h組外，各模型組自14 d開始OE%、OT%值顯著下降，顯示各組動物均表現出明顯的焦慮行為。場景恐懼測試是用于研究嚙齒類動物環境相關條件性恐懼的實驗。嚙齒類動物在恐懼時會表現出特有的不動狀態(freezing)，保持靜止不動的防御姿勢，常用于研究焦慮樣行為[8]。本實驗研究發現，與正常組比較，各焦慮模型組的freezing時間均顯著上升。巧合的是，和高架十字迷宮測試結果類似，CES組大鼠的freezing時間也是各模型組中最長的，說明此兩種焦慮樣行為測試結果可能具有一定的關聯性。

曠場實驗是評價實驗動物在新異環境中自主行為、探究行為與緊張度的一種常用行為學方法，常用于檢測實驗動物的焦慮或抑郁樣行為[9]。本實驗研究發現，相比于正常組，空瓶應激組、CES組、束縛應激3 h和6 h組大鼠的自主活動次數均下降，與文獻報道相符合[10]。然而，令人驚奇的發現是CES組大鼠在第14、21天的測試中都是直接躲到敞箱角落不動，與以往課題組研究的抑郁大鼠表現相類似，而該組大鼠在籠內時十分活潑，強迫游泳實驗結果也表明，在絕望狀態下該組大鼠的不動時間很短，與正常組無差異，說明無明顯抑郁樣行為。為了探索大鼠的這一行為，將籠內其余大鼠放入敞箱，發現原來躲在角落的大鼠開始有探索行為，并最終四只大鼠各占據敞箱一角。經查閱書籍文獻并聯系其他行為學結果，本課題組確定該行為也屬于焦慮障礙的一種，急性焦慮或者稱之為驚恐障礙，表現出反復強烈的驚恐狀態。

強迫游泳實驗是使動物處于絕望狀態，是最常用的研究動物抑郁樣行為的測試方法，廣泛用于抗抑郁藥物的研究[11]。根據本實驗結果，除慢性束縛應激6 h外，其余組與正常組比較，無統計學意義，說明其余模型組動物并不表現出抑郁樣行為。綜合行為學結果發現，束縛應激6 h能同時誘導出焦慮和抑郁樣行為，而焦慮和抑郁是關聯性很強的兩種疾病，因此應激造模過程中可能由焦慮逐漸向抑郁行為過渡，兩種疾病伴隨著發生。然而，由于表現出抑郁行為，因此束縛應激6 h不能作為焦慮動物模型的最優選擇。

單胺神經遞質假說是關于焦慮癥發病機制的一種經典假說，假說認為，單胺類神經遞質的改變在焦慮癥的發病過程中起著關鍵作用[12]。研究表明，焦慮癥患者及焦慮模型大鼠都存在腦內單胺遞質含量升高的現象[13-14]。本實驗觀察的單胺類神經遞質5-HT、DA均是與焦慮發生有密切關系的神經遞質。實驗結果表明，與正常組比較，21 d時空瓶應激組大鼠海馬5-HT、DA含量顯著升高，CES組則從第14天起即顯著上升，而慢性束縛3 h和6 h組并未有明顯的改變，甚至還有下降的趨勢。此外，本實驗發現在各模型組中，CES組單胺遞質含量上升最為顯著，表明在驚恐狀態下腦內單胺遞質可能會有明顯的上升，該結論需要進一步的研究驗證。

綜上所述，本實驗研究發現，在幾種常用的慢性應激焦慮模型方法中，空瓶應激和CES均能成功建立焦慮模型，其中空瓶應激建立焦慮模型時程以21 d最佳，CES模型則以14 d為最佳。

[1] Weisberg RB.Overview of generalized anxiety disorder：epidemiology, presentation, and course[J].J Clin Psychiatry, 2009,70 (6):4-10.

[2] 楊超, 豐廣魁. 焦慮動物模型造模方法述評[J]. 廣州中醫藥大學學報, 2015, 32(11):1135-1138.

[3] 董寧, 唐啟盛, 趙瑞珍, 等.疏肝清熱健脾法對廣泛性焦慮大鼠腦內bax、bcl-2 表達的影響[J]. 北京中醫藥大學學報, 2015, 38(6):383-387.

[4] Golkar,Armita1,Johansson,etal.The Influence of Work-Related Chronic Stress on the Regulation of Emotion and on Functional Connectivity in the Brain[J].PLoS ONE,2014,9(9):1-11.

[5] 趙宏波, 白曉暉,李曉娟. 逍遙散治療慢性束縛應激焦慮模型大鼠行為學評價[J]. 中華中醫藥雜志,2014,29(5):1669-1673.

[6] 張俊芳,張忠敏,趙鑫,等. 磷酸二酯酶4 抑制劑咯利普蘭逆轉慢性束縛應激誘導的大鼠抑郁和焦慮樣行為[J]. 中國病理生理雜志,2012,28(10):1729-1739.

[7] Catherine S John,Elizabeth I Sypek,William A,etal.Blockade of the GLT-1 Transporter in the Central Nucleus of the Amygdala Induces Both Anxiety and Depressive-Like Symptoms[J].Neuropsychopharmacology,2015,40(7):1700-1708.

[8] 陳偉海,喬婧,楊瑜. 情景變換誘發已消退恐懼記憶重現的神經環路[J]. 心理科學進展,2014,22(10):1585-1596.

[9] Valentina Gigliuccia,Shane Gormleya,Sinead Gibney,etal.Characterisation of the antidepressant properties of nitric oxide synthase inhibitors in the olfactory bulbectomised rat model of depression[J]. Eur Neuropsychopharmacol,2014,24(8):1349-1361.[10] 孫世光,李子峰,劉健,等. 昆明小鼠焦慮與抑郁動物模型相關性研究:明暗箱實驗與懸尾實驗[J]. 中國藥理學通報,2012,28(2):289-293.

[11] 孫秀萍,李騰飛,石哲,等. 人參總皂苷和遠志總苷配伍對小鼠抗抑郁作用[J].中國比較醫學雜志,2012,22(6):30-36.

[12] 胡秦,劉新民.神經遞質與焦慮動物模型[J].中國比較醫學雜志,2006,16(10):635-638.

[13] 和昱辰,張波,瞿瑋,等.血清單胺類神經遞質及其代謝產物在重度抑郁癥及抑郁共病焦慮障礙診斷中的應用[J].中藥材,2014,36(8):806-810.

[14] 閆智勇,張天娥,彭佳,等.蜘蛛香對焦慮模型大鼠行為學及腦組織神經遞質含量的影響[J].中藥藥理與臨床, 2008,24(3):67-69.

Research of different methods of stress-induced anxiety-like behavior in rats at different time points

ZHAO Hong-qing1, HAN Yuan-shan2, DU Qing1, YANG Qin2,WANG Yu-hong1*, YANG Hui2, MENG Pan1

(1. Hunan University of Chinese Medicine, Training Bases, Hunan Key Laboratory of Chinese Materia Medica Powder and Innovative Drugs Established by Provincial and Ministry, Changsha 410208, China; 2.First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410007, China)

Objective To compare the biological characteristics of several different anxiety rat models established by different methods of stress at different time points and provide experimental basis for the most appropriate modeling methods. Methods 60 rats were randomly divided into normal, empty bottle stress, chronic emotional stress (CES) group, restraint stress for 3h, 6h, and modeling respectively. In the experimental 7 d, 14 d, 21 d, elevated plus maze and fear condition system was used to test anxiety-like behavior in rats, open field test to study anxiety or depression-like behavior, forced swimming test was used to detect depression-like behavior in rats, and using the Elisa test kit to detect the contents of 5-HT, DA in the hippocampus in rats. Results Anxiety-like behavioral test results showed that rats in empty bottle stress, CES, 6 h restraint stress group started to have anxiety-like behavior since 14 d, then anxiety-like behavior was becoming increasingly apparent. Forced swimming test results showed that immobility time in 6 h restraint rats was significantly increased in the first 7 d(P< 0.05). Meanwhile, compared with control group, hippocampal 5-HT, DA contents in empty bottle stress and CES rats increased significantly since 14 d. Conclusions Among several stress methods established anxiety model, anxiety-like behavior in 3 h restraint stress was not obvious; 6 h restraint stress exhibited a depression-like behavior in the forced swimming test might be due to prolonged stress. Empty bottle stress and CES can successfully establish the anxiety rat model, and the anxiety behavior of the rats have some differences. Corresponding model methods can be selected according to different experimental purposes.

Anxiety model; Empty bottle stress; Chronic emotional stress; Chronic restraint stress

湖南省科技廳重點項目(2015DK3003)；湖南省研究生創新課題(CX2016B371,2016CX14)。

趙洪慶(1992-)，男，碩士研究生，研究方向：中藥神經藥理。E-mail：516005398@qq.com

王宇紅(1965-)，女，博士生導師，研究方向：中藥神經藥理。E-mail：wyh107@126.com

研究報告

R-332

A

1671-7856(2017) 01-0022-05

10.3969.j.issn.1671-7856.2017.01.005

2016-06-15