補腎養血方對卵巢早衰大鼠中抗苗勒氏管激素的影響

姬 霞,傅金英,王冰玉,胡俊攀

(河南省中醫院，河南中醫藥大學第二附屬醫院婦產科，鄭州 450002)

補腎養血方對卵巢早衰大鼠中抗苗勒氏管激素的影響

姬 霞,傅金英*,王冰玉,胡俊攀

(河南省中醫院，河南中醫藥大學第二附屬醫院婦產科，鄭州 450002)

目的 建立雷公藤多苷致卵巢早衰大鼠的模型，研究補腎養血方對卵巢早衰大鼠中抗苗勒管素(anti-mullerian hormone, AMH)的影響。 方法 使用雷公藤多苷建立卵巢早衰大鼠模型，造模成功后，分別采用高，中，低劑量補腎養血方對大鼠灌胃，每日一次，共30 d。給藥完畢后于顯微鏡下觀察各組大鼠卵巢組織形態。酶聯免疫吸附法、免疫組化染色法和定量反轉錄聚合酶連鎖反應(qRT-PCR)分別檢測大鼠血清中AMH含量以及卵巢內AMH的蛋白和mRNA表達水平。結果 組織形態學顯示高中低劑量組的卵泡和黃體的生長均比模型組好；酶聯免疫吸附法、免疫組化和qRT-PCR結果顯示補腎養血方呈劑量依賴性逆轉雷公藤多苷導致大鼠血清中AMH濃度以及卵巢中AMH 表達水平的降低。 結論 補腎養血方可逆轉雷公藤多苷引起卵巢中AMH水平降低，提示補腎養血方具有防止卵巢早衰的功效。

補腎養血方; 卵巢早衰; AMH

卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)是一種多因素導致的卵巢功能提前減退的癥狀，指女性在40歲以前出現持續閉經，不育，伴隨雌激素降低，卵泡雌激素(follicle stimulating hormone，FSH)和黃體生成素(luteinizing hormone，LH)升高的一種疾病[1]。卵巢早衰是婦科分泌領域的常見病，常出現癥狀：臉色潮紅，性欲低下，午后潮熱多汗，皮膚暗黃長斑等。對女性的身心產生嚴重影響[2]。有學者認為腎陰不足、天葵虧耗、任沖二脈受損是卵巢早衰的主要病機[3]。通過補腎，陰陽調和，能夠調節激素水平，改善卵巢早衰的臨床癥狀[4]，且基于養血補腎為基礎的補腎養血方對POF具有積極的治療作用[5]。近年來，現代中醫研究發現，基于當歸、熟地黃加減的補腎養血方能夠通過上調POF大鼠卵泡及卵巢間質Bcl2蛋白的表達，下調Bax蛋白的表達，抑制卵泡的過快凋亡[6]，另有研究證明[7]，養血補腎方能夠促進POF大鼠卵泡生長，降低POF大鼠血清FSH、LH水平，促進E2水平上升，改善卵巢功能。近年來，臨床上使用抗穆勒氏管(anti-mullerian hormone，AMH)做為卵巢功能的評估[8]，更有研究指出，AMH在雌性動物體內由卵巢細胞分泌，在一定程度上可以反映卵巢的功能狀態[9]。但，關于養血補腎方對于POF大鼠中AMH的影響報道較少，因此本實驗采用雷公藤多苷建立大鼠卵巢早衰大鼠模型，研究補腎養血方對卵巢早衰大鼠體內AMH的影響，為補腎養血方可防治改善卵巢早衰提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

處于動情期的雌性SD大鼠60只，10～12周齡，SPF級，體重為230～270 g，由北京大學醫學部實驗動物中心提供[SCXK(京) 2012-0016]，所有大鼠在河南省中醫藥大學動物實驗中心完成 [SYXK(豫)2012-009]，采用顆粒型普通飼料喂養，飲自來水，保持室溫，模擬正常晝夜生理節律光照。

1.2 實驗藥品與試劑

雷公藤多苷片，購于安徽新隴海藥業有限公司，規格10 mg/片；補腎養血方由本院藥劑科提供，組方：淫羊藿10 g，熟地黃15 g，當歸10 g，丹參15 g，菟絲子10 g，枸杞子10 g，山茱萸10 g，白芍8 g，杜仲8 g，川芎5 g，甘草5 g，水煎并濃縮，制成相當于生藥材2.0 g/mL的混懸液，放于4℃冰箱儲存備用。戊酸雌二醇(補佳樂)，購于法國Delpharm Lille S.A.S，規格1 mg/片；大鼠抗苗勒氏管激素(anti-mullerian hormone，AMH)ELISA試劑盒購于美國Diagnostic Systems Laboratories公司；AMH抗體購于美國Abcam公司；AMH引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；其余試劑均為國產分析純。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組和造模

將SD大鼠隨機分為6組，每組10只，稱重，分別設空白組，模型組，高劑量組，中劑量組，低劑量組和陽性對照組。除空白組外，其余SD大鼠以雷公藤多苷片50 mg/kg灌胃，每日一次，連續15 d。

1.3.2 動物給藥

造模成功24 h后進行給藥，依據人鼠的劑量換算，折算為人的等效劑量的10倍：空白組，正常飲食；模型組，以生理鹽水2 mL/kg給藥，每日灌胃1次；高劑量給藥組，以補腎養血方20 g/kg給藥，每日灌胃一次；中劑量給藥組，以補腎養血方10 g/kg給藥，每日灌胃一次；低劑量給藥組，以補腎養血方5 g/kg給藥，每日灌胃一次。陽性對照組，以戊酸雌二醇0.12 mg/kg給藥，每日灌胃一次。各組連續給藥30 d。

1.3.3 酶聯免疫吸附試驗檢測大鼠血清中AMH含量

將各組大鼠稱重，尾靜脈取血3 mL，3000 r/min離心15 min，收集上清液待測。按AMH ELISA試劑盒說明書進行操作。將樣品加入酶標包被板中，37℃孵育30 min，洗板；加入生物素化抗體工作液，封板膜封板后37℃孵育1 h，洗板；加入HRP，37℃孵育30 min，洗板。加入顯色劑，酶標儀450 nm波長處檢測各孔吸光度(10 min內)。

1.3.4 卵巢組織學觀察

各組大鼠完成給藥24 h后，處死大鼠，取雙側卵巢，一側卵巢置于-80℃中保存。另一側卵巢用10%中性甲醛固定，洗滌，依次用梯度乙醇脫水，于二甲苯中透明15 min，石蠟包埋后切片，烤干，二甲苯脫蠟后再依次用梯度乙醇脫水，蘇木素染色，鹽酸乙醇分化，進行HE染色。倒置顯微鏡下觀察各組大鼠的卵巢形態學。

1.3.5 免疫組化染色法檢測AMH的蛋白表達水平

將卵巢組織切片置于二甲苯(I)(II)(III)中脫蠟，依次放入無水乙醇，90%乙醇，80%乙醇，70%乙醇中，洗滌，置于3%過氧化氫溶液10 min，封閉，加入AMH抗體，4℃過夜，顯色。蘇木素復染，返藍，乙醇脫水，置于二甲苯中浸泡，加入中性樹膠，封片晾干。根據染色細胞所占面積和細胞染色強度兩項指標進行綜合評分判斷。綜合評分=(染色細胞分數+細胞染色強度分數)/2；0-0.5分為(-)；0.5-1.5分為(+)；1.5-2.5分為(++)；>2.5分為(+++)。

1.3.6 卵巢AMH的mRNA表達水平

將冷凍的卵巢組織在冰浴中用電動勻漿機充分攪拌，提取各組卵巢的總RNA，逆轉錄合成cDNA，進行PCR反應，AMH引物：上游：5’-TCCTAGAGAC CCTCACTCGC -3’；下游：5’- CACGGGGTCTGAAAG GTTGA-3’；β-actin 引物：上游：5’- GTGGGGCGCCC CAGGCACCA -3’；下游：5’- CTCCTTAATGTCACG CACGATTTC-3’；擴增條件：94℃ 30s，52℃ 1 min，72℃ 30 s，進行25個循環，于73℃延伸10 min。實驗結果在熒光定量操作系統中進行分析對比，目標基因的相對定量用2-△△Ct計算。

1.4 統計處理

試驗數據運用SPSS16.0軟件進行處理，實驗結果以平均數±標準差(±s)表示，組間采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩組間比較采用Bonferroni校正的t檢驗，以P< 0.05表示有統計學意義。

2 結果

2.1 血清中AMH濃度水平

酶聯免疫吸附試驗結果顯示，模型組的大鼠卵巢中AMH的水平顯著低于空白組；給予補腎養血方后，發現其呈劑量依賴性逆轉雷公藤多苷誘導卵巢早衰AMH降低，與模型組相比具有統計學差異(P< 0.05)。見表1。

2.2 卵巢組織學觀察

空白組卵巢體積大，可見不同時期發育的卵泡，包括原始卵泡、初次卵泡、次級卵泡、成熟卵泡和閉鎖卵泡，血管形態正常，可見大量黃體；模型組卵巢萎縮，卵泡和黃體數量少，閉鎖卵泡增多；低劑量組各級卵泡生長情況略好于模型組；中劑量組各級卵泡與黃體數量比模型組明顯增多；高劑量組各級卵泡生長情況與空白組相似，卵泡與黃體數量較多；陽性對照組各級卵泡和黃體數量顯著高于空白組，卵泡細胞和黃體細胞生長良好。見圖1。

表1 補腎養血方對卵巢早衰大鼠AMH水平的影響(±s，n=10，pmol/L)

Tab.1 The effect of bushenyangxue prescription on the levels of AMH

表1 補腎養血方對卵巢早衰大鼠AMH水平的影響(±s，n=10，pmol/L)

組別GroupAMH水平AMHlevels空白組Blankcontrolgroup247±011模型組Modelgroup034±001?低劑量組Low?dosegroup107±008#中劑量組Middle?dosegroup178±013#高劑量組High?dosegroup245±010#陽性對照組Positivecontrolgroup412±031#

注：*P< 0.05，與空白組相比較；#P< 0.05，與模型組相比較。

Note.*P< 0.05 vs. blank control group.#P< 0.05 vs. model group.

2.3 免疫組化染色法檢測AMH的蛋白表達水平

AMH在卵巢中的主要表達竇前卵泡和小竇狀卵泡的顆粒細胞，成熟卵泡和細胞間質表達也有表達。模型組中AMH的表達明顯低于空白組；低劑量補腎養血方可逆轉雷公藤多苷造成AMH表達的減少，并隨著劑量增大而逆轉效果更為顯著；陽性對照組中AMH的表達水平顯著高于空白組。見圖2，表2。

2.4 qRT-PCR檢測卵巢中AMH的mRNA表達水平

qRT-PCR檢測結果表明，給予雷公藤多苷后大鼠卵巢中AMH的mRNA表達水平顯著降低；而補腎養血方可明顯逆轉雷公藤多苷導致AMH mRNA表達的減少，并隨給藥劑量增大而逆轉作用增強。見圖3。

3 討論

卵巢早衰在中醫可以歸屬為“血枯”、“血隔”、“月經后期”、“不孕”等范疇[10]。雖然，各醫家對本病的病因認識有所區別，但總體認為本病的根本在于“天癸早枯”，腎中精氣虧虛為主導。中醫認為腎藏先天之精，主生殖，精血同源，相互助生，相互轉化。因此腎氣不足會導致精血虧虛，從而影響女子的生育功能。補腎養血方以補腎為主的淫羊藿，菟絲子，杜仲，山茱萸和補氣養血的熟地黃，當歸，黨參，枸杞子，白芍，川芎組成，附以甘草調和諸藥。

注：(A)空白組；(B)模型組；(C)低劑量組；(D)中劑量組；(E)高劑量組；(F)陽性對照組。圖1 各組卵巢卵泡組織形態Note.(A)blank control group.(B)model group.(C)low-dose group.(D)middle-dose group.(E)high-dose group.(F)positive control group.Fig.1 Representative images of ovarian tissue follicle morphology.

注：(A)空白組；(B)模型組；(C)低劑量組；(D)中劑量組；(E)高劑量組；(F)陽性對照組。圖2 各組大鼠卵巢組織中AMH的表達Note.(A)blank control group.(B)model group.(C)low-dose group.(D)middle-dose group.(E)high-dose group.(F)positive control group.Fig.2 Immunohistochemical results showing the expression of AMH.

組別Group--++++++++++++空白組Blankcontrolgroup0253模型組Modelgroup 8?200低劑量組Low?dosegroup3#520中劑量組Middle?dosegroup0#550高劑量組High?dosegroup0#361陽性對照組Positivecontrolgroup0#145

注：*P< 0.05，與空白組相比較；#P< 0.05，與模型組相比較。

Note.*P< 0.05 vs. blank control group.#P< 0.05 vs. model group.

注：*P < 0.05，與空白組相比較；#P < 0.05，與模型組相比較。圖3 各組大鼠卵巢中AMH的mRNA表達水平(±s,n=10)Note. *P < 0.05 vs. blank control group. #P < 0.05 vs. model group. Fig.3 Expression of AMH mRNA in different dosage group

補腎養血方具有滋補肝腎，補氣活血斂陰，補而不滯，滋而不膩的特點，使得腎氣盛而天癸至，對女子卵巢早衰之經閉具有治療功效，調節生殖內分泌功能失調。

卵巢功能的評估指標主要包含：年齡、濾泡刺激激素(FSH)、黃體生成素(LH)、抑制素B(Inhibin B)、卵巢大小(Ovarian volume)、竇卵泡數目(Antral follicle count)和雌激素(oestrogen-2，E2)等，但憑單一指標卻無法真實反應卵巢狀況。近來研究發現，卵巢功能開始衰退前期，在 FSH、E2、inhibin B 尚未產生變化，AMH即可明確反應出衰退的征兆[11]。血清抗苗勒管素(AMH)是一種以二硫鍵連接的二聚體糖蛋白，是轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)家族的成員之一，雌性體內由卵巢顆粒細胞分泌[12]。AMH抑制卵泡的生長過快，防止卵泡過早消耗。血清中AMH水平可以反映早期卵泡數量，預示著女性的生殖能力，因此，可以利用AMH水平來反映女性卵巢衰老的變化[11]。衰老是生命活動的普遍現象，其機制至今仍不完全清楚。而卵巢衰老主要表現為卵泡數量及卵泡質量的下降，卵巢生殖和內分泌功能減退，從而繼發全身各器官功能改變[12]。本實驗采用雷公藤多苷對大鼠灌胃，通過顯微觀察大鼠卵巢形態，結果發現雷公藤多苷可導致卵巢早衰的特征出現，如卵泡和黃體數量少，閉鎖卵泡增多等；給予不同劑量的補腎養血方后，均在一定程度上逆轉大鼠卵巢早衰的癥狀，卵泡和黃體數量明顯增加；高劑量組的逆轉作用更為顯著，表明補腎養血方具有抑制卵巢早衰的功效。另一方面，雷公藤多苷給藥后，大鼠血清中AMH水平顯著降低，提示卵巢功能下降，衰竭；而給予補腎養血方的大鼠，其血清中AMH水平呈劑量依賴性上升，其中高劑量組血清中AMH水平接近空白組，提示補腎養血方可增加卵巢中AMH水平。免疫組化染色和qRT-PCR檢測結果表明，雷公藤多苷可導致卵巢中AMH蛋白和mRNA表達水平顯著下降，補腎養血方呈劑量依賴性逆轉雷公藤多苷導致AMH蛋白和mRNA表達水平下降。綜上所述，補腎養血方能有效逆轉雷公藤多苷導致大鼠卵巢早衰中AMH水平下降。

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Effect of bushenyangxue prescription on the levels of anti-mullerian hormone in rat with premature ovarian failure

JI Xia, FU Jin-ying*, WANG Bing-yu, HU Jun-pan

(Department of Obstetrics and Gynecology, Henan Province Hospital of TCM, the Second Affiliated Hospital of Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450002, China)

Objective Establish premature ovarian failure (POF) model in female Sprague Dawley by tripterygium wilfordii, and investigate the effect of bushenyangxue prescription on the levels of anti-mullerian hormone (AMH). Methods After POF model was established, rats were gave by gavage of different dosage of Bushenyangxue prescription for 30 days. The changes of histomorphology on rat ovarian tissue were observed by hematoxylin-eosin staining. Serum AMH concentraction, protein and mRNA expression of AMH were measure with ELISA, immunohistochemical staining and qRT-PCR, respectively. Results The follicle and corpus luteum were atrophied after tripterygium wilfordii challenge, which was improved after treatment with Bushenyangxue prescription. Serum AMH, protein and mRNA expression of AMH were decreased tripterygium wilfordii-treated rats; this decrease was inhibited after treatment with Bushenyangxue prescription. Conclusions Our study indicates that Bushenyangxue prescription could preserve the AMH levels of POF rats. These findings suggest that Bushenyangxue prescription may be a useful strategy to treat POF.

Bushenyangxue prescription; Premature ovarian failure (POF); AMH

河南省中醫藥管理局科研課題(2014ZY02013)。

姬霞(1968-)，女，副主任醫師, 本科, 研究方向：中西醫結合治療婦產科疾病的基礎與臨床研究。

E-mail: jx.1120@163.com

傅金英(1968-)，主任醫師，醫學博士，研究方向：婦科生殖內分泌。E-mail: fujinying2003@163.com

研究報告

R-332

A

1671-7856(2017) 01-0049-05

10.3969.j.issn.1671-7856.2017.01.010

2016-04-02