氧化槐果堿對小鼠炎癥性疼痛的鎮痛作用研究

吳 璟，楊 文，鄭 婕，楊 洋，黎偉華，趙玉萍，李鳳梅，馬鵬生，余建強*

(1. 寧夏醫科大學實驗動物中心，銀川 750004；2.寧夏醫科大學藥學院，銀川 750004)

氧化槐果堿對小鼠炎癥性疼痛的鎮痛作用研究

吳 璟1，楊 文1，鄭 婕2，楊 洋2，黎偉華1，趙玉萍2，李鳳梅2，馬鵬生2，余建強2*

(1. 寧夏醫科大學實驗動物中心，銀川 750004；2.寧夏醫科大學藥學院，銀川 750004)

目的 研究氧化槐果堿對二甲苯和角叉菜膠誘導的小鼠炎癥性疼痛的影響，以探索其可能的機制。方法 ICR小鼠50只，隨機分為模型組、ASP治療組、氧化槐果堿高、中、低劑量組，各組分別給予對應藥物1 h后，采用二甲苯致小鼠耳腫脹實驗和角叉菜膠誘導的小鼠足趾腫脹實驗，研究氧化槐果堿對小鼠各種炎癥性刺激的影響。結果 與生理鹽水組相比, 氧化槐果堿各劑量組能明顯抑制二甲苯致小鼠耳腫脹程度和角叉菜膠致小鼠足趾腫脹程度；小鼠足組織的TNF-α，IL-1β，IL-6和PGE2水平顯著降低。結論 OSC對角叉菜膠誘導的炎性疼痛具有明顯的鎮痛作用，可能與其抑制炎性因子的分泌有關。

氧化槐果堿；炎性疼痛；炎性細胞因子

炎癥性疼痛是一種世界范圍內日益增長的人類健康保健問題，它降低了患者的生活質量。與炎癥性疼痛相關的病癥包括外傷、間質性膀胱炎、胰腺炎、類風濕性關節炎和骨關節炎[1]。炎性疼痛一般用阿片類藥物和非甾體類抗炎藥治療，但兩種藥物均受到(如成癮、鎮靜和嚴重的心血管效應)副作用的限制。氧化槐果堿(OSC)是從豆科植物苦豆子中提取的生物堿。有關研究證明：OSC在乙酸誘導的扭體試驗和在福爾馬林誘導的炎性疼痛試驗中具有顯著鎮痛作用[2]。本研究以OSC為研究對象，探討其抗炎癥性疼痛的作用，為臨床提供一定理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

6～8周齡雄性SPF級ICR小鼠180只，由寧夏醫科大學實驗動物中心[SCXK(寧)2015-0001]提供，體重18～24 g，飼養于寧夏醫科大學實驗動物中心屏障動物實驗設施內[SYXK(寧)2015-0001]，室溫、晝夜明暗交替(12/12 h)，自由進水攝食。每一只動物僅用于一個單一的實驗并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。

1.2 主要試劑與設備

爪腫脹體積測量儀(YLS-7A，山東省醫學科學院設備站)；氧化槐果堿(OSC寧夏藥物研究所，批號20130001)；阿司匹林(Sigma-Aldrich公司，CAS:50-78-2)；二甲苯(北京化工廠，批號20130530)；角叉菜膠(Shanghai Kai Yang Biotechnology Co.Ltd 20130104)；小鼠IL-1β ELISA檢測試劑盒(美國RayBiotech公司， ELM-IL1beta-001C)、小鼠IL-6 ELISA檢測試劑盒(美國RayBiotech公司，ELM-IL6-001C)；小鼠TNF-α ELISA檢測試劑盒(美國RayBiotech公司，ELM-TNFalpha-001)；小鼠PGE2 ELISA檢測試劑盒(美國R&D公司，KGE004B)。

1.3 實驗方法

1.3.1 小鼠的急性毒性實驗

取ICR小鼠50只， 隨機均分成 5 組， 將OSC按 1∶0.8 等比計算配制成5 個劑量組，腹腔注射給藥后， 觀察72 h。采用改良寇氏法計算 LD50=240 mg/kg。給藥最大劑量后，小鼠出現不安、陣攣、角弓反張、驚厥等癥狀，最后以呼吸抑制而死亡。

1.3.2 小鼠耳腫脹試驗

取ICR小鼠50只，隨機分組，每組10只。分別為模型組(NS，腹腔注射 0.1 mL/10g)，阿司匹林組(400 mg/kg 灌胃給藥 0.1 mL/10g)，OSC(80，40，10 mg/kg)藥物組(腹腔注射 0.1 mL/10g)。給藥1 h 后，將各組小鼠分別于左耳正反兩面均勻涂上二甲苯50 μL致炎，40 min 后脫頸椎處死小鼠，迅速剪下動物的雙耳，并沿邊緣打下9 mm耳片，于扭力天平上稱重，同一只動物左右耳的重量差即為腫脹度[3]。

小鼠腫脹度=左耳耳片重量-右耳耳片重量。

小鼠耳腫度抑制率(%)=(模型組腫脹度 -給藥組腫脹度)/模型組腫脹度×100%

1.3.3 角叉菜膠致小鼠炎性疼痛實驗

取ICR小鼠50只，隨機分組，每組10只。分別為模型組(NS, 腹腔注射0.1 mL/10g)，阿司匹林組(400 mg/kg 灌胃給藥0.1 mL/10g，OSC(80，40，10 mg/kg)藥物組(腹腔注射0.1 mL/10g)，分別于給藥0.5 h后，在小鼠右后足底注射角叉菜膠溶液30 μL(300 μg/paw)[4]。

1.3.3.1 足趾容積的測定

于給藥后1、2、3、4、5 h，采用足趾容積測量儀測量右后踝關節以下容積。

1.3.3.2 機械縮足反射閾值(paw withdrawal threshold, PWT)的測定[5]

在保證實驗環境安靜且光照適宜后，將待測小鼠置于2 mm×2 mm孔隙的金屬網格上。用固定大小的有機玻璃盒隔開各只小鼠(一次可放6只)，待小鼠適應0.5 h后，測定小鼠的機械縮足反射閾值(PWT)。使用不同刺激強度的Von Frey Filaments (vFFs) 刺激小鼠的第3、4足趾的趾間皮膚，觀察小鼠可能發生的縮足反應。刺激強度一般從0.4 g開始，若vFFs纖維絲彎曲超過90°時，若小鼠仍不發生抬足，則視為無反應。此時應給予相鄰的刺激強度大一級的纖維絲；如果有反應，則更換相鄰的刺激強度小一級的纖維絲。每次刺激時間間隔必須大于10 s，直到找到能引起50%抬足反應的纖維絲。本實驗中最大刺激強度值為4.0 g，記錄所測小鼠的能引起50%抬足反應的纖維絲刺激強度值，即為機械縮足反射閾值 (g)。分別測定給藥前和給藥后1、2、 3、 4、5 h的機械縮足反射閾值。

1.3.4 氧化槐果堿對角叉菜膠致小鼠炎性痛損傷組織中TNF-α、IL-1β、IL-6和PGE2表達水平的檢測

雄性ICR小鼠30只，隨機分為：正常組、模型組、OSC(80 mg/kg)組，每組10只。各組小鼠分別于給藥0.5 h后，在除正常組外所有小鼠的右后足底注射角叉菜膠溶液30 μL(300 μg/paw)，5 h后，處死小鼠，剪下右后足底損傷組織，制成10%組織勻漿，4℃，1.0×104r/min，離心15 min，取上清，酶標儀測定小鼠炎性痛損傷組織中TNF-α、IL-1β、IL-6和PGE2的蛋白表達水平(按試劑盒說明書操作)

1.4 統計學方法

采用SPSS 13.0統計軟件進行數據處理分析，結果以均數±標準差表示(±s)。兩樣本均數間比較采用t檢驗，多樣本均數間比較采用One-way ANOVA檢驗，以P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 氧化槐果堿對二甲苯致小鼠耳腫脹度的影響[4]

于小鼠左耳正反兩面涂上50 μL二甲苯1 h后，模型組的耳腫脹度達到15.78±1.75 mg，說明模型制備成功。與模型組比較，陽性藥阿司匹林組(400 mg/kg)的耳腫脹度顯著降低(P< 0.01)抑制率達50.57%；氧化槐果堿(80 mg/kg)組的耳腫脹度顯著降低(P< 0.01)，抑制率達52.79%，略高于阿司匹林組；氧化槐果堿(40 mg/kg)組的耳腫脹度也顯著降低(P< 0.01)；氧化槐果堿(10 mg/kg)組的耳腫脹度也明顯降低，具有統計學差異(P< 0.05)(見表1)。

2.2 氧化槐果堿對角叉菜膠致小鼠足趾炎癥反應腫脹度的影響

各組小鼠造模前的基礎容積之間相互比較無顯著性差(P> 0.05)。與正常組比較，模型組1～5 h的足腫脹度顯著增高(P< 0.01)，說明角叉菜膠誘發了足腫脹，模型制備成功。與模型組比較，陽性藥阿司匹林組(400 mg/kg)給藥后1～5 h的足腫脹度顯著性降低(P< 0.05)；氧化槐果堿(80 mg/kg)組給藥后1～5 h的足腫脹度顯著性降低(P< 0.01)；氧化槐果堿(40 mg/kg)組給藥后2～5 h足腫脹度顯著性降低(P< 0.05)；而氧化槐果堿(10 mg/kg)組給藥后各時間點的足腫脹度差異無顯著性(P> 0.05)(見表2)。

表1 氧化槐果堿對二甲苯致小鼠耳腫脹度的影響 (±s，n=10)

Tab.1 Effect of oxysophocarpine (OSC) on xylene-induced ear swelling in mice

表1 氧化槐果堿對二甲苯致小鼠耳腫脹度的影響 (±s，n=10)

組別Group劑量(mg/kg)Dose腫脹度Swellingdegreen抑制率InhibitionrateNS組NS-1578±175-阿司匹林Aspirin400780±263??505780745±239??5279氧化槐果堿OSC401008±237??3612101255±358?2047

注：與NS組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. Comparison of the NS group,*P< 0.05，**P< 0.01.

表2 氧化槐果堿對角叉菜膠致小鼠足趾炎癥反應腫脹度的影響(±s， n=10)

Tab.2 Effect of oxysophocarpine (OSC) on carrageenan-induced the swelling degree of mice with toes inflammation

表2 氧化槐果堿對角叉菜膠致小鼠足趾炎癥反應腫脹度的影響(±s， n=10)

組別Group劑量(mg/kg)Dose腫脹度(mL)Swellingdegree基礎容積Basevolume1h2h3h4h5h正常Normal-01752±0013000098±0009900030±0010500003±0007600014±0003500002±00061模型組Model-01729±0014600569±00294##00545±00180##00773±00149##00957±00145##00896±00166##阿司匹林Aspirin40001773±0016700367±00159##?00330±00175##??00382±00152##??00406±00112##??00459±00075##??氧化槐果堿OSC8001740±0014500235±00150#??00311±00058##??00340±00085##??00354±00110##??00397±00093##??4001836±0011400449±00153##00408±00158##?00519±00193##??00572±00184##??00525±00221##??1001736±0020700456±00138##00542±00162##00697±00118##00807±00148##?00832±00185##

注：與正常組比較，#P< 0.05，##P< 0.01；與模型組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note.Comparison of the normal group，#P< 0.05，##P< 0.01. Comparison of the model group，*P< 0.05，**P< 0.01.

表3 氧化槐果堿對角叉菜膠致小鼠炎性痛痛閾值的影響(±s, n=10)

Tab.3 Effect of oxysophocarpine (OSC) on carrageenan-induced inflammatory pain threshold of mice

表3 氧化槐果堿對角叉菜膠致小鼠炎性痛痛閾值的影響(±s, n=10)

組別Group劑量(mg/kg)Dose痛閾值(g)Painthreshold 基礎痛閾值Baselinepainthreshold1h2h3h4h5h150±03801260±03271260±03781340±02991260±03271420±0．437NS組NS-144±03370139±0102##0112±0051##0091±0049##0100±0053##0112±0．111##阿司匹林Aspirin400140±03650142±0105##0336±0296##?0308±0199##??0392±0147##??0184±0．124##氧化槐果堿OSC80138±02740186±0179## 0331±0214##?? 0344±0176##?? 0459±0281##?? 0214±0．165##?40152±04830122±0110##0136±0105##0154±0099##?0271±0139##??0142±0．105##10140±03650121±0110##0081±0051##0068±0051##0077±0047##0089±0．052##

注：與正常組比較，#P< 0.05，##P< 0.01；與模型組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note.Comparison of the normal group，#P< 0.05，##P< 0.01. Comparison of the model group，*P< 0.05，**P< 0.01.

表4 氧化槐果堿對角叉菜膠致小鼠炎性痛損傷組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2蛋白表達水平的影響 (±s，n=10)

Tab.4 Effects of oxysopressin on carrageenan-induced the expression of TNF-α, IL-1β, IL-6 and PGE2 proteins in inflammatory pain-injuried mice

表4 氧化槐果堿對角叉菜膠致小鼠炎性痛損傷組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2蛋白表達水平的影響 (±s，n=10)

組別Group劑量(mg/kg)DoseTNF?α(pg/mg)IL?1β(pg/mg)IL?6(pg/mg)PGE2(pg/mg)正常組Normal-8290±76615960±179111604±22876308±2521模型組Model-38196±3472##34325±2361##81149±4612##21472±2935##氧化槐果堿OSC8016693±1349??21832±1963??58651±5868??10915±1897??

注：與正常組比較，#P< 0.05，##P< 0.01；與模型組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note.Comparison of the normal group，#P< 0.05，##P< 0.01. Comparison of the model group，*P< 0.05，**P< 0.01.

2.3 氧化槐果堿對角叉菜膠致小鼠炎性痛痛閾值的影響[5]

各組小鼠造模前的基礎機械縮足反射閾值之間相互比較無顯著性差異(P> 0.05)。與正常組比較，角叉菜膠模型組小鼠1～5 h的機械縮足反射閾值顯著降低(P< 0.01)，說明角叉菜膠誘發了炎性疼痛，模型制備成功。與模型組比較，陽性藥阿司匹林組(400 mg/kg)給藥后2～4 h的機械縮足反射閾值顯著性回升(P< 0.05)；氧化槐果堿(80 mg/kg)組給藥后2～5 h的機械縮足反射閾值顯著性回升(P< 0.05)；氧化槐果堿(40 mg/kg)組給藥后3～4 h的機械縮足反射閾值顯著性回升(P< 0.05)；而氧化槐果堿(10 mg/kg)組給藥后各時間點的機械縮足反射閾值無顯著性差異(P> 0.05)(見表3)。

2.4 氧化槐果堿對角叉菜膠致小鼠炎性痛損傷組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2蛋白表達水平的影響

Elisa法檢測結果顯示：與正常組比較，角叉菜膠致小鼠炎性痛模型組小鼠損傷組織中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6和PGE2的蛋白表達水平顯著上升(P< 0.01)；與模型組相比，氧化槐果堿組小鼠損傷組織中的促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6和PGE2蛋白表達水平顯著下降(P< 0.01)(見表4)。

3 討論

疼痛通常與炎癥有關，這是由組織損傷，化學刺激，或自身免疫過程引起，這些能夠引起組織損傷的致炎因子參與傷害感受器的外周敏化，并為抗炎劑提供治療范圍，治療其與炎癥反應相關的疾病[6-9]。二甲苯誘導的小鼠耳腫脹試驗是一種成本低，時間短和分級客觀的對藥物抗炎活性進行評價的方法[10]。角叉菜膠作為致炎劑，可引起皮膚局部毛細血管通透性增高，炎癥細胞浸潤、組織腫脹，造成耳廓及足趾急性滲出性炎癥水腫[11]。局部應用二甲苯和足底注射角叉菜膠都產生炎癥反應[12]。角叉菜膠誘導的足趾腫脹試驗已常被用于評估天然產物的抗炎作用。角叉菜膠誘導的足趾腫脹試驗通常被劃分成兩個階段。第一階段，或是急性期，持續1～2 h，由組胺和5-羥色胺介導形成水腫。第二階段，或是引發炎癥期，持續2～5 h，緩激肽和PEG2保持了較高的血管通透性并誘導促炎細胞因子的釋放。這些介質參與炎性反應，刺激感受器，從而誘發和加劇疼痛[13]。本研究通過角叉菜膠誘導小鼠的足趾腫脹模型評估OSC的改善炎癥性疼痛的效果[14]。

目前，臨床常用的抗炎藥雖抗炎作用顯著，但長期和大量的應用可產生非常嚴重的不良反應[15-16]。開發天然藥物的抗炎作用成為了研究者關注的焦點。OSC是由天然豆科植物苦豆子中提取一類生物堿，研究表明，對二甲苯致小鼠耳腫脹性炎癥有明顯的抑制作用，對角叉菜膠致小鼠足腫脹有一定的抑制作用，OSC改善了小鼠爪的機械異常性疼痛閾值。OSC能明顯降低炎癥模型中TNF-α，1L-1β，IL-6和PEG2的含量。抗炎作用可能與細胞因子的水平有關。這些發現可能對了解OSC治療炎癥疼痛的分子基礎有重要意義。

因此，我們的研究表明，OSC將在治療炎癥性疼痛方面可能作為抗炎藥物使用，為臨床進一步的開發利用提供了理論基礎。

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Oxysophocarpine ameliorates carrageenan-induced inflammatory pain via inhibiting expressions of prostaglandin E2and cytokines in mice

WU Jing1，YANG Wen1，ZHENG Jie2，YANG Yang2,LI Wei-hua1，ZHAO Yu-ping2， LI Feng-mei2， MA Peng-sheng2，YU Jian-qiang2*

(1. Laboratory Animal Center, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, China； 2.Department of Pharmacology, School of pharmacy, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, China)

Objective In this study we investigated the analgesic effect of oxysophocarpine (OSC) on carrageenan-induced inflammatory pain in mice and to explore its possible mechanism. Methods Mouse ear swelling test and carrageenan-induced paw edema were used to investigate the effects of OSC (10, 40 and 80 mg/kg) on inflammatory pain in mice. The mechanical hyperalgesia and allodynia were measured by von Frey filaments. Paw edema was assessed by toe volumetric measuring instrument. text the content of TNF-α, IL-1β, IL-6 and PGE2.Results OSC showed a significant anti-inflammatory effect in the mouse ear swelling test. OSC (10, 40 and 80 mg/kg) also significantly reduced the paw edema volume and improved mechanical allodynia threshold value on carrageenan-induced inflammatory pain, as well as relieved paw tissues inflammatory damage and reduced the numbers of neutrophils in mice. OSC significantly suppressed over-expression of TNF-α, IL-1β, IL-6 and PGE2. Conclusions Based on these findings we propose that OSC attenuates inflammatory pain by suppressing the Pro-inflammatory cytokines.

Oxysophocarpine；Inflammatory pain；Pro-inflammatory cytokines

寧夏高等學校科學研究項目(NGY2014097)。

吳璟(1977-)，女，碩士，副教授，研究方向：醫學實驗動物學及藥理學研究。E-mail：wj.nxmc@qq.com

余建強(1965-),男，碩士生導師，研究方向：藥理學。E-mail：yujq910315@163.com

研究報告

R-332

A

1671-7856(2017) 01-0054-05

10.3969.j.issn.1671-7856.2017.01.011

2016-06-27