不同種植年限條件下黃花蒿根際土壤微生物生物量、酶活性及真菌群落組成

李倩，楊水平，崔廣林，黃建國*，李隆云*，程玉淵

(1.西南大學資源環境學院，重慶400716；2.重慶市中藥研究院，重慶 400065;3.河南省煙草公司南陽市公司, 河南 南陽473000)

不同種植年限條件下黃花蒿根際土壤微生物生物量、酶活性及真菌群落組成

李倩1,3，楊水平1，崔廣林2，黃建國1*，李隆云2*，程玉淵3

(1.西南大學資源環境學院，重慶400716；2.重慶市中藥研究院，重慶 400065;3.河南省煙草公司南陽市公司, 河南 南陽473000)

試驗采集未種植、種植1年、3年和5年的黃花蒿根際土壤，采用常規分析和Illumina MiSeq高通量測序技術，研究了土壤微生物生物量、酶活性及真菌群落組成。結果表明，在人工種植黃花蒿的土壤中，微生物生物量碳氮減少，碳氮比例改變；脫氫酶、脲酶和蔗糖酶活性降低，酸性磷酸酶活性增強；說明黃花蒿釋放的化感物質選擇性抑制了土壤微生物生長、繁殖和代謝。在不同種植年限的土壤中，主成分分析顯示代表不同種植年限土壤真菌群落的點在坐標圖中分布距離較遠，表明它們的群落組成發生了顯著變化(P<0.05)。此外，子囊菌門占土壤真菌的66.10%～95.28%，黃花蒿種植時間影響真菌門類和優勢真菌的豐富度。在前20種優勢真菌中，有14種共存于不同種植年限的土壤中，每種土壤中存在1～3種獨有真菌，說明土壤是決定真菌種群組成的主導因素，又因種植黃花蒿而改變。在栽培1～5年的黃花蒿土壤中，優勢菌株中出現蒿屬的常見病菌——蒿白粉菌和艾菊柄銹菌，提高相應病害的發生風險。

黃花蒿；土壤酶活性；真菌；高通量測序

重慶市是我國黃花蒿(Artemisiaannua)的主產區，種植面積和青蒿素產量分別占全國的70%和80%[1]。由于土地資源缺乏，黃花蒿連作現象十分普遍。但長期持續連作，黃花蒿生長不佳，青蒿素含量和產量下降；葉白粉病、莖腐病和根腐病等真菌性病害的發生率超過10%，造成巨大的經濟損失，嚴重制約黃花蒿種植業的發展[2-4]。

黃花蒿在生長過程中，主要通過植株殘體腐解、根系分泌和雨水淋溶向土壤生態系統釋放倍半萜青蒿素類、多甲氧基黃酮類、酚酸類和生物堿類等物質[5-6]。據報道，其主要化感物質——青蒿素在土壤中的半衰期長，對土壤微生物產生持續作用[7]，選擇性地殺抑枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、鑲刀菌(Fusariumsp.)、點枝頂孢菌(Elcremoniumstrictum)和黃曲霉(Aspergillasflavus)等土壤微生物[8-9]，但對大腸桿菌(Escherichiacoli)、小麥全蝕病菌(Gaeumannomycesgraminis)、禾谷絲核菌(Rhizoctoniazeae)和棉花黃萎病菌(Verticilliumdahliae)無顯著影響[10-11]。在人工種植黃花蒿的根際土壤中，細菌、真菌和放線菌的動態變化與青蒿素含量密切相關[12]。在野生黃花蒿生長的土壤中，去氧青蒿素含量與放線菌數量呈極顯著負相關(r=-0.528**,n=24)；青蒿素含量與細菌和放線菌數量呈顯著負相關(r=-0.508*和r=-0.478*,n=24)[13]。Herrmann等[5]發現，在種植黃花蒿的土壤中，可培養細菌數量顯著低于未種植土壤。因此，種植黃花蒿可能影響土壤微生物的生長、繁殖、代謝和種群結構。

土壤微生物生物量碳氮和土壤酶活性可定量指示微生物數量、活性及代謝狀況[14]。真菌是土壤微生物的重要組分，具有多種多樣的生理、生化和生態功能，且多數真菌群落組成與重要病害發生密切相關。長期連續種植人參(Panaxginseng)、三七(Panaxnotoginseng)、地黃(Rehmanniaglutinosa)和丹參(Salviamiltiorrhiza)等藥用植物之后，病原真菌增加，真菌病害大面積發生，造成大幅減產降質[15]。在自然棲息環境中，150萬種真菌僅有5%～10%被人類認識。目前采用的常規培養法僅能獲得土壤微生物總量的1%～3%[16]；真菌細胞膜的磷脂脂肪酸高度相似，通常只能檢測出18:1ω9c和18:3ω6c[17]；聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳法(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis, PCR-DGGE)難于甄別單個真菌的基因序列[18]。迄今為止，對土壤真菌的認識還遠遠不夠。高通量測序技術根據真菌18S rDNA的保守性，經提取、擴增、純化、定量和均一化真菌DNA序列，再經測序、過濾、優化、聚類，對比基因庫中的已知序列，從而鑒別真菌種(屬)類，是傳統培養方法所獲得微生物數量的十倍甚至數百倍，能準確靈敏地檢測土壤真菌[19]。為此，本試驗利用常規分析和Illumina MiSeq高通量測序技術，研究了重慶市黃花蒿主產區土壤中的微生物生物量、酶活性及真菌群落組成，旨在為克服黃花蒿連作障礙和保持高產優質提供有益信息。

1 材料與方法

1.1 樣地概況

重慶市巴南區東泉鎮黃花蒿栽培區位于北緯29°26′，東經106°50′，海拔329 m。年均溫度18.7 ℃，氣溫-1～40.8 ℃；平均年降雨量1100 mm，主要集中在5-7月；霧期60～90 d，日照1100～1300 h；無霜期在300 d以上。樣地地貌平坦，土壤均勻一致，土壤類型為三疊紀嘉陵江組石灰巖發育的黃壤。土壤pH 5.91，有機質13.14 g/kg，有效氮72.02 mg/kg，有效磷 20.13 mg/kg，有效鉀70.53 mg/kg。

1.2 試驗設計

試驗開始于2011年，在土壤條件均勻一致的黃花蒿種植區，選取12個小區，第一年隨機選取3塊種植黃花蒿，其余小區按照當地習慣夏種玉米(Zeamays)，冬種油菜(Brassicacampestris)或小麥(Triticumaestivum)。在連作黃花蒿的第3年，隨機另選3個小區種植黃花蒿，以此類推，在第5年時分別形成黃花蒿連作5年和3年，種植1年和未種黃花蒿(對照，種植玉米)的土壤，依次用Y5、Y3、Y1和Y0表示。黃花蒿品種為“渝青1號”，每年12月中旬播種育苗，次年4月上旬移栽，按照當地習慣基施N-P2O5-K2O=25-10-5復合肥900 kg/hm2，常規管理。

1.3 樣品采集與測定

在黃花蒿現蕾期，每小區按“S”形隨機選取10株長勢一致的植株，拔出后輕輕抖落多余的土壤至每株剩50 g左右，然后用力抖動取樣，合并土壤，揀去雜物，放入冰盒，迅速帶回實驗室。

將部分土壤晾干，分別用3,5-二硝基水楊酸比色法、次氯酸鈉—苯酚鈉比色法、磷酸苯二鈉比色法和TTC分光光度法測定土壤蔗糖酶、脲酶、酸性磷酸酶和脫氫酶活性[20]。

另將部分新鮮土壤，分別測定微生物生物量碳氮和真菌ITS基因序列。土壤微生物生物量碳(microbial biomass carbon, MBC)和微生物生物量氮(microbial biomass nitrogen, MBN)采用氯仿熏蒸法:0.5 mol/L K2SO4提取，用K2Cr2O7氧化法測定提取液中的微生物生物量碳，靛酚藍比色法測定微生物生物量氮[16]。用OMEGA公司E.Z.N.A Soil DNA試劑盒抽提土壤基因組，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的大小及片段完整性，NanoDrop2000檢測DNA純度，TBS-380檢測DNA濃度。用ABIGeneAmp?9700PCR儀對真菌ITS區進行PCR擴增，引物為817F: 5′-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3′和1196R: 5′-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3′。PCR擴增程序如下：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35個循環，72 ℃終止延伸10 min結束。每個樣品3次重復，混合同一樣品的PCR產物，2%瓊脂糖凝膠電泳，AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN 公司)切膠回收PCR產物，QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統進行定量。Miseq文庫構建和測序均在上海美吉生物科技有限公司進行，測序平臺為Illumina MiSeqPE300/PE250。測序結束后，對有效序列進行去雜、修剪、去除嵌合體等過濾處理，得到優化序列，根據序列97%的相似性形成操作分類單元(operational taxonomic units，OUTs)，對比Unite庫，采用RDP classifier貝葉斯算法，得到OTUs的分類學信息。

1.4 數據處理

用Excel進行試驗數據基本計算，SPSS 19.0統計分析，R語言工具和Origin 8.5作圖，單因素方差分析(one way-ANOVA)檢驗不同種植年限處理間差異顯著性，CANOCO 4.5主成分分析(principal component analysis，PCA)不同處理間土壤微生物群落組成差異，顯著水平設置為P<0.05。真菌門的相對豐度為某門真菌18 S rDNA 讀數占真菌18 S rDNA 總讀數的百分數。

2 結果與分析

圖1 不同種植年限黃花蒿根際土壤微生物生物量碳氮 Fig.1 Changes of microbial biomass carbon and nitrogen in rhizospheric soils for A. annua cultivation Y0：未種植黃花蒿 Uncultivated A. annua；Y1：種植黃花蒿1年 Cultivated A. annua for 1 year；Y3：黃花蒿連作3年 Continuous cropping A. annua for 3 years；Y5：黃花蒿連作5年 Continuous cropping A. annua for 5 years.柱上方同一測定指標有不同小寫字母者表示差異顯著(P<0.05)，下同。Different small letters above the bars within same measurement item indicate a significant difference at P<0.05, the same below.

2.1 土壤微生物生物量碳氮

由圖1可見，隨黃花蒿種植年限增加，土壤微生物生物量碳氮持續降低。其中，微生物生物量碳降幅為30.04%～74.98%；微生物生物量氮降幅為38.01%～63.94%，微生物生物量碳氮比為18.88～31.80。

2.2 土壤酶活性

由表1可見，栽培黃花蒿不同程度地抑制土壤脲酶、脫氫酶和蔗糖酶活性。至栽培第5年，降幅依次為51.82%, 96.15%和53.76%。在種植黃花蒿前后，土壤酸性磷酸酶活性無顯著差異，但種植1年的土壤顯著低于種植3和5年的土壤。

2.3 土壤真菌

2.3.1 真菌門類 高通量測序從Y0、Y1、Y3和Y5土壤中分別獲得了19358，23826，17385和12133個真菌ITS序列數(Reads)，依次代表96，69，98和86種真菌(OTUs)，歸屬于子囊菌門、壺菌門、擔子菌門、球囊菌門、接合菌門和未知類型，且豐富度因真菌門類和種植黃花蒿而變化(圖2)。其中，子囊菌門占絕大多數，超過66.10%，在Y1土壤中的相對豐富度高達95.28%。

表1 不同種植年限黃花蒿根際土壤酶活性Table 1 Enzyme activities in rhizospheric soils with A. annua cultivated

注：在同行中，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note：In each row, different small letters indicate significant differences among systems atP<0.05.

圖2 在門水平上，不同種植年限黃花蒿根際土壤中真菌群落組成Fig.2 Phyla in fungal communities in rhizospheric soils with A. annua grown for different yearsA:子囊菌門Ascomycota;B:壺菌門Chytridiomycota;C:擔子菌門Basidiomycota;D:球囊菌門Glomeromycota;E:纖毛亞門Ciliophora;F:后生動物Metazoa;G:接合菌門Zygomycota;H:未分類的真菌Fungi (unclassified).

2.3.2 優勢真菌 在黃花蒿栽培前后的土壤中，前20種優勢真菌的豐富度合計占真菌總量的93.37%以上。黃花蒿種植年限不同，其優勢真菌種(屬)類和豐富度也不一樣(表2)。值得注意的是，與未種植黃花蒿的土壤相比，栽培土壤中仍有14種共有真菌，它們是不可培養的糞殼菌、待定真菌-1、不可培養的皺褶球殼菌、待定糞殼菌、肉座菌目、刺盾炱目、待定子囊菌-1、格孢菌目 IRB20-2、不可培養球囊菌、踝節菌屬、傘菌目、待定傘菌、長喙殼目和柱隔孢屬。

除上述共同存在的真菌之外，在Y0和Y1土壤中，均檢測到待定子囊菌-2；在Y0和Y3土壤中，待定纖毛菌和待定球囊菌相同；在Y0和Y5土壤中，均發現了待定球囊菌。在Y1、Y3和Y5土壤中，均存在待定真菌-3和蒿白粉菌；在Y3和Y5土壤中，均出現了待定真菌-3、蒿白粉菌、艾菊柄銹菌和待定球囊菌。

在黃花蒿栽培前后土壤中，檢測到各自1～3種獨有真菌，它們是Y0土壤中的待定壺菌、待定真菌-2和不可培養接合菌；Y1土壤中的待定座囊菌、座囊菌CRI7和銀耳科；Y3土壤中的待定接合菌門；Y5土壤中的不可培養的刺孢菌和待定球囊菌。

2.3.3 真菌群落組成主成分分析 圖3是黃花蒿種植前后，土壤真菌群落的主成分變異情況。Principal component 1和Principal component 2分別表示不同群落間65.83%和29.12%的變異度。代表Y0、Y1與Y3和Y5土壤真菌群落組成的點在坐標圖中分布距離較遠。其中，Y0位于象限III的左下方，Y1位于象限IV和Y軸右側的X軸上，Y3和Y5分別散落于Y軸左側的X軸上和左上方(象限Ⅱ)。

圖3 不同種植年限黃花蒿根際土壤真菌群落組成主成分分析Fig.3 Principal component analysis of fungal communities in rhizospheric soils with A. annua grown

3 討論

在人工種植黃花蒿的土壤中，微生物生物量碳氮顯著降低，種植時間愈長，降幅越大，說明長期持續種植黃花蒿降低了土壤微生物數量，類似Herrmann等[5]和劉飛等[21]的研究結果。在不同種植年限的黃花蒿根際土壤中，微生物生物量碳氮比相差1.68倍，意味著土壤微生物組成改變，其原因可能是黃花蒿釋放的青蒿素類化合物選擇性地抑制了微生物生長繁殖。據報道，土壤微生物是土壤酶的主要來源，它們的數量和種群結構影響土壤酶活性[22-23]。傅慧蘭等[24]發現，隨種植年限增加，豆科作物根系分泌物在土壤中持續積累，作用于微生物和酶分子空間結構，使脲酶、過氧化氫酶和轉化酶活性降低，酸性磷酸酶活性增強。與之類似，在種植黃花蒿的土壤中，脲酶、脫氫酶和蔗糖酶活性降低；但連續種植3年以上則使酸性磷酸酶活性增強。在持續種植棉花(Gossypiumspp.)、番茄(Lycopersiconesculentum)、辣椒(Capsicumannuum)等的土壤中，土壤微生物和酶活性改變是發生連作障礙的重要原因之一[25-27]。因此，黃花蒿釋放的化感物質影響土壤微生物生物量碳氮和酶活性，可能導致土壤結構形成、養分轉化供應、毒物降解等生物化學過程紊亂，不利于黃花蒿生長發育，使青蒿素含量和產量降低。

土壤真菌是土壤微生物的重要組分，具有多種多樣的生理、生化和生態功能，其內轉錄間隔區(ITS)序列保守性極高，因此，本試驗以此為分子標記，鑒定黃花蒿種植土壤中的真菌種類。結果表明，在不同黃花蒿種植年限的土壤中，真菌門類及優勢真菌的豐富度差異顯著；真菌群落組成主成分變異表明，種植黃花蒿改變了土壤真菌群落組成。但無論是否種植黃花蒿，在土壤前20種優勢真菌中，仍有14種共有真菌，不同種植年限之間僅3～5種真菌不一樣，說明土壤是決定真菌群落組成主導因素，但因種植黃花蒿而發生不同程度地變化。

在種植黃花蒿1年的土壤中，子囊菌門比對照顯著增加，相對豐富度高達95.28%。研究表明，多數子囊菌為植物病原真菌，可造成白術(Atractylodesmacrocephala)、地黃、三七和桔梗(Platycodongrandiflorus)等多種藥用植物發生根腐和莖腐病等[28]。隨黃花蒿種植年限增加，土壤中的球囊菌、座囊菌、接合菌和刺孢菌也逐漸成為優勢真菌。眾所周知，座囊菌易引起香蕉和梨樹等果樹葉斑病；接合菌導致果蔬、食品等霉變腐爛；刺孢菌侵染蘭科作物形成炭疽病[29-30]。所以，連作黃花蒿可能提高某些作物發生真菌病害的幾率。田間調查發現，新地種植黃花蒿，一般很少發生病蟲害；短期連作黃花蒿，根腐病和莖腐病病害危害率為3%～5%，長期連作病蟲害發生率持續上升[31]。在未種植黃花蒿的土壤中，優勢菌株中未檢測到蒿屬的特有病原真菌——蒿白粉菌和艾菊柄銹菌；但種植黃花蒿后，蒿白粉菌和艾菊柄銹菌均成為優勢菌株。通常在連作條件下，某些植物會持續向病原微生物提供特有的營養物質，促進其生長繁殖，造成病害大量發生[32]。Jessing等[7]發現，青蒿素類物質能夠選擇性殺抑土壤微生物，而部分微生物卻以它們為碳源和營養物質。因此，連作黃花蒿持續釋放青蒿素類物質可能促進蒿白粉菌和艾菊柄銹菌生長繁殖，提高相應病害的發生風險。反之，在黃花蒿-馬鈴薯輪作體系中，由于中斷了青蒿素類物質進入土壤，黃花蒿白粉病和莖腐病發生率則顯著下降[33]。

總之，人工栽培黃花蒿顯著降低土壤微生物生物量碳氮，改變土壤酶活性和真菌群落組成，選擇性增加病原菌數量。

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Microbial biomass, enzyme activity and composition of the fungal community in rhizospheric soil cropped with Artemisia annua for several years

LI Qian1,3, YANG Shui-Ping1, CUI Guang-Lin2, HUANG Jian-Guo1*, LI Long-Yun2*, CHENG Yu-Yuan3

1.CollegeofResourceandEnvironment,SouthwestUniversity,Chongqing400716,China; 2.InstituteofChongqingChineseMedicine,Chongqing400065,China; 3.HenanNanyangTobaccoCompany,Nanyang473000,China

Artemisiaannua(Qinghao, Asteraceae) is widely grown in Chongqing, China, for extracting the antimalarial drug, artemisinin. Many research studies focus on the release of allelochemicals into soils via leaching with rainfall percolation, on root exudation, and on decomposition of dead plant residues in the growing process ofA.annuaand on the inhibition of the growth and development of adjacent and subsequent crops by these allelochemicals, particularly artemisinin. Soil microbes play roles in nutrient transformation, organic matter recycling, toxicant decomposition, and hormone efflux, among others. However, little is known about the influence of continuous cultivation of this medicinal plant on soil microorganism populations. Therefore, rhizospheric soils cropped withA.annuafor 1, 3, and 5 years were collected and analyzed by routine methods and Illumina MiSeq pyrosequencing to study microbial biomass, enzyme activity and fungal community components. Microbial biomass carbon (C) and nitrogen (N), and enzyme activities (dehydrogenase, urease and invertase) decreased, while C∶N in microbes varied, and acid phosphatase activity increased in soils with this medicinal plant compared that in the soil without this plant. These results suggest that allelochemicals released fromA.annuainto the rhizosphere inhibited the metabolism, growth and reproduction of microorganisms. Principal component coefficients of fungal communities in soils varied significantly, indicating great changes of fungal community structures. In soil fungal communities, Ascomycota was the largest group, accounting for 66.10%-95.28% of the total taxa detected, and there was a significant change in the abundance of both fungal phyla and the top species duringA.annuacultivation. Among the predominant fungi, 14 species were found in all soils, and only 1-3 unique species existed in each soil, suggesting that the soil was the most important factor governing the composition of the fungal community, but that community structure is also changed byA.annuacultivation.ErysipheartemisiaeandPucciniatanaceti, two pathogenic fungi which only infectA.annua, were found in the soils cropped withA.annua. The presence of these two pathogenic fungi in soils would increase the risk of disease incidence inA.annua. Therefore, rotation is advisable when croppingA.annua. Although our study provided some information about fungal community composition and diversity in the soil cropped withA.annua, a large number of microorganisms detected remain unidentified, and the functions of microbes classified is also not clear. The results confirm that the understanding of soil microbial communities remains very poor. Further study should focus on determining the identity and function of bacterial members of the microbial community, as these could be important in maintaining soil quality and function in cropping systems.Key words:Artemisiaannua; soil enzyme activity; fungi; high throughput sequencing

10.11686/cyxb2016091

http://cyxb.lzu.edu.cn

2016-03-08；改回日期：2016-05-11

國家973計劃項目(2013CB127405)，國家科技惠民計劃項目(2013GS 500102)，重慶市科技研發基地項目(cstc 2014ptyjd10001)，重慶市自然科學基金(cstc2011jjA 0861)和中央高校基金(SWU113094)資助。

李倩(1987-)，女，河南鄭州人，博士。E-mail:qianqingzi@qq.com*通信作者Corresponding author. E-mail: huang99@swu.edu.cn, lilongyun8@163.co

李倩, 楊水平, 崔廣林, 黃建國, 李隆云, 程玉淵. 不同種植年限條件下黃花蒿根際土壤微生物生物量、酶活性及真菌群落組成. 草業學報, 2017, 26(1): 34-42.

LI Qian, YANG Shui-Ping, CUI Guang-Lin, HUANG Jian-Guo, LI Long-Yun, CHENG Yu-Yuan. Microbial biomass, enzyme activity and composition of the fungal community in rhizospheric soil cropped withArtemisiaannuafor several years. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(1): 34-42.