黃芪根際促生菌(PGPR)篩選與特性研究

馬驄毓，張英，馬文彬，李建宏，姚拓*

(1.甘肅農業大學草業學院，草業生態系統教育部重點實驗室，中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070；2.青海大學農牧學院草業科學系，三江源生態與高原農牧業國家重點實驗室，青海 西寧810016)

黃芪根際促生菌(PGPR)篩選與特性研究

馬驄毓1，張英2，馬文彬1，李建宏1，姚拓1*

(1.甘肅農業大學草業學院，草業生態系統教育部重點實驗室，中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070；2.青海大學農牧學院草業科學系，三江源生態與高原農牧業國家重點實驗室，青海 西寧810016)

為獲得黃芪根際PGPR菌株并明確其促生特性，可為其在生產中的應用提供依據，本研究以黃芪的根瘤、根系及根際土壤為材料，利用選擇性培養基分離篩選根瘤菌與溶磷菌，測定根瘤菌固氮酶活性、溶磷菌株的溶磷能力及分泌3-吲哚乙酸(IAA)的能力，從中篩選出綜合性能優良的菌株，并運用生理生化鑒定和16S rDNA分子生物學鑒定相結合的方法鑒定優良菌株的種屬。結果發現，溶磷菌數量的分布具有根系表面(RP)>根表土壤(RS)>遠根土(NRS)>根內(HP)的規律，有明顯的根際效應；經分離純化獲得76 株PGPR菌，其中根瘤菌1株、溶解無機磷菌株42 株和溶解有機磷菌株33 株，其中可分泌IAA能力的溶磷菌株有7株；篩選出綜合性能優良，有進一步開發應用潛力的溶磷菌株7株，根瘤菌1株，經鑒定溶磷菌中3株為Pseudomonassp.，3株為Bacillussp.和1株為Klebsiellaoxytoca，根瘤菌為Rhizobiumsp.，這為研制生物菌肥提供優良菌種，同時豐富優良根際促生菌資源庫。

黃芪；根際促生菌(PGPR)；促生特性；菌株鑒定

黃芪(Astragalusmembranaceus)是常用的大宗中藥材之一，具有利尿消腫、固表補氣、生肌托毒之功效，在臨床各科中都有廣泛的應用，中成藥中，以黃芪為原料的達200余種，因此有“十藥八芪”之譽[1]。國內市場對黃芪的需求量極大，年產量(人工栽培)達230000 t之多，其中用于飲片生產和深加工(包括提取物、制劑、中成藥)各半[2]。我國也是世界上唯一的黃芪出產國和出口國，在國際植物藥材市場上占有重要地位，黃芪是我國中藥材出口中排在1000萬美元的7個品種之首[3]。強勁的需求導致了野生黃芪資源的枯竭，栽培黃芪是目前商品黃芪的主要來源。近些年來黃芪價格居高不下，農民大量施用化肥以追求較高的產量，調查發現，在黃芪主產區甘肅省的渭源、隴西、岷縣、宕昌等地，黃芪種植過程化肥施用量普遍很大，這不僅推高了生產成本，而且大量的化肥施用造成土壤板結、土壤功能退化以及微生態失調，影響了可持續發展；此外，化學肥料的大量使用也為藥品安全帶來了巨大的隱患。因此，探尋其他更為安全環保的增肥劑以部分替代化肥的作用，實現高效益的循環農業已迫在眉睫。

近些年研究表明，植物根際促生菌(plant growth promoting rhizobacteria，簡稱PGPR或促生菌)不但可以固定空氣中的氮氣，同時一些菌還兼具溶解土壤中不能被植物直接利用的磷元素，分泌植物生長調節物質，促進植物根系生長和礦物質吸收，增強植物抗病性的功能[4]。用從不同環境、不同植物群落根際分離獲得的特定促生菌株生產的生物菌肥與化肥相比具有成本低、使用安全、持續效果好、增產穩定、非再生能源消耗少、經濟效益高、無環境和食品污染等優點，同時，還可改善土壤結構、提高土壤有機質含量和改良鹽堿地[5-6]。縱觀世界生物肥料研究與應用現狀，發達國家(如美國)仍然是世界上研究、生產和使用生物肥料的大國。我國化肥年產量、總產量和單位面積使用量均居世界第一，而微生物肥料年生產量不足化肥的1‰，且品種單一。雖然國外已有規模化的促生菌肥產品，但不同生境的植物根際生存著不同的菌株，而不同菌株對環境的適應性不同。因此，只能借鑒國外的成功經驗，從我國特定氣候、植物及生境中不斷地分離篩選高效菌株，以生產出適合我國特定氣候、植物及生境的生物菌肥[7-9]。

綜上所述，篩選黃芪根際PGPR菌，并將其運用于黃芪專用生物肥料的研制和生產，不僅對促進我國黃芪種植業發展具有重要意義，而且對發展綠色農業，保護生態環境具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

黃芪，選取隴芪一號。樣品采集于2014年7月，采樣地位于甘肅省渭源縣會川鎮。采集生長健壯、無病蟲害、結瘤正常且呈粉紅色的黃芪根瘤及黃芪根際(根系和土壤)樣品，裝入無菌采樣袋中低溫運輸至實驗室立即進行PGPR 菌株分離。

1.2 培養基

LB(Luria Bertani)培養基用于分離和保存根際細菌[10]；酵母菌形態瓊脂(YMA)培養基用于根瘤菌的分離與純化[11]；PKO(Pikovskaya)培養基用于溶解無機磷菌株的分離與純化[12]；蒙金娜有機磷培養基用于溶解有機磷菌株的分離與純化[10,13]；纖維素(CCM)培養基用于植物生長激素(IAA)的測定[12,8]。具體組成如下：

LB培養基組成：蛋白胨 10 g；NaCl 5 g；酵母膏 5 g；瓊脂 18 g；總體積1000 mL；pH 7.0～7.2。

YMA培養基配方：CaCO33 g；K2HPO40.5 g；酵母粉 1 g；NaCl 0.1 g；MgSO4·7H2O 0.2 g； 甘露醇 10 g； 0.25%剛果紅10 mL；瓊脂(agar) 18 g；總體積1000 mL；pH 7.0～7.2。

PKO無機磷培養基組成：NaCl 0.5 g；KCl 0.2 g；MgSO4·7H2O 0.1 g；Ca3(PO4)23 g；(NH4)2SO40.1 g；FeSO4(微量)0.004 g/L；MnSO4(微量)0.004 g/L；蔗糖 10 g；酵母膏 0.5 g；瓊脂(Agar)18 g；總體積 1000 mL；pH 7.0～7.2。

蒙金娜有機磷培養基組成：葡萄糖(glucose) 10 g； (NH4)2SO40.5 g； NaCl 0.3 g； KCl 0.3 g； FeSO4·7H2O 0.03 g；MnSO4·4H2O 0.03 g；蛋黃卵磷脂(lecithin) 0.2 g；CaCO35 g；酵母膏(yeast extract paste) 0.4 g；瓊脂(agar) 18 g；總體積 1000 mL；pH 7.0～7.5。

CCM培養基及組成：MgSO4·7H2O 0.2 g； KH2PO40.2 g；甘露醇5 g； K2HPO40.8 g； CaCl2·2H2O 0.06 g；蔗糖5.0 g；NaMoO4·2H2O 2.5 mg；酵母粉 0.1 g；乳酸 0.5 mL；NaCl 0.1 g；1.64%乙二胺四乙酸鈉鐵(Na·Fe·EDTA) 4 mL；總體積 1000 mL；pH 7.0(注：滅菌時將MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O和EDTA分開滅菌，否則會產生沉淀)。

1.3 根瘤菌分離純化

將所采集新鮮的黃芪根瘤置于培養皿中，用無菌水洗凈，用0.1%升汞消毒3 min后，用無菌水沖洗3～4次，用扁平的鑷子壓破上述滅過菌的根瘤，在YMA平板上點接或劃線后，將培養皿置于28 ℃培養箱中倒置培養，分離得到的菌株進一步純化保存于冰箱中備用。

1.4 根瘤固氮菌固氮特性測定

色譜條件：玻璃柱內徑 0.4 cm，長2 m，擔體為 GDX-502，檢測器溫度 170 ℃，進樣器溫度 150 ℃，柱溫 180 ℃，氣體流量：空氣 0.15 kg/cm，N20.3 kg/cm，H20.08 kg/cm，檢測器為氫火焰離子化檢測器(FID)。

根瘤樣品測定：用橡膠塞封口裝有約0.2～1.0 g新鮮根瘤的小玻璃瓶。先用注射器從瓶中抽出1 mL空氣，再向瓶中注入1 mL乙炔氣。在28 ℃條件下使根瘤與乙炔氣體反應1 h后。用微量進樣器從每個小瓶中抽取50 μL氣體注入氣相色譜儀(GC 7890F)。測定后稱取根瘤重量。

酶活計算：乙炔還原活性測定固氮酶活性，也稱ARA法[14]。

1.5 溶磷菌分離純化

將根際分為4個部分，即根表土壤(soil adhering to roots, RS)、根系表面(rhizoplan or surface of roots, RP)、遠根土(soil away from roots, NRS)與根內(histoplan or interior of roots, HP)4個區域[12]。

稱取樣品2 g，置于50 mL離心管中，注入18 mL 0.85% 無菌生理鹽水，振蕩2 min并靜置后即為10-1根表土壤稀釋液，然后依次制備成濃度為10-3、10-4及10-5的稀釋液，備用。

用微量移液器分別吸取50 μL上述已制備好的4個根系區域的10-3、10-4和10-5稀釋液，接種于滅菌的PKO平板培養基上，立即用無菌玻璃涂布器涂抹均勻，每區域的每個濃度均重復3次。28 ℃培養5～7 d后觀察，用接種針挑取具有溶磷透明圈的菌落在PKO平板上以劃線法純化細菌，并在LB斜面培養基上接種于4 ℃冰箱中保存。

1.6 溶磷菌溶磷能力測定

1.6.1 定性測定 將活化后的菌株點接種于PKO固體培養基上，于28 ℃恒溫培養，在7～10 d時觀察每菌株是否出現溶磷透明圈，并測量每菌株溶磷圈直徑(diameter of phosphate solution, D)和菌落直徑(diameter of colony, d)的比值(D/d)，由比值大小初步判定菌株的溶磷能力。

1.6.2 定量測定 在已滅菌的PKO培養液中接種0.5 mL各菌株菌懸液(OD值為0.5)。每菌株3 次重復，不接種為對照。28 ℃、140 r/min振蕩培養12 d后，用酸度計測定各個培養液pH 值，后將培養液在10000 r/min、4 ℃離心15 min后，取其上清液5 mL于150 mL錐形瓶中并加入45 mL 0.5 mol/L NaHCO3和約1.5 g無磷活性炭，封口振蕩 30 min，無磷濾紙過濾。在50 mL容量瓶中加入濾液1 mL、0.5 mol/L NaHCO35 mL以及蒸餾水約30 mL，最后加入5 mL鉬銻抗顯色劑，定容搖勻。顯色30 min后，進行比色，測定700 nm下的吸光度，計算磷濃度(μg/mL)。

1.7 溶磷菌分泌植物激素(IAA、GA)能力測定

配制含1 g/L 硝酸銨和100 mg/L 色氨酸的CCM 液體培養基，分裝于150 mL 錐形瓶中，滅菌后接種供試菌株的菌懸液(108cfu/mL)1 mL，每菌株重復3次，不接種為對照。將接種后的培養液于28 ℃，125 r/min搖床上培養12 d待用。

1.7.1 定性測定 在白色比色板上滴加上述培養液50 μL，加等量的Spot 比色液，另取50 μL IAA標樣(50 μg/mL)與等量比色液混合作為對照。比色板在黑暗條件下靜置10 min后觀察混合液顏色變化。與對照相比(對照為粉紅色)，若出現粉紅色，說明菌株具有分泌IAA能力，且顏色越深，其分泌IAA的能力相對越強；否則判定菌株不具有分泌IAA能力。

1.7.2 定量測定 將培養液于4 ℃，10000 r/min下離心10 min，收集上清液于錐形瓶中，調pH值至2.8。用乙酸乙酯萃取后轉入50 mL磨口燒瓶中，置于30 ℃真空蒸發濃縮近干，用甲醇溶解并定容至2 mL。0.45 μm有機系濾膜后于液相色譜儀上測定。色譜條件：溫度 25 ℃；流動相為甲醇∶0.6%乙酸 (45∶55，V/V)(使用前過0.45 μm有機系濾膜)；流速0.6 mL/min；紫外檢測波長254 nm，進樣量10 μL。色譜柱：ZORBAX SB-C18 柱，規格：4.6 mm×150 mm，填料細度：5 μm。

標準曲線的制作：配制不同濃度混合標準溶液。配制的標液經0.45 μm有機系濾膜過濾，進樣10 μL，獲得不同濃度時IAA 和GA的峰面積并繪制標準曲線。

1.8 PGPR菌株鑒定

1.8.1 溶磷菌形態觀察 將供試菌株接種于LB培養基表面，30 ℃培養，觀察記錄各細菌菌落形狀、大小、生長速度、顏色及邊緣形狀度等特征。

1.8.2 細菌生理生化特性測定 細菌生理生化測定方法參考文獻[15-17]。

1.8.3 細菌16S rDNA分子生物學鑒定

1)細菌總DNA的提取：參照試劑盒說明書方法。

2)DNA濃度的測定：紫外分光光度法。

3)DNA純度分析：瓊脂糖凝膠電泳法。

4)16S rDNA擴增。選用擴增引物：選取16S rDNA擴增的通用引物27F-1492R(由上海生工生物科技公司合成)，其序列分別為27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，1492R：5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3；PCR 擴增條件：擴增反應由梯度PCR儀完成；反應體系及反應程序參考馬文彬[15]；檢測擴增產物：由瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物；序列測定：擴增產物的測序工作由上海生工生物科技公司完成。

5)DNA序列分析：將測得的序列在 NCBI 數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)中用 megablast進行相似性搜索，與已報道細菌菌株的 16S rDNA 序列進行同源性比較，并利用MEGA 5.0 生物學軟件構建進化距離樹圖，用 Neighbor-Joining 法進行系統發育分析。

1.9 數據處理

采用 Excel 2007進行數據整理及制圖，采用 SPSS 17.0進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 黃芪根瘤及溶磷菌的分離純化

如表1所列，利用YMA培養基從黃芪根瘤中分離得到1株根瘤菌優勢菌株，同時利用PKO 和蒙金娜選擇培養基從黃芪根際分離出了生長速度快、菌落較大，且具有溶解有機磷、無機磷功能的菌株。純化后獲得菌株76株，其中根瘤菌1株，溶解無機磷菌株42株，溶解有機磷菌株33株。除根瘤菌外，其余菌株在根際不同部位數量不同，但均表現出根表(RP)>根表土(RS)>遠根土(NRS)>根內(HP)的數量分布規律，即表現出很強的根際效應。

表1 黃芪根際促生菌株來源及分布Table 1 Source and distribution of A. membranaceus rhizosphere strains

2.2 根瘤固氮酶活性

圖1 乙烯標準曲線Fig.1 Standard curve of C2H4

如圖1所示，用不同濃度的乙烯混合氣體作為橫坐標，峰面積值作為縱坐標作圖，得到下列乙烯標準曲線。其中回歸方程為y=15078x-17177，相關系數值為0.9999，說明此測量值與擬合得到的公式之間的接近程度較好，公式較可靠。黃芪植株根瘤顏色呈粉紅，說明其為有效根瘤。通過乙炔還原法測定根瘤固氮酶活性為11.21 μmol C2H4/(g·h)。

2.3 溶磷菌溶磷能力

2.3.1 菌株溶解無機磷能力 選取溶磷圈較大，生長速度較快的16株菌株，測定其溶磷量并研究其溶解無機磷的能力。結果如表2所列，通過溶磷圈法定性測定菌株的溶磷圈大小發現，各菌株D/d值在1.89～3.61之間，D/d值最大的菌株為HRW-31，達3.61，最小的菌株是HRW-14，其D/d值僅為1.89。利用鉬銻抗比色法對磷進行定量測定的結果也發現供試的16株菌均具有溶解無機磷的能力，不同菌株的溶磷能力不同，溶磷量在45.21～423.84 μg/mL之間，各菌株溶磷能力差異顯著(P<0.05)。其中溶磷量最大的是菌株HRW-41，達423.84 μg/mL，溶磷量最小的是菌株HRW-14，其溶磷量為45.21 μg/mL。

注：D/d為溶磷圈直徑比菌落直徑。下同。

Note: D/d means ratio of phosphate solution diameter and colony diameter. The same below.

2.3.2 菌株溶解有機磷能力 選取溶磷圈較大，生長速度較快的10株菌進行進一步的實驗，研究其溶解有機磷的能力。通過測定分離自黃芪根際的溶有機磷菌的溶磷量，結果表明(表3)，通過溶磷圈法定性測定菌株的溶磷圈大小發現，各菌株D/d值在1.36～3.65之間，D/d值最大的菌株為HRY-7，達3.65，最小的菌株是HRY-12，其D/d值僅為1.36。定量測定的結果也發現供試的10株菌均具有溶解有機磷的能力，不同菌株的溶磷能力不同，溶磷量為5.92～31.52 μg/mL之間，各菌株溶磷能力差異顯著(P<0.05)。其中溶磷量最大的菌株為HRY-7，達31.52 μg/mL，最小的菌株是HRY-12，為5.92 μg/mL，這一趨勢與D/d的一致。

表3 菌株溶解有機磷能力測定Table 3 Capacity of strains on organic culture medium

表4 溶磷菌株分泌IAA和GA的數量Table4 ConcentrationofIAAandGAofphosphatesolubilizationstrains菌株號Strains顯色反應Chromogenicreaction3-吲哚乙酸IAA(μg/mL)赤霉素GA(μg/mL)HRW-12---HRW-13+-8.02HRW-16+++15.9210.84HRW-31++21.627.21HRW-36+14.57-HRW-41+++9.82-HRW-24---HRY-1+++28.519.52HRY-7++12.348.52HRY-28--- 注:IAA顯色反應中,-、+、++和+++符號表示不顯色、淺紅色、粉紅色和深紅色。 Note:-,+,++and+++indicatenocolourandredcolourtakeitsturesfromlighttoheavy.

2.4 溶磷菌分泌IAA和GA

選取溶磷能力較好的10株菌株,利用Spot比色法和高效液相色譜法測定其分泌IAA、GA能力。結果表明(表4),利用比色法測定有7株供試菌株出現了顯色反應,其中有6株具分泌IAA能力,5株具分泌GA能力。但并不是所有顯色反應的菌株均具分泌IAA能力;不同菌株分泌IAA量及GA量不同,其中有4株菌既具有分泌IAA能力,也兼具分泌GA 的能力。

2.5 菌株鑒定結果

2.5.1 生理生化鑒定結果 綜合上述試驗結果,選取總體性能較好的7株溶磷菌HRW-13、HRW-16、HRW-31、HRW-36、HRW-41、HRY-1、HRY-7及1株根瘤菌H-GL進行鑒定。根據生理生化實驗結果,結合菌株革蘭氏染色特性、菌落特征(表5～7),查閱《伯杰細菌鑒定手冊》[16]以及《常見細菌系統鑒定手冊》[17]得到結果,經鑒定HRW-13、HRW-31、HRW-41為假單胞菌屬(Pseudomonas sp.),HRW-16、HRW-36和HRY-7為芽孢桿菌屬,HRY-1暫無法確定,H-GL為根瘤菌屬。

2.5.2 分子生物學鑒定結果 綜合生化實驗結果和分子鑒定結果，發現本研究中所分離的菌株形態及生化鑒定結果和分子鑒定結果能很好地吻合，說明本研究的鑒定結果準確可靠。鑒定結果如表8和圖2、3所示，H-GL為根瘤菌屬(Rhizobiumsp.)，7株溶磷菌分別屬于3個屬6個種，其中，HRW-13、HRW-31和HRW-41為假單胞菌屬，HRY-7、HRW-36和HRW-16為芽孢桿菌屬(Bacillussp.)，HRY-1為克雷伯菌(Klebsiellaoxytoca)。

表5 各菌株的表型特征及革蘭氏染色結果Table 5 Colony morphologies and gram staining of strains

注：革蘭氏染色法中，G+表示陽性、G-表示陰性。

Note: G+means positive and G-means negative in Gram staining method.

表6 菌株生理生化反應結果(一)Table 6 Physio-biochemical characteristics of strains (1)

注：表格中的符號與《伯杰氏細菌鑒定手冊(第八版)》和《常見細菌鑒定手冊》保持一致，“+”代表該反應為陽性，“-”代表該反應為陰性。下同。

Note: Symbols in the table as same as Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology (eighth edition) and Common Bacteria Identification Manual, “+” on behalf of the reaction is positive, “-” on behalf of the reaction is negative. The same below.

表7 菌株生理生化反應結果(二)Table 7 Physio-biochemical characteristics of strains (2)

表8 優良PGPR菌株鑒定結果Table 8 Identification of PGPR

圖2 所分離的根瘤菌株分子系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of the isolated rhizobium strains

圖3 所分離的溶磷菌株分子系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of the isolated phosphate solubilizing bacteria strains英文名稱后的序號為登錄號。The serial number which were in the back of English names were accession number.

3 討論

國內外的很多研究者在篩選高效溶磷菌株的過程中，以溶磷圈的有無及大小為標準判斷菌株溶磷能力的有無及高低[18-19]。但本研究中發現，溶磷圈的大小和溶磷量不完全呈正相關，也有學者研究中發現了相似的現象[10,20-22]，分析其原因是菌株的溶磷機理的復雜性[23]，溶磷圈的出現主要是體現溶磷微生物產酸而造成的，現有研究表明，產酸是微生物溶磷的主要途徑[24]，產生的酸性物質包括葡萄糖酸、2-酮戊二酸、乳酸、草酸、氨基酸、延胡索酸、蘋果酸、檸檬酸和琥珀酸等有機酸[25]和H2S、H2SO4等無機酸[26]，在酸類物質作用下，培養基中Ca3(PO4)2或CaCO3等成分溶解，出現溶磷圈；但除了產酸外，微生物還通過酶解作用和蛋白質作用[27]溶解土壤中的難溶性磷，因此，溶磷圈的大小并不能完全反應溶磷能力的高低。本研究中，以溶磷圈法作為定性測定，鉬銻抗比色法作為定量測定，兩個相結合，來確定菌株的溶磷能力，能降低誤差。

土壤中生存有多種根瘤菌，豆科植物根際也有大量根瘤菌，對根瘤菌的分離方法有多種，但是最直接有效的分離方法則是采集生長良好的豆科植物，選取個大、飽滿并帶粉紅色的根瘤在相應的培養基上進行分離，本研究利用該方法從黃芪根瘤中分離出1株根瘤菌。由于利用豆科共生固氮的植物種類只占豆科植物種類的1%，而其中僅對15%的種進行過結瘤調查[28]，因此，豆科植物優良根瘤菌的選育以及開發利用未知的根瘤菌資源具有巨大潛力。

本研究在分離、純化具有固氮能力、溶解無機磷和溶解有機磷能力菌株時，發現各菌株數量均表現出“根表>根表土>遠根土>根內”的根際分布趨勢，此研究結果與馬文文等[29]、張英[30]以及趙小蓉等[20-21]的研究結果相一致，由此說明PGPR菌株在土壤中的數量除了受土壤理化性質、肥力、類型及其耕作措施等因素外，PGPR菌的分布同時也受植物強烈的根際效應的影響。據此可以推測，不同植物根際促生菌的組成必然不同，因此，要開發效果良好的促生菌產品，就必須從相應環境中相應植物的根際分離，當然，選育出適應性廣的優良菌株也是一個好的研究方向。

除本研究的固氮、溶磷、分泌生長素等功效外，PGPR另外一個重要的功能就是用于防治農作物病害[31]。用于生防研究的細菌中，假單胞桿菌(Pseudomonassp.)是研究報道最多的一種生物防治細菌，它們大量存在于植物根際，繁殖迅速、能分泌嗜鐵素和抗生素，而成為植物位點和空間微環境的有力競爭者，從而對多種植物病原菌有抑制作用。孫廣正等[31]研究發現促生菌LHS11對黃瓜枯萎菌(Fusariumoxysporiumf. sp.cucumerinum)、西瓜尖鐮孢菌(Fusariumoxysporumf.niveum)抑制效果達80%以上，具有較好的應用潛力。而本研究分離出的Pseudomonassp.和Bacillussp.，參考前人文獻推測其有拮抗病原菌的潛力，這一方面研究將是下一步工作的重點。此外，本研究中分離獲得一株只在韓國土壤環境中發現的韓國叢毛假單胞菌(Pseudomonaskoreensis)，這證明該種群具有更廣泛的地理分布性[32]。

4 結論

黃芪根際有大量PGPR菌，分布特征表現出根表(RP)>根表土(RS)>遠根土(NRS)>根內(HP)的根際效應；最終獲得76 株PGPR菌，其中根瘤菌1株，溶解無機磷42 株，有機磷33 株；優良菌株中，有分泌IAA能力的菌株7株。篩選出綜合性能優良，有進一步開發應用潛力的菌株7株，經鑒定其中3株為Pseudomonassp.，3株為Bacillussp.，Klebsiellaoxytoca1株；黃芪PGPR菌分布呈根際效應，最終篩選出7 株綜合性能良好、有進一步開發利用價值的PGPR。

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Identification of plant growth promoting rhizobacteria Astragalus membranaceus and their effectives

MA Cong-Yu1, ZHANG Ying2, MA Wen-Bin1, LI Jian-Hong1, YAO Tuo1*

1.CollegeofPratacultureScience,GansuAgriculturalUniversity；KeyLaboratoryofGrasslandEcosystem,MinistryofEducation；Sino-U.S.CentersforGrazinglandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China; 2.DepartmentofGrasslandScience,AgricultureandAnimalHusbandryCollege；StateKeyLaboratoryofPlateauEcologyandAgriculture,QinghaiUniversity,Xining810016,China

In order to obtain and study the performance of plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) inAstragalusmembranaceus, the root nodule, root morphology and rhizosphere soil ofA.membranaceuswere collected. Strains of rhizobium and phosphate solubilizing bacteria were isolated and assessed for the potentially useful characteristics of high nitrogenase activity in the rhizobium and high phosphate solubilisation and ability to secrete 3-indoleacetic acid (IAA) in the phosphate solubilizing bacteria. Potential PGPR strains were then identified using physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence analysis. Results showed there are large amounts of phosphorus-dissolving bacteria in the rhizospheres ofA.membranaceus. The quantitative distribution of bacteria and PGPR shows a strong rhizosphere effect, with rhizosplan or surface of roots (RP)>soil adhering to roots (RS)>soil away from roots (NRS)>histoplan or interior of roots (HP). We have isolated 76 PGPR strains, composed of 1 rhizobium, 42 inorganic phosphate solubilizing and 33 organic phosphate solubilizing bacteria strains. There are 7 phosphate solubilizing strains with the ability to secrete IAA. A further 8 potential PGPR strains were identified (1 rhizobium and 7 phosphate solubilizing). 3 phosphate solubilizing strains were identified asPseudomonassp., 3 phosphate solubilizing strains asBacillussp., 1 phosphate solubilizing strain asKlebsiellaoxytoca, 1 rhizobium strain asRhizobiumsp. This study has identified potential PGPR for the development of microbial fertilizers forA.membranaceus.

Astragalusmembranaceus; plant growth promoting rhizobacteria (PGPR); characteristics of the growth; strains identification

10.11686/cyxb2016263

http://cyxb.lzu.edu.cn

2016-06-27；改回日期：2016-10-19

國家自然基金(31360584和31260025)資助。

馬驄毓(1987-)，女，甘肅蘭州人，在讀博士。E-mail:1401893955@qq.com*通信作者Corresponding author. E-mail: yaotuo@gsau.edu.cn

馬驄毓, 張英, 馬文彬, 李建宏, 姚拓. 黃芪根際促生菌(PGPR)篩選與特性研究. 草業學報, 2017, 26(1): 149-159.

MA Cong-Yu, ZHANG Ying, MA Wen-Bin, LI Jian-Hong, YAO Tuo. Identification of plant growth promoting rhizobacteriaAstragalusmembranaceusand their effectives. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(1): 149-159.