糖皮質激素受體與炎癥反應

劉瑜 楊翔 萬文輝

糖皮質激素受體與炎癥反應

劉瑜 楊翔 萬文輝

糖皮質激素(glucocorticoid,GC)是由腎上腺皮質束狀帶分泌的一類甾體激素,具有調節糖、脂、蛋白質合成與代謝,抑制免疫應答，抗炎、抗應激等重要作用。目前臨床上廣泛使用GC治療炎癥和免疫性疾病,如類風濕性關節炎、支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾病、炎癥性腸病、器官移植后等[1]。GC在體內的作用主要是通過糖皮質激素受體(glucocorticoid receptor, GR)介導的。GR屬于核受體超家族成員,其本質是配體依賴的轉錄因子,活化后的GR在細胞核內通過與DNA上的反應元件直接結合或作用于其他轉錄因子來促進或抑制靶基因轉錄,后者通過阻斷炎癥和免疫反應過程中相關靶基因的轉錄,抑制炎性細胞因子表達,在抗炎、調節免疫中具有重要作用[2]。臨床中GC治療存在許多不良反應,如高血壓、糖代謝異常、骨質疏松等[3-4]。因此,深入了解GR及其對靶基因的調控機制,尤其是轉錄抑制機制,將為改善GC治療效果,減少其不良反應提供新的思路。

1 GR概述

1.1 GR的基本結構 GR廣泛表達于人體組織細胞中,具有核受體的典型結構(圖1):(1)N端的轉錄激活域1(activation function 1, AF1),此區保守程度較低,具有非配體依賴的轉錄調節功能,也是GR翻譯后修飾的主要部位;(2)高度保守的DNA結合域(DNA binding domain, DBD),該區含有2個鋅指結構,能夠特異地與靶基因上的GC反應元件(glucocorticoid response element, GRE)結合;(3)鉸鏈區(hinge);(4)高度可變的配體結合域(ligand binding domain, LBD),除與特異配體結合外,此區還在受體的二聚化、亞細胞定位、輔調節因子的結合等中具有重要作用;(5)轉錄激活域2(activation function 2, AF2),具有配體依賴的轉錄調節功能[5-7]。

圖1 GR基本結構

1.2 GR的分類 GR基因位于染色體5q31-q32,含有9個外顯子,全長大約80 kb。根據對第9個外顯子mRNA剪切方式的不同,產生α、β 2種異構體。在mRNA 水平上,GRα和GRβ都包含第1～8外顯子,不同之處為GRα包含9α外顯子,GRβ包含9β外顯子。GRα在幾乎所有組織和細胞中均有表達,其含量也遠遠超過GRβ,因此GC的作用主要是通過GRα介導的。GRβ主要位于細胞核內,其生理作用還不明確。GRβ不能與GC結合但可以和DNA結合,從而干擾GRα與DNA的結合,因此GRβ可能是內源性的GRα抑制劑,其過量表達可導致GC抵抗。選擇性的表達GRβ還能夠獨立調節某些基因轉錄,說明其還具有一定的生理功能。此外,還有另外3種GR異構體GRγ、GR-A、GR-P被報道,其作用不明確,可能與GC抵抗有關[8-10]。

根據翻譯起始位點的不同,GRα還存在8個亞型:GRα-A、GRα-B、GRα-C1、GRα-C2、GRα-C3、GRα-D1、GRα-D2、GRα-D3。同樣的,GRβ分為GRβ-A、GRβ-B、GRβ-C1、GRβ-C2、GRβ-C3、GRβ-D1、GRβ-D2、GRβ-D3 8種亞型。不同亞型的存在可以部分解釋為何GR能發揮多種生理及藥理作用[5]。

1.3 GR的一般功能 正常生理條件下GR位于細胞漿內,與熱休克蛋白(heat shock protein, HSP)復合體結合而處于失活狀態,一旦與激素結合，則受體構型發生改變,與HSP復合體解離被激活,活化后的受體移位至細胞核內,通過以下方式調節靶基因轉錄:(1)直接與靶基因中的GRE結合;(2)與其他轉錄因子相互作用,改變其對靶基因的調節;(3)直接與DNA結合并與鄰近的轉錄因子作用,即所謂的混合調節[5]。GRE是位于靶基因啟動子或增強子的一段特異性核苷酸序列,能與GR特異性結合并介導GR的轉錄調節活性[11]。一般情況下,活化的GR與GRE結合后募集細胞核內的輔激活因子(co-activator)而促進靶基因轉錄。輔激活因子是細胞核內的一大類蛋白質,具有組蛋白乙酰轉移酶(histone acetyltransferase,HAT)活性,多以復合物形成存在,如SRC/p160蛋白家族和CBP/p300家族等。輔激活因子轉錄激活的機制主要有:(1)通過組蛋白乙酰化促進DNA與組蛋白分離,使DNA更易于接近轉錄因子;(2)通過蛋白質之間的相互作用,作為轉錄因子和基本轉錄復合物之間的橋梁激活轉錄[12]。GR與GRE結合后還能募集細胞核內的輔抑制因子(co-repressor)而抑制靶基因轉錄,這種GRE稱為負性GRE(negative GRE, nGRE)[13]。同樣,輔抑制因子也是細胞核內一大類蛋白質復合物,因具有組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, HDAC)活性,能使組蛋白去乙酰化,增強組蛋白與DNA的結合,使染色質重趨緊密而不利于轉錄,如NCoR、SMRT蛋白家族等,此種作用與臨床GC治療不良反應的產生有關,如抑制骨鈣蛋白的產生可導致骨質疏松[14]。GR還能通過作用于其他轉錄因子而間接阻斷靶基因的轉錄,如與核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)、活化蛋白-1(activator protein-1, AP-1)作用，抑制它們在炎癥反應過程中對促炎靶基因的轉錄,包括細胞因子、趨化因子、黏附分子、炎癥性酶和受體等,被稱為反式抑制作用(transrepression),這是GC發揮抗炎作用的主要機制[15-16]。

2 GR與抗炎作用

2.1 反式抑制作用 天然免疫是機體抵抗病原微生物感染的第一道防線,當病原體侵入機體后,通過天然免疫細胞(樹突狀細胞、巨噬細胞、中性粒細胞等)的模式識別受體(pattern recognition receptor, RRR)識別入侵的病原體相關分子模式(pathogen associated molecular pattern, PAMP),通過復雜的細胞內信號轉導通路,最終導致細胞核內信號依賴的轉錄因子如NF-κB、AP-1等的激活。活化的轉錄因子與輔激活因子相結合,共同作用于靶基因的啟動子或增強子,促進炎性因子的生成,參與機體的免疫反應,并最終激活機體的獲得性免疫[17]。

NF-κB是炎癥信號轉導通路中一個重要的轉錄因子,人體內最常見的NF-κB是p65與p50組成的異二聚體。在生理狀態下,NF-κB和抑制蛋白(inhibitor of κB, IκB)形成復合體,以無活性形式存在于胞漿中。當細胞受炎癥刺激后,通過MAPK等信號轉導通路導致IκB激酶復合體(IκB kinase, IKK)活化,使得IκB磷酸化而被降解,NF-κB游離并迅速移位到細胞核,誘導相關基因轉錄,包括:腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素(IL)-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、趨化因子、黏附分子、集落刺激因子等[18]。GR通過以下機制抑制NF-κB的轉錄激活:(1)與p65亞單位結合,阻斷NF-κB與靶基因的結合;(2)與GR反應蛋白-1(GR interaction protein-1, GRIP-1)結合,使得輔激活因子干擾素調節因子3(interferon regulatory transcription factor 3, IRF3)不能與p65亞單位結合;(3) 阻斷正性轉錄延伸因子b(positive transcription elongation factor b, pTEFb)的募集，pTEFb可使轉錄過程中RNA聚合酶Ⅱ磷酸化而促進其轉錄延伸活性，GR通過阻斷pTEFb抑制靶基因轉錄延長;(4)募集具有HDAC活性的輔抑制因子使得染色質致密卷曲而抑制靶基因轉錄;(5)與NF-κB競爭與輔激活因子CPB/p300結合,抑制轉錄起始;(6)與腫瘤抑制蛋白p53相互作用;(7)上調IκB表達,使NF-κB失活;(8)誘導絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1(MAPK phosphatase-1, MKP-1)的產生，使p38失活,阻遏MAPK信號轉導通路,抑制IκB降解和NF-κB活化[19-20]。

AP-1屬于堿性亮氨酸拉鏈轉錄因子,人體內AP-1以二聚體形式存在,最常見的為cJun-cFos異二聚體。環境應激、炎性因子等的刺激通過MAPK信號轉導通路激活AP-1,活化的AP-1作用于靶基因中的佛波酯反應元件或cAMP反應元件,調控多種因子,如IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8等的表達[21]。GR抑制AP-1轉錄活性的作用機制與NF-κB類似:(1)直接與AP-1的c-Jun相互亞單位結合,阻斷AP-1與靶基因的結合;(2)與靶基因上的GRE結合并與AP-1的c-Jun相互作用;(3)誘導MKP-1的產生，使得JNK失活,阻遏MAPK信號轉導通路,降低AP-1轉錄活性[19-20]。

2.2 直接轉錄調控作用 GR活化后還能通過激活抗炎基因的轉錄而發揮抗炎作用,除了前述的ⅠκB、MKP-1外,還有膜聯蛋白 A1(annexin A1, AnxA1)、血清白細胞蛋白酶抑制劑(secretory leukoprotease inhibitor, SLPI)、糖皮質激素誘導亮氨酸拉鏈蛋白(glucocorticoid-induced leucine zipper protein,GILZ)、IL-10、IL-1受體Ⅱ型、β腎上腺素能受體等[21]。

2.3 轉錄后水平調控作用 盡管GR的抗炎作用主要是在轉錄水平上進行的,但有研究發現,GR還可通過降低mRNA的穩定性來抑制炎癥因子如COX-2、TNF、血管內皮生長因子、干擾素β、IL-1、IL-5、IL-6、誘導型一氧化氮合酶和一些趨化因子等的表達。這些因子的mRNA在3’非翻譯區具有富含腺嘌呤/尿嘧啶的元件(adenylate/uridylate-rich elements, ARE),能夠與ARE結合蛋白如鋅指蛋白36(tristetraprolin, TTP)發生特異性結合。TTP能夠降低mRNA的穩定性，促進mRNA降解。GR能上調TTP表達,減少上述炎性因子的產生，從而發揮抗炎作用[22-23]。

3 GR與促炎作用

研究表明,在不同的激素作用時間和機體免疫狀態下,GC還可發揮不同的效應,例如在長期慢性病程中,GC主要發揮抗炎抗免疫作用,而在急性狀態下,GC則能提高機體的免疫反應而具有促炎作用。例如GC能夠加重遲發型過敏反應的外周免疫反應;急性應激中隨著GC分泌增加,中樞神經系統內促炎因子IL-1β水平升高[24]。GC促炎機制還不清楚。研究發現,GR活化后能夠與TNF-α協同促進NF-κB、信號轉導和轉錄激活因子(signal transducer and activator of transcription, STAT)與Toll樣受體2(Toll-like receptor 2, TLR2)啟動子上的反應元件結合,上調TLR2表達。TLR2屬于RRR,能夠識別細菌細胞壁中的肽聚糖。TLR2激活后通過下游的信號轉導通路,激活促炎轉錄因子,最終導致促炎細胞因子IL-6、IL-8等的分泌增加[25]。同樣,GR活化后還能與IL-6家族成員——白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor, LIF)協同上調天然免疫反應和急性期反應中多種基因的表達[26]。GR還能誘導核苷酸結合寡聚化結構域(nucleotide-binding oligomerization domain,NOD)樣受體(NOD-like receptor,NLR)家族成員NLR熱蛋白結構域亞家族成員3(NLR pyrin domain-containing 3,NLRP3)的表達。NLRP3是巨噬細胞中炎癥小體的核心成分,其表達上調后能夠增加巨噬細胞對細胞外有害刺激信號的敏感性,NLRP3炎癥小體活化本身還可導致caspase-1自身裂解和活化,促進IL-1β的表達和分泌,增強機體的免疫炎癥反應[27]。此外,GR還能上調嘌呤受體P2Y2的表達。P2Y2受體屬于G蛋白偶聯受體,其表達上調后能夠通過磷脂酶C和蛋白激酶C激活下游的信號通路,最終導致IL-6分泌增加[28]。因此,GR能夠通過上調TLR2、NLRP3、P2Y2的表達及與TNF-α、LIF等協同而發揮促炎作用,增強機體的防御功能。

4 結語

綜上所述,通過不同的GR信號轉導機制,GC在體內的作用遠較之前的認識復雜。在早期、急性期和生理狀態(炎癥前)下,通過對天然免疫的激活促使機體免疫系統對病原體發揮快速、有效的炎癥反應,而在后期、慢性期及病理狀態下(炎癥后),通過抑制炎癥因子的釋放來避免過度的炎癥反應。將來還需要對GR在不同組織中的促炎和抗炎效應進行研究,以幫助我們更好地利用GR不同效應設計更好的治療策略。

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