阿帕替尼聯合順鉑對食管癌ECA109細胞抑制作用及機制探討

安改麗,李 旭,黃尚科,馮 璐,白 俊,趙新漢△

1.陜西省人民醫院腫瘤內科(西安710068), 2.西安交通大學第一附屬醫院腫瘤內科(西安 710061)，3.陜西省腫瘤醫院內一科(西安 710061)

△通訊作者

阿帕替尼聯合順鉑對食管癌ECA109細胞抑制作用及機制探討

安改麗1,2,李 旭3,黃尚科2,馮 璐2,白 俊1,趙新漢2△

1.陜西省人民醫院腫瘤內科(西安710068), 2.西安交通大學第一附屬醫院腫瘤內科(西安 710061)，3.陜西省腫瘤醫院內一科(西安 710061)

目的：探討阿帕替尼(Apatinib)聯合順鉑對食管癌細胞ECA109的抑制作用及其可能的分子機制。方法：對人食管癌細胞株ECA109,單獨或聯合給藥后采用MTT法測定細胞增殖,流式細胞儀測定細胞凋亡,Western blot觀察VEGF、AKT的表達情況。結果：Apatinib及順鉑單藥對食管癌細胞株ECA109細胞均有增殖抑制作用，且結果呈時間劑量依賴關系；與對照組相比,Apatinib聯合順鉑作用后有協同誘導凋亡作用,兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05)；Western blot檢測顯示對照組與Apatinib單藥組,聯合用藥組與單藥組比較,AKT及VEGF表達均顯著下調(P<0.05),而順鉑單藥組與對照組相比較,AKT及VEGF表達下調不顯著。結論：Apatinib和順鉑聯合應用能夠在體外協同抑制食管癌ECA109細胞增殖,促進其凋亡,其作用機制可能與下調AKT、VEGF有關。

食管癌是我國常見的惡性腫瘤，隨著手術、化療及放療技術的發展,食管癌的臨床治療有了很大的進展,但是其5年生存率仍低于20%[1]。在我國90%以上食管癌為鱗狀細胞癌,腺癌占5%左右,小細胞未分化癌少見。隨著近幾年分子腫瘤學的進展,分子靶向治療在多種腫瘤中顯示出較好療效,在食管癌治療中的應用探索也越來越多。阿帕替尼(Apatinib)是一種新型的小分子酪氨酸激酶抑制劑,通過選擇性抑制血管內皮生長因子受體2(VEGFR-2)的磷酸化來達到抗血管新生的目的[2]。在臨床前研究中,Apatinib在胃癌、結直腸癌、肝癌、肉瘤及非小細胞肺癌等多種移植瘤小鼠模型中均有明顯的抑瘤作用,且與奧沙利鉑、氟尿嘧啶、阿霉素及多西他賽聯合應用在上述移植瘤鼠模型上有協同作用[3],根據其在晚期胃癌中的3期臨床研究結果,該藥已獲批用于晚期胃癌的治療。既往有文獻報道食管鱗癌細胞高表達VEGFR1-3[4],但目前將Apatinib用于食管癌治療研究的文獻很少。本研究擬將新型抗腫瘤血管生成藥物Apatinib與經典化療藥物順鉑聯合應用,觀察其對食管癌細胞株ECA109的抑制作用,并通過檢測血管內皮生長因子(VEGF)、蛋白激酶B(AKT)水平推測其可能的作用機制,為靶向治療與化療聯合的生物化療模式提供體外實驗的理論依據。

材料及方法

1 材 料 人食管癌細胞株ECA109(西安交通大學醫學院環境與疾病相關基因教育部重點實驗室惠贈)；阿帕替尼(Apatinib)(江蘇恒瑞公司)；順鉑(山東齊魯制藥廠)，1640培養基(美國GIBCO公司)；胎牛血清(以色列Biological Industries公司)；噻唑蘭(MTT)(美國Sigma公司)；Annexin V-APC/7-AAD雙染凋亡試劑盒(深圳晶美生物公司)；二甲基亞砜(DMSO)(美國Sigma公司)；細胞培養箱(美國Thermo公司)；FACScan 流式細胞儀(美國BD公司)；anti-VEGF(Cell Signaling Technology)，anti-AKT(Cell Signaling Technology),鼠抗人β-actin單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)；二抗羊抗鼠單克隆抗體 (美國Jackson公司),Genios 多功能酶標儀(美國TECAN公司)；Western blot電泳和轉膜裝置(美國BIO-RAD 公司)；Odyssey 雙色紅外熒光成像系統掃描儀(美國LI-COR公司產品)；倒置顯微鏡( DXM1200)(日本Nikon公司)。

2 方 法 ①細胞培養：對食管癌細胞ECA109采用含有10%胎牛血清的1640培養基進行培養,在37 ℃、5% CO2飽和濕度培養箱內培養,待其貼壁生長至70%～80%時,用0.25%胰蛋白酶消化傳代。隨后取對數生長期細胞進行后續的實驗。②藥物稀釋方法：將Apatinib藥物用100% DMSO 溶解配置成母液,保存于-20 ℃條件下。實驗用時用1640培養基稀釋至目標濃度,使DMSO終濃度< 0.5 %,不影響細胞生長。③實驗分組：實驗分為空白對照組、Apatinib單藥組、順鉑單藥組、Apatinib+順鉑組。檢測細胞增殖抑制率時Apatinib單藥組濃度分別是2.5、5、10、20、40 μmol/L,順鉑單藥濃度分別是5、10、20、40、80 μg/ml。聯合處理組：以相應的Apatinib濃度和順鉑濃度聯合應用；流式細胞儀檢測細胞凋亡以及Western blot相關實驗時單藥Apatinib濃度為5 μmol/L，單藥順鉑濃度為4 μg/ml，聯合處理組為上述兩藥濃度對細胞進行聯合處理,空白對照組僅用1640培養基進行細胞處理。

3 檢測項目及方法 ①MTT法檢測細胞活性,并計算細胞抑制率：取對數生長期的人食管癌細胞株ECA109(5000個細胞/孔)接種于96孔板上,每孔加入100 μl細胞懸液,培養24 h后，傾去培養基，加入不同濃度的Apatinib和(或)順鉑，每組設6個復孔,每孔加100 μl。將與實驗組中含有最大濃度DMSO的培養液作為空白對照組,不含細胞的無血清培養基為調零孔,培養48 h后每孔加入MTT溶液(濃度為5 mg/ml)10 μl,繼續培養4 h后終止培養,小心吸去藥液及培養液,每孔中加入DMSO 150 μl,振蕩10 min以充分溶解結晶物。用酶標儀在490 nm處測定每孔的OD值。細胞抑制率(%)=(1-試驗孔平均OD值/對照孔平均OD值)×100%,根據上述結果繪制細胞生長抑制率曲線。所有實驗均重復3次。②流式細胞儀檢測細胞凋亡：取對數生長期的ECA109細胞,調整細胞濃度為2×105/ml，以2 ml/孔接種至6孔板內，含10%胎牛血清的1640培養基孵育24 h后,實驗組分別加入相應濃度的Apatinib、順鉑單藥及兩藥聯合,對照組不加任何藥物作為參考,每組設3個復孔,然后置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養箱內培養48 h后,用不含EDTA的胰酶消化各處理組細胞并對細胞進行收集,用4 ℃預冷的PBS對細胞進行2次洗滌，離心后棄去上清,加入500 μl的Binding Buffer使懸浮細胞，后分別加入5 μl Annexin V-APC和5 μl的7-AAD染液,混勻室溫避光放置15 min后上流式細胞儀檢測,所有試驗均重復3次。③Western blot檢測細胞蛋白的表達：首先是細胞總蛋白的提取，取對數生長期的細胞,待細胞密度達到60%～70%,分別加入Apatinib、順鉑,以及Apatinib+順鉑處理48 h后,棄去細胞培養基,冰PBS洗2次,盡可能棄去PBS,加入配置好的適量RIPA蛋白裂解液于培養板中,冰上撫育60 min,刮取細胞并轉移至離心管中,4 ℃,10 000 r/min離心10 min,將上清(含有蛋白樣品)移入新的試管中,分裝蛋白樣品并于-80 ℃保存。在5%～10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上,每孔加入蛋白樣品10 μl進行電泳。同時裁取所需大小PVDF膜放于甲醇溶液中浸泡5 min后浸于轉移液中以備用，按照4層濾紙、PVDF膜、凝膠、4層濾紙的順序將其放置在轉膜架上進行轉膜，轉膜結束后用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液室溫封閉2 h，隨后用按照一定比例稀釋好的特異性一抗封閉PVDF膜，放于4 ℃過夜，第2天取出PVDF膜后用TBST溶液洗膜3次,10 min/次,洗膜完畢后用二抗(1∶5000)室溫封閉2 h，再用TBST洗膜3次,10 min/次,洗膜結束后,用干凈濾紙吸去PVDF膜上的TBST溶液,然后將膜放進準備好的干凈培養皿中,在膜表面均勻滴加ECL化學發光試劑顯色,然后將培養皿放入凝膠成像系統中成像,最后保存結果。上述實驗操作過程均需重復3次。

結 果

1 MTT結果 見圖1。MTT法檢測不同濃度Apatinib、順鉑及Apatinib聯合順鉑對ECA109細胞增殖的抑制作用,結果發現，不同濃度的Apatinib及順鉑作用于ECA109細胞后對細胞生長均有不同程度的抑制作用,聯合用藥后抑制作用增強,且差異有統計學意義(P<0.05)。無論單藥或者聯合用藥,抑制率均呈現劑量依賴性。

圖1 Apatinib、順鉑單藥及聯合處理組作用48 h后對ECA109細胞株的生長抑制作用

2 流式細胞儀測定細胞凋亡 見圖2，表1。ECA109細胞分別經對照組,Apatinib單藥組,順鉑單藥組,Apatinib+順鉑聯合組處理48 h后,采用Annexin V-APC/7-AAD法經流式細胞儀測定細胞凋亡。結果發現：對照組、Apatinib單藥組、順鉑單藥組及兩藥聯合組細胞凋亡率分別為：7.93%、11.06%、24.07 %、38.72%；將單藥處理組、聯合處理組分別與對照組之間進行兩兩比較，其細胞凋亡率均有升高，并且分析結果提示差異有統計學意義(P<0.05)。

3 不同處理組VEGF、AKT的表達情況 見表2。不同藥物組對ECA109細胞株作用48 h后其VEGF、AKT均有表達，其中兩藥聯合組及Apatinib單藥組與空白對照組相比,其VEGF、AKT蛋白表達下降(P<0.05),聯合組較單藥組表達下降(P<0.05),順鉑單藥組與空白對照組比較,VEGF、AKT表達下降不明顯(P>0.05)。

表1 Apatinib、順鉑單藥及聯合對ECA109細胞凋亡率的影響

A.對照組；B.Apatinib組；C.順鉑組；D.Apatinib+順鉑組

圖2 Apatinib、順鉑單藥及聯合對ECA109細胞凋亡作用比較

注：與空白對照組比較,*P<0.05；與Apatinib、順鉑組比較, △P<0.05

討 論

根據藥物作用于腫瘤細胞通路的不同，現在常用的靶向治療藥物分為以下幾種：EGFR抑制劑、VEGF抑制劑、HER2抑制劑、c-MET抑制劑、COX-2抑制劑、PI3K/AKT/mTOR抑制劑和其他通路藥物。從臨床研究的數據來看，上述藥物多數應用于食管癌后療效并不顯著，且這些數據大多來源于西方人群的食管腺癌或食管胃結合部癌，缺少來自以鱗癌為主要病理特征的中國人群的數據支持。腫瘤抗血管生成靶向治療已成為目前抗腫瘤靶向治療的研究熱點，VEGF-VEGFR介導的血管生成在食管癌發展中起到了重要的作用。越來越多的數據提示食管癌中VEGF-VEGFR表達與預后的相關性[5-6]，在一項研究中發現，食管鱗癌細胞胞漿中VEGFR1的表達與淋巴結轉移相關，和預后無關；胞漿VEGFR2表達與臨床病理特征及預后不相關，而與腫瘤血管密度及淋巴結播散有關，這揭示了VEGFR及其配體作用后與腫瘤進展的相關性[7]。

Apatinib是一種新型的小分子酪氨酸激酶抑制劑，通過選擇性地抑制血管內皮生長因子受體2(VEGFR-2)磷酸化而產生抑制腫瘤血管新生的作用[7]。因其在晚期胃癌臨床試驗中的良好效果，2014年已被國家食品藥品監督管理局批準為晚期胃癌及胃食管結合部腺癌的適應證，而且在肝癌、非小細胞肺癌、結直腸癌、乳腺癌中的臨床試驗正在進展中。本研究將新型抗血管生成藥物Apatinib與傳統化療藥物順鉑聯合應用，經體外實驗證實兩藥聯合可以增強對食管癌ECA109細胞株的生長抑制作用，且呈現濃度依賴性，并且兩藥聯合后細胞凋亡率升高，較單藥組及對照組比較，差異均有統計學意義。這與該藥在其他實體瘤動物模型中結果一致。同時我們采用Western blot法檢測了不同藥物處理后ECA109細胞中VEGF蛋白的表達情況，提示Apatinib單藥、順鉑單藥及兩藥聯合組與空白對照組比較，其VEGF蛋白表達均有降低，兩藥聯合及Apatinib單藥組與對照組比較差異有統計學意義。本研究聯合用藥取得了更好的抑制腫瘤生長并促進腫瘤細胞凋亡作用，研究結果支持了生物化療模式這一腫瘤治療新模式的適用性，聯合治療所需藥物劑量較單藥組明顯降低，因而可能減少藥物的毒副作用，提高耐受性。同時提示Apatinib可能通過下調VEGF的表達發揮抗癌作用。

順鉑是細胞周期非特異性化療藥物，其最主要的作用機制是誘導腫瘤細胞凋亡。磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/AKT是抵抗細胞凋亡的重要因子，細胞過度表達PI3K/AKT可以抑制腫瘤細胞凋亡。文獻報道，PI3K/AKT的表達與癌細胞對順鉑的耐藥有關[8]，用LY294002抑制PI3K活性后，可明顯增加順鉑對耐順鉑人鱗狀細胞癌UM-SCC-23細胞的促凋亡作用。研究提示在肺腺癌細胞A549中檢測到AKT1過表達，這明顯減弱了A549細胞對順鉑的化療敏感性。順鉑可以通過耦合到細胞DNA雙鏈結構，引起DNA損傷，從而激活PI3K/AKT通路，引起細胞凋亡的抑制，由此降低化療效果[9]。文獻報道食管鱗癌細胞高表達PI3K/AKT,且其高蛋白水平與細胞分化程度低、淋巴結轉移等病理因素相關。本研究通過Western blot法檢測食管癌細胞株ECA109經不同藥物處理后AKT蛋白表達情況,結果發現,與空白對照組相比,順鉑單藥組、Apatinib單藥組及兩藥聯合處理組中AKT表達均有降低，Apatinib單藥組、聯合處理組與空白對照組相比,差異具有統計學意義,提示Apatinib與順鉑聯合用藥后增強細胞凋亡率的結果與其可以逆轉AKT介導的順鉑耐藥可能有關。

綜上所述,本研究結果表明, Apatinib作為一種安全有效的抗腫瘤血管生成藥物，對食管癌細胞株ECA109顯示出良好的細胞生長抑制、促凋亡作用,且與順鉑聯用有協同抑制作用,其發揮作用機制可能與下調VEGF、AKT表達有關,這為Apatinib應用于食管癌的臨床研究提供了一定的理論基礎。

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(收稿：2016-06-13)

食管腫瘤 分子靶向治療 順鉑 細胞凋亡 蛋白激酶類 血管內皮生長因子 @阿帕替尼

R735.1

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.02.004