響應面法優化白首烏多糖提取的研究

劉 穎，趙 雪，，柴 智，賈成琦，李春陽

（1.哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江哈爾濱 150076；2.江蘇省農業科學院農產品加工研究所，江蘇南京 210014；3.江蘇海苑食品有限公司，江蘇濱海 224000）

響應面法優化白首烏多糖提取的研究

劉 穎1，趙 雪1，2，柴 智2，賈成琦3，*李春陽2

（1.哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江哈爾濱 150076；2.江蘇省農業科學院農產品加工研究所，江蘇南京 210014；3.江蘇海苑食品有限公司，江蘇濱海 224000）

白首烏中多糖含量豐富，為改善目前實際生產中白首烏水溶性成分利用不足的現狀，實現白首烏資源的充分開發，采用響應面法優化提取白首烏多糖的工藝條件，以期為這一水溶性功能成分的開發提供基礎。選擇料液比、提取溫度和提取時間3個因素進行單因素試驗，根據單因素試驗結果設計中心組合試驗，采用響應面法確定最優工藝參數。結果表明，白首烏多糖的最優提取工藝為料液比1∶17，提取溫度91℃，提取時間3 h。在此條件下，白首烏多糖得率為1.58%，與模型的預期值1.61%基本相符。由此可見，響應面法對白首烏多糖提取條件進行優化合理可行，具有較高的應用價值。

多糖；白首烏；響應面；提取工藝

濱海白首烏 （Cynanchum auriculatum Royle ex Wight），原植物為蘿藦科耳葉牛皮消，是江蘇省濱海縣著名的傳統特產，也是我國傳統的“藥食同源”植物、道地中藥材。全國95%白首烏產于江蘇省濱海縣，當地農民種植白首烏的歷史悠久，是我國著名的首烏之鄉。濱海白首烏是全國首烏行業唯一獲得國家3項地理標志保護的原產地保護產品，也是唯一經國家衛生計生委辦公廳批復“作為有傳統食用習慣的普通食品管理”的白首烏品種[1-2]。白首烏含有豐富的營養成分（如蛋白質、維生素、微量元素等）和生物活性物質（如C21甾甙及甙元類成分、磷脂類成分、苯酮類成分等）[3-4]。經龔樹生等專家的產地調查、史料考證和臨床效果認定，白首烏具有重要的生理活性功能和醫療價值，其補益作用優于赤首烏，是一種有前途的抗衰老藥。濱海白首烏由于其資源的壟斷性、產品功能的多樣性及作為天然產物的安全性，已引起越來越多研究者的關注，成為一種極具開發前景的優良功能食品基料。

多糖在自然界中廣泛存在，近年來研究發現多糖具有較高的藥用價值，如抗腫瘤、抗病毒、抗衰老等[5-8]。來源于天然植物、真菌等活性多糖的開發是目前研究和利用的熱點問題，有大量研究已經對人參、靈芝等多糖進行了報道，而白首烏多糖的研究仍處于水提物等初級階段，相關多糖組成及其相應藥理作用關系尚不明確。這方面的研究空白，將會導致對白首烏深度開發及應用時缺乏相應數據的支持和理論指導。目前，對白首烏的深入研究和開發利用多集中在其醇溶性成分上，如白首烏中發現數量最多的活性組分C21甾體成分[9-10]；而水溶性成分，如白首烏多糖，多數隨廢水和廢渣排棄，研究利用不足，既浪費了資源，又污染了環境。因此，開發利用白首烏這一傳統的“藥食同源”資源，優化白首烏多糖的提取工藝，對擴大其應用和工業化生產具有現實意義。試驗以濱海白首烏為原料，采用水提醇沉法對多糖進行提取，并用響應面法優化提取工藝，為其擴大應用和工業化生產提供相對準確的試驗數據。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

濱海白首烏，2年生；液化酶、糖化酶，均采購于江蘇銳陽生物科技有限公司；葡萄糖、石油醚、濃硫酸、苯酚、氯仿、無水乙醇、正丁醇、丙酮，均為分析純。

1.2 儀器與設備

HJ-6A型數顯恒溫磁力加熱攪拌器，金壇市白塔新寶儀器廠產品；RE-5203型旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠產品；PHS-3C型pH計，上海康儀儀器有限公司產品；DD-5M型離心機，湘儀離心機有限公司產品；UV-5500型掃描型紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司產品。

1.3 原料的預處理

白首烏粉末→石油醚脫脂（料液比1∶4，50℃，磁力攪拌1.5 h，2次）→離心（3 500 r/min，10 min）→殘渣于60℃烘箱中烘干→干粉保存備用。

1.4 白首烏多糖提取

稱取一定質量的白首烏干粉，加入適量的水，混合均勻，置于固定溫度下攪拌一定時間，經離心后得多糖浸提液。將多糖浸提液進行去淀粉[12]、濃縮，濃縮液用Sevag法脫蛋白[13]，直至中間層無白色沉淀。脫蛋白后的濃縮液置于4℃下醇析、離心，所得沉淀物用80%乙醇和丙酮洗滌，加入少量水復溶，透析48 h，冷凍干燥。

1.5 單因素試驗

設定料液比1∶15，提取溫度80℃，提取時間4 h，固定其他因素，分別考察料液比、提取時間和提取溫度對白首烏多糖得率的影響。

1.6 白首烏多糖含量的測定

1.6.1 標準曲線的制作

采用苯酚硫酸法測量溶液中白首烏多糖含量。準確稱取已經干燥至恒質量的標準葡萄糖20 mg定容于500 mL容量瓶中，分別吸取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6 mL標準葡萄糖溶液，各以蒸餾水補至2.0 mL，以2.0 mL蒸餾水為空白，然后各加入6%苯酚1.0 mL及濃硫酸5.0 mL，搖勻冷卻，室溫靜置20 min后于波長490 nm處測定吸光度。以白首烏多糖濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標，得標準曲線。標準曲線的回歸方程為Y=0.067 X-0.002 8，R2=0.999 4。

1.6.2 樣品多糖含量的測定

取多糖透析液0.05 mL，用蒸餾水補至2.0 mL，按上述步驟測其吸光度。以標準曲線計算白首烏多糖含量。

1.7 白首烏多糖提取的中心組合試驗[14-15]

在單因素的基礎上采用Box-Benhnken試驗設計，并運用響應面軟件（Design Expert 8.0.6） 進行試驗分析。分別以X1，X2和X3表示3個因素，以-1，0，1表示各因素的3個水平。

試驗因素及水平設計見表1。

表1 試驗因素及水平設計

2 結果與分析

2.1 單因素結果分析

2.1.1 料液比對白首烏多糖得率的影響

料液比對白首烏多糖得率的影響見圖1。

圖1 料液比對白首烏多糖得率的影響

由圖1可知，隨著料液比的增加，白首烏多糖得率呈明顯的上升趨勢，當料液比達到1∶20后，多糖得率增加緩慢。可見，增大料液比有利于白首烏多糖的提取，但是增大到一定程度后，白首烏多糖的得率基本上趨于平穩，同時過大的料液比也會增加能耗和后續工作量。因此，白首烏多糖的料液比選1∶20為宜。

2.1.2 提取溫度對白首烏多糖得率的影響

提取溫度對白首烏多糖得率的影響見圖2。

圖2 提取溫度對白首烏多糖得率的影響

由圖2可知，隨提取溫度的上升，白首烏多糖得率迅速增加，提取溫度到達90℃后，多糖得率增加緩慢；達到100℃時，多糖得率略有所下降。可能是由于高溫條件下部分多糖發生水解，導致后續分離過程中的損失，同時提取溫度過高也會導致淀粉等其他雜質浸出增加，對白首烏多糖的分離造成不便[16]。因此，白首烏多糖的提取溫度選90℃左右為宜。

2.1.3 提取時間對白首烏多糖得率的影響

提取時間對白首烏多糖得率的影響見圖3。

圖3 提取時間對白首烏多糖得率的影響

由圖3可知，在一定的時間內，白首烏多糖得率隨提取時間的增加而增加，在3 h處達到最高值，繼續增加提取時間，白首烏多糖得率降低。可能是由于提取時間過長，使部分多糖發生降解。因此，白首烏多糖的提取時間選3 h為宜。

2.2 響應面試驗結果

在單因素試驗的基礎上，采用Box-Benhnken中心組合試驗法，選取了對白首烏多糖得率影響較大的3個因素（料液比、提取溫度、提取時間）進行三因素三水平的中心組合試驗，以白首烏多糖得率為響應值，通過響應面分析優化白首烏多糖的提取工藝條件。

響應面試驗設計及結果見表2。

利用Design Expert 8.0.6軟件對數據進行二次多元回歸擬合，得到白首烏多糖得率（Y）對自變量的二元多次回歸方程如下：

Y=1.55+0.18X1+0.12X2+0.11X3+0.027X1X2+ 0.11X1X3+0.023X2X3-0.33X12-0.50X22-0.31X32.

2.3 回歸模型有效性及顯著性分析

利用Design Expert 8.0.6軟件對表中響應面方案和結果進行回歸擬合分析，對回歸模型進行方差分析，并檢驗回歸方程系數的顯著性。

表2 響應面試驗設計及結果

響應面設計試驗方差分析及回歸系數顯著性檢驗見表3。

表3 響應面設計試驗方差分析及回歸系數顯著性檢驗

對模型進行方差分析可以看出，試驗數據所得的模型中F=548.11，p＜0.000 1，表明該模型極顯著。失擬項的p=0.080 2＞0.05，不顯著，且回歸方程的總決定系數R2=0.998 6，調整決定系數R2adj=0.996 8，說明所建立的回歸方程擬合度和可信度較高，能夠很好地對白首烏多糖得率進行預測。方程中提取溫度和提取時間交互項、料液比和提取溫度交互項對白首烏多糖得率的影響不顯著，其他項均達到了極顯著水平，3個因素對白首烏多糖得率的影響順序為X1＞X2＞X3，即料液比＞提取溫度＞提取時間。

2.4 響應面分析

響應面三維圖可直觀地反映各因素的交互作用對響應值的影響，曲線越陡，表示該因素對響應值的影響越大；曲線越平滑，表明該因素對響應值影響越小。比較響應面三維圖可知，在所選范圍內存在極值，即響應面最高點。

料液比和提取溫度的交互作用對白首烏多糖得率的影響見圖4，料液比和提取時間的交互作用對白首烏多糖得率的影響見圖5，提取溫度和提取時間的交互作用對白首烏多糖得率的影響見圖6。

圖4 料液比和提取溫度的交互作用對白首烏多糖得率的影響

圖5 料液比和提取時間的交互作用對白首烏多糖得率的影響

圖6 提取溫度和提取時間的交互作用對白首烏多糖得率的影響

由圖4可知，提取時間為3 h時，白首烏多糖得率隨料液比和提取溫度的增加呈上升趨勢，當提取溫度達91℃，料液比1∶17時，白首烏多糖得率達到最大值。

由圖5可知，提取溫度為90℃時，白首烏多糖得率隨料液比和提取時間的增加呈先增加后平穩的趨勢。當提取時間約3.2 h，料液比約1∶17.5時，白首烏多糖得率達到最大值。

由圖6可知，料液比為1∶15時，隨提取溫度和提取時間的增加，白首烏多糖得率提高。當提取溫度約92℃，提取時間為3.1 h時，白首烏多糖得率達到最大值；隨后再繼續增加提取溫度和提取時間，白首烏多糖得率趨于平穩。

2.5 最佳條件優化及驗證試驗

根據回歸模型的分析結果，得到白首烏多糖提取的最優工藝為料液比1∶17，提取溫度91℃，提取時間3.24 h，該條件下白首烏多糖得率的預測值為1.61%。考慮實際的操作情況，將最佳提取工藝修正為料液比1∶17，提取溫度91℃，提取時間3 h；在此提取條件下，進行3組平行試驗，所得白首烏多糖得率的平均值為1.65%。預測值與實測值非常接近，偏差較小，說明運用響應面法優化得到的模型參數準確可靠。

3 結論

試驗通過選取料液比、提取溫度和提取時間3個因素進行響應面分析，并由回歸模型的方差分析結果可知各個因素對白首烏多糖得率的影響均顯著，其影響順序為料液比＞提取溫度＞提取時間。利用響應面法優化白首烏多糖的最優提取工藝為料液比1∶17，提取溫度91℃，提取時間3 h。在此條件下白首烏多糖的得率為1.58%，接近于多糖的預測值1.61%，誤差較小，表明采用響應面法分析優化白首烏多糖的提取工藝準確可靠，具有很高的應用價值，可以在天然產物提取研究中進一步推廣。

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Optimization of Extraction Technology of Polysaccharide from Cynanchum auriculatum Royle ex Wight by Response Surface Methodology

LIU Ying1，ZHAO Xue1，2，CHAI Zhi2，JIA Chengqi3，*LI Chunyang2

（1.College of Food Engineering，Harbin University of Commerce，Harbin，Heilongjiang 150076，China；2.Institute of Agricrltural Products Processing，Jiangsu Academy of Agricutural Scienes，Nanjing，Jiangsu 210014，China；3.Jiangsu Haiyuan Food Co.，Ltd.，Binhai，Jiangsu 224000，China）

Cynanchum auriculatum Royle ex weight full of polysacharede.Response surface methodology is used to optimize the extraction conditions of polysaccharide from，aimming to yield the maximum polysaccharide from Cynanchum auriculatum Royle ex Wight.The effects of material liquid ratio，extraction temperature and extraction time on the yield of polysaccharide are evaluated in single factor experiments.Subsequently，based on the three factors，a polysaccharide yield regression model is established using the central composite design.Then，the optimum levels of these three factors are obtained by the response surface analysis.The result shows that the optimum extractions are solid-liquid ratio of 1∶17，extraction temperature of 91℃，extraction time of 3 h.Under these conditions，the maximum experimental polysaccharide yield is 1.58%，which is basically consistent with the predictied one of 1.61%.

polysaccharide；Cynanchum auriculatum Royle ex Wight；response surface methodology；extraction

R284.2

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.01.001

1671-9646（2017）01a-0001-04

2016-11-11

蘇北科技發展計劃“富民強縣項目”（BN2014147）。

劉 穎（1968— ），女，博士，教授，研究方向為糧食加工。

*通訊作者：李春陽（1966— ），男，博士，研究員，研究方向為營養與活性物質、農產品精深加工。