菌落總數(shù)測試片環(huán)氧乙烷滅菌法研究

王艷蕊，肖茜文，劉 爽，劉 桐，何 苗，任大勇，陳 萍

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，吉林長春 130118；2.吉林省安信食品技術(shù)服務(wù)有限責任公司，吉林長春 130012）

菌落總數(shù)測試片環(huán)氧乙烷滅菌法研究

王艷蕊1，肖茜文1，劉 爽1，劉 桐1，何 苗2，任大勇1，*陳 萍1

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，吉林長春 130118；2.吉林省安信食品技術(shù)服務(wù)有限責任公司，吉林長春 130012）

考察環(huán)氧乙烷滅菌中滅菌溫度、環(huán)氧乙烷質(zhì)量濃度、滅菌時間、相對濕度對菌落總數(shù)測試片的滅菌效果，得出最佳滅菌參數(shù)。通過正交試驗優(yōu)化環(huán)氧乙烷滅菌工藝條件，采用生物檢測法和化學檢測法進行滅菌效果評價，以比色分析法檢測菌落總數(shù)測試片中的環(huán)氧乙烷殘留。結(jié)果表明，環(huán)氧乙烷對菌落總數(shù)測試片的最佳滅菌條件為滅菌溫度55℃，環(huán)氧乙烷質(zhì)量濃度600 mg/L，相對濕度40%，滅菌時間3 h，解析時間12 h，環(huán)氧乙烷殘留量0.7 mg/kg；生物檢測和化學檢測合格；經(jīng)過細菌增殖培養(yǎng)，與國標法培養(yǎng)結(jié)果符合率達到97%。由此可見，環(huán)氧乙烷能較好用于菌落總數(shù)測試片的滅菌，殘留量符合規(guī)定，對滅菌物品性能無影響。

環(huán)氧乙烷滅菌；菌落總數(shù)測試片；比色分析

0 引言

菌落總數(shù)用來判定食品被細菌污染的程度及衛(wèi)生質(zhì)量，反映食品在生產(chǎn)過程中是否符合衛(wèi)生要求，是食品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標之一[1]。菌落總數(shù)測試片法是一種將樣液直接接種于測試片上，在一定溫度下培養(yǎng)，對結(jié)果進行觀察計數(shù)的新型檢測技術(shù)，由于其具有省時省力、操作簡單、便于運輸、成本低等優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用[2]。在工業(yè)化生產(chǎn)中，開展對菌落總數(shù)測試片的滅菌研究至關(guān)重要，環(huán)氧乙烷滅菌法作為一種可以在低溫下滅菌的方法，是菌落總數(shù)測試片滅菌的首選。

環(huán)氧乙烷，又名氯化乙烯或氧丙烷，在常溫常壓下是無色氣體，是一種廣譜、高效、穿透力強、對消毒物品損害較小的滅菌劑，被廣泛用于不耐熱、不耐濕制品的滅菌中[3]。環(huán)氧乙烷滅菌效果受多種因素影響，為達到最佳滅菌效果，需要有效進行控制，以達到消毒滅菌的目的。試驗從環(huán)氧乙烷滅菌溫度、相對濕度、環(huán)氧乙烷質(zhì)量濃度和滅菌時間等方面對菌落總數(shù)測試片滅菌效果的影響進行研究，建立可用于菌落總數(shù)測試片的滅菌方法，從而達到對測試片滅菌效果好、成本低的目的。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與方法

胰蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂粉等，北京蘭博利德商貿(mào)有限公司提供；甘露醇、吐溫-80、丙酮酸鈉等，上海生物工程有限公司提供；自制菌落總數(shù)測試片；環(huán)氧乙烷化學指示卡、枯草桿菌黑色變種芽孢菌（Bacillus subtilisvar.niger） ATCC9372生物指示劑，北京四環(huán)衛(wèi)生藥械有限公司提供。

環(huán)氧乙烷滅菌器，山東新華醫(yī)療器械股份有限公司產(chǎn)品；超凈工作臺、DHP-781型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌落總數(shù)測試片的制備

菌落總數(shù)測試片的制備詳見陳萍等人[4]“一種菌落總數(shù)測試片、制備方法及其應(yīng)用”。

1.2.2 環(huán)氧乙烷滅菌法

將待滅菌的菌落總數(shù)測試片試驗包置于環(huán)氧乙烷滅菌器內(nèi)，設(shè)置環(huán)氧乙烷質(zhì)量濃度600 mg/L，相對濕度55%，滅菌溫度55℃，滅菌3 h后，抽真空排除殘余環(huán)氧乙烷，使其進入水中生成乙二醇排放，送入無菌空氣，完全排除環(huán)氧乙烷[5]。

1.2.3 菌量計數(shù)方法

菌量計數(shù)方法參照《消毒技術(shù)規(guī)范》 （2002）將枯草桿菌黑色變種芽孢菌片放置于玻璃管內(nèi)，將菌片打碎混勻，10倍梯度稀釋，選擇合適的稀釋水平接種于培養(yǎng)基上，于37℃條件下培養(yǎng)24 h后計數(shù)。

1.2.4 滅菌效果評價

（1）生物監(jiān)測法。生物檢測采用環(huán)氧乙烷生物檢測指示菌片（枯草桿菌黑色變種芽孢菌片）放于待滅菌包內(nèi)，滅菌完成后立即取出生物指示菌片，制備菌懸液，進行細菌培養(yǎng)；由活菌計數(shù)法得到枯草桿菌黑色變種芽孢的殘菌，以暴露時間為橫坐標、枯草桿菌黑色變種芽孢殘菌對數(shù)值為縱坐標，得到回歸方程，計算得D值。試驗重復3次，結(jié)果取平均值。D值是殺滅90%微生物所用的時間，等于線性曲線斜率的負倒數(shù)。

（2）化學檢測法。采用環(huán)氧乙烷指示卡作為化學檢測方法，將化學指示卡放在待滅菌包的中央，根據(jù)滅菌后化學指示卡的變色，判斷是否已達滅菌效果。環(huán)氧乙烷指示卡由玫紅色變?yōu)樯钭仙?，滅菌完全?/p>

1.2.5 環(huán)氧乙烷各因素滅菌條件的優(yōu)化

（1）單因素試驗。以D值為衡量指標，考察滅菌溫度、環(huán)氧乙烷質(zhì)量濃度、滅菌時間和相對濕度對環(huán)氧乙烷滅菌效果的影響。將標準試驗包放入環(huán)氧乙烷滅菌器內(nèi)，滅菌溫度分別為45，50，55，60，65℃；環(huán)氧乙烷質(zhì)量濃度分別為400，500，600，700， 800 mg/L；相對濕度分別為35%，45%，55%，65%，75%；滅菌時間分別為2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 h。

（2）正交試驗。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以D值作為試驗的衡量指標，采用L9（34）正交試驗設(shè)計，研究滅菌溫度、環(huán)氧乙烷質(zhì)量濃度、滅菌時間和相對濕度4個因素對D值的影響，確定最優(yōu)滅菌參數(shù)。

正交因素與水平設(shè)計見表1。

表1 正交因素與水平設(shè)計

1.2.6 環(huán)氧乙烷殘留量的檢測

將已滅菌的菌落總數(shù)測試片在不同解析時間，參照李傳秋等人[6]采用的比色分析法對滅菌后的菌落總數(shù)測試片進行取樣和處理，測得滅菌后菌落總數(shù)測試片的環(huán)氧乙烷殘留量。根據(jù)國家標準GB 8368—87中規(guī)定，物品經(jīng)環(huán)氧乙烷滅菌解析后，其殘留量應(yīng)≤10 mg/kg。

1.2.7 環(huán)氧乙烷滅菌效果檢測

使用環(huán)氧乙烷進行滅菌，檢查生物檢測和化學檢測指標；在滅菌后的菌落總數(shù)測試片上接種一定濃度的混合菌懸液，計數(shù)紅色菌落作為檢測指標，同時與國標瓊脂平板計數(shù)法進行對照，檢測滅菌后環(huán)氧乙烷對菌落總數(shù)測試片細菌生長的影響。

1.3 統(tǒng)計分析

所有試驗數(shù)據(jù)均采用SPSS和ORIGIN 9.0軟件進行統(tǒng)計分析，各組數(shù)據(jù)均采用單因素ANOVA方差分析，結(jié)果用平均值±標準差（SD）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 滅菌溫度對D值的影響

不同滅菌溫度下的D值見圖1。

圖1 不同滅菌溫度下的D值

由圖1可知，隨著滅菌溫度的升高，D值在45～55℃時下降速度快；在滅菌溫度大于55℃后，D值出現(xiàn)緩慢上升趨勢，說明55℃以后隨著滅菌溫度的升高殺菌效果的增強幅度開始減小。由此可得出，滅菌溫度為55℃左右較為適宜。

2.2 環(huán)氧乙烷質(zhì)量濃度對D值的影響

不同環(huán)氧乙烷質(zhì)量濃度下的D值見圖2。

圖2 不同環(huán)氧乙烷質(zhì)量濃度下的D值

由圖2可知，隨著環(huán)氧乙烷質(zhì)量濃度的升高，D值在400～600 mg/L時下降顯著，在600 mg/L后下降趨勢平緩，但沒有出現(xiàn)平臺期。由此可以得出，環(huán)氧乙烷質(zhì)量濃度為600 mg/L時較為適宜。

2.3 滅菌時間對D值的影響

不同滅菌時間下的D值見圖3。

圖3 不同滅菌時間下的D值

由圖3可知，隨著滅菌時間的增加D值顯著下降，滅菌時間大于3.0 h后，D值緩慢下降；繼續(xù)增加滅菌時間，D值幾乎不再變化。因此，選擇3.0 h為菌落總數(shù)測試片的最佳滅菌時間。

2.4 相對濕度對D值的影響

不同相對濕度下的D值見圖4。

圖4 不同相對濕度下的D值

由圖4可知，在相對濕度為30%～50%的范圍內(nèi)，D值緩慢下降；相對濕度為50%時，D值達到最小；在相對濕度為50%～70%的范圍內(nèi)，D值緩慢上升。因此，選擇相對濕度為50%時進行環(huán)氧乙烷滅菌。

2.5 正交試驗結(jié)果及最佳組合的確定

正交試驗結(jié)果及極差分析見表2。

D值越小說明滅菌效果越好，極差越大表明該因素對D值的影響越大。從表2正交試驗結(jié)果及極差分析表可知，環(huán)氧乙烷滅菌最優(yōu)組合為A2B2C1D2，即滅菌溫度55℃，環(huán)氧乙烷質(zhì)量濃度600 mg/L，相對濕度40%，滅菌時間3 h，此時滅菌效果最好。因此，影響滅菌效果因素的主次順序是滅菌溫度＞環(huán)氧乙烷質(zhì)量濃度＞相對濕度＞滅菌時間。

表2 正交試驗結(jié)果及極差分析

2.6 滅菌后環(huán)氧乙烷殘留量檢測結(jié)果

試驗結(jié)果表明，隨著解析時間的增加，環(huán)氧乙烷殘留量逐漸減少，解析12 h后，殘留量0.7 mg/kg，符合滅菌后環(huán)氧乙烷殘留量應(yīng)小于10 mg/kg的規(guī)定。

菌落總數(shù)測試片環(huán)氧乙烷殘留量檢測結(jié)果見表3。

表3 菌落總數(shù)測試片環(huán)氧乙烷殘留量檢測結(jié)果

2.7 環(huán)氧乙烷滅菌效果檢測結(jié)果

經(jīng)過環(huán)氧乙烷滅菌后，環(huán)氧乙烷化學指示卡均由玫紅色變?yōu)樯钭仙?，滅菌完全；取出菌片適宜條件下培養(yǎng)，生物指示物培養(yǎng)結(jié)果均呈現(xiàn)陰性，滅菌合格。

與國標瓊脂平板計數(shù)法進行比較，符合率達到97%，說明環(huán)氧乙烷滅菌后對菌落總數(shù)測試片細菌生長沒有影響，滅菌解析后可以安全使用。

菌落總數(shù)測試片和國標法的細菌培養(yǎng)結(jié)果見表4。

表4 菌落總數(shù)測試片和國標法的細菌培養(yǎng)結(jié)果

3 討論

環(huán)氧乙烷滅菌法是一種滅菌可靠、使用安全的低溫條件滅菌法。滅菌后，對菌落總數(shù)測試片損害較小，滅菌效果可靠。

通過單因素試驗和正交試驗，不斷完善和改進環(huán)氧乙烷對菌落總數(shù)測試片的滅菌條件，得出菌落總數(shù)測試片滅菌的最優(yōu)組合。同時由結(jié)果得出，滅菌溫度對環(huán)氧乙烷滅菌效果影響顯著，滅菌效果隨著滅菌溫度的提升不斷加強；其次是環(huán)氧乙烷濃度、相對濕度和滅菌時間，三者對滅菌效果的影響相對較小。采用比色分析法測定不同解析時間下環(huán)氧乙烷的殘留，解析12 h后菌落總數(shù)測試片上的殘留即可達到0.7 mg/kg，符合國標中環(huán)氧乙烷殘留規(guī)定的限值要求；與國標瓊脂平板計數(shù)法進行對比，細菌培養(yǎng)增殖結(jié)果符合率達到97%，說明環(huán)氧乙烷滅菌后對菌落總數(shù)測試片細菌生長沒有影響，滅菌解析后可以安全使用。

國外對環(huán)氧乙烷滅菌研究較為成熟，國內(nèi)卻很少關(guān)于環(huán)氧乙烷滅菌方面的深入研究，試驗對菌落總數(shù)測試片滅菌方式進行初步研究，為今后進一步研究菌落總數(shù)測試片的滅菌方法提供理論依據(jù)，具有一定的實用價值。

[1]王佳男，肖茜文，王艷蕊，等.食品微生物測試片研究進展 [J].食品安全質(zhì)量檢測學報，2016，7（2）：701-705.

[2]洪炳財，陳向標，賴明河.食品中微生物快速檢測方法的研究進展 [J].中國食物與營養(yǎng)，2013，19（6）：15-18.

[3]徐燕，孫巍，吳曉松.環(huán)氧乙烷滅菌技術(shù)應(yīng)用與發(fā)展[J].中國消毒學雜志，2013，30（2）：146-151.

[4]陳萍，王艷蕊，王佳男，等.一種菌落總數(shù)測試片、制備方法及其應(yīng)用：中國，201610195209.7[P].2016.

[5]馬偉，何靜芳，沈偉，等.臺式環(huán)氧乙烷滅菌器對醫(yī)療器械滅菌效果的試驗觀察 [J].中國消毒學雜志，2013，30（1）：25-27.

[6]李傳秋，王磊，陳軍.環(huán)氧乙烷滅菌效果及殘留量的實驗研究 [J].食品與藥品，2014，16（1）：41-43.◇

Study on the Ethylene Oxide Sterilization of Aerobic Bacteria Counting Test Piece

WANG Yanrui1，XIAO Qianwen1，LIU Shuang1，LIU Tong1，HE Miao2，REN Dayong1，*CHEN Ping1

（1.School of Food Science and Engineering，Jilin Agricultural University，Changchun，Jilin 130118，China；2.Anxin Food Technology Services of Limited Liability Company in Jinlin Province，Changchun，Jilin 130012，China）

To obtained the optimal ethylene oxide sterilization parameter by comparing different sterilization effect of ethylene oxide with different temperature，concentration，sterilization time and relative humidity.Ethylene oxide sterilization process conditions are optimized by the orthogonal experiment，chemical and biological detection are used to evaluation the sterilization effect on the aerobic bacteria counting test piece，colorimetric analysis method in detecting the total number of colonies of ethylene oxide residues.The optimal sterilization condition is temperature 55℃，ethylene oxide concentration 600 mg/L，relative humidity 40%，sterilization time 3 h，after 12 h parsing，ethylene oxide residues is 0.7 mg/kg.The test of the biological and chemical are qualified；After bacterial multiplication culture，compared with national standard method the training results coincidence rate reaches 97%.Ethylene oxide sterilization can be better used to aerobic bacteria counting test piece sterilization，residues in accordance with regulations，and have no influence on performance of sterilization items.

ethylene oxide sterilization；aerobic bacteria counting test piece；colorimetric analysis

R181.2

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.01.008

1671-9646（2017）01a-0029-03

2016-11-25

吉林省科技發(fā)展計劃資助項目（20150204018SF）。

王艷蕊（1989— ），女，碩士，研究方向為食品質(zhì)量與安全。

*通訊作者：陳 萍（1968— ），女，博士，教授，研究方向為食品質(zhì)量與安全。