植物體細胞雜交技術的幾點疑問解析

蘇杜林

(甘肅省禮縣實驗中學 742200)

植物體細胞雜交是指將不同種的植物體細胞，在一定條件下融合成雜種細胞，并把雜種細胞培育成新植物體的技術。其過程主要包括原生質體的制備、細胞融合的誘導、雜種細胞的篩選和培養以及雜種植株的再生和鑒定等環節。

1 植物體細胞雜交的原理

植物體細胞雜交首先要使原生質體融合形成雜種細胞；其次要把雜種細胞經過植物組織培養技術培育成雜種植株。細胞融合的原理是細胞膜具有一定的流動性，植物組織培養的原理是植物細胞的全能性。因此，植物體細胞雜交的原理是：利用細胞膜具有一定的流動性和植物細胞的全能性進行育種。

2 如何制備原生質體

植物細胞外面堅硬的細胞壁是細胞融合的障礙，因此在體細胞雜交前必須除去細胞壁，獲得具有活力的原生質體。

除去細胞壁早期的方法是機械法，即通過將材料置于高滲糖溶液中,使其發生質壁分離,當原生質體收縮成球狀時,切開細胞壁釋放出原生質體。但由于這種方法費時、繁瑣且不易獲得完整的原生質體,目前已基本上被酶解法取代。酶解法是用不同種類和濃度的酶處理植物細胞, 將細胞壁解離,以獲得原生質體的方法。由于植物細胞壁的主要成分為纖維素、半纖維素、果膠等，所以酶解法去壁常用的酶主要有纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶等。正常狀態下,細胞壁對原生質體具有保護和支持作用。但在制備原生質體時將細胞壁去除后, 裸露的原生質體很可能由于其內外滲透壓的不同而發生吸水脹破或失水皺縮。因此,在酶液中必須加滲透穩定劑以保護原生質體的活力和質膜的穩定性。此外，酶液的濃度為使細胞發生輕度的質壁分離為宜[1]。

3 如何誘導原生質體融合

誘導原生質體融合的方法有化學誘導和物理誘導兩種。化學法又可分為離子誘導融合法、高鈣-高pH法、PEG(聚乙二醇)法等。離子誘導融合法常用的鹽類離子有硝酸鈉、硝酸鉀、硝酸鈣、氯化鈣等。由于PEG法對原生質體毒性小、易操作、成本低、不需特殊設備，融合子產生的異核率較高，且融合過程不受物種限制。因此，該方法在植物體細胞雜交中被廣泛使用。物理誘導融合方法有離心、振蕩、顯微操作和電融合等。目前,電融合法得到廣泛應用。電融合法是在融合儀的控制下在融合小室內進行的，其突出的優點是各種指標都可精細調節控制，融合效率均比其他方法高[2]。

4 如何篩選異型核的雜種細胞

原生質體間的融合是隨機的，兩個不同親本的原生質體混合后經誘導融合，實際上得到的是各種原生質體的混合物，包括異核體(AB型)、同核體(AA和BB)以及未發生融合的雙親原生質體(A和B)。而植物體細胞雜交的目的是要突破不同種屬的植物遠緣雜交不親和的障礙，獲得具有雙親遺傳特性的新的植物類型。因此，需要通過篩選獲得異核體即雜種細胞。

篩選雜種細胞的常用方法有：①互補選擇法。這種方法的原理是利用現成的或誘發產生的各種缺陷型或抗性型的突變體細胞作為融合實驗的材料。由于突變體均不能在特定的選擇性培養基上生長，而能在該培養基上正常生長的是互補的雜種細胞，因此可將其篩選出來。②機械選擇法。利用兩種原生質體的某些可見標志(如形態、顏色等差異)，對融合產物進行鑒別，篩選出雜種細胞進行單獨培養。對于在形態、顏色上難以區分的原生質體融合形成的異核體，可利用不同熒光素分別標記兩親本的原生質體，然后進行誘導融合，在熒光顯微鏡下選擇同時帶有兩種熒光標記的雜種細胞[3]。③組織培養篩選法。根據植物細胞對培養基成分和培養條件的要求與反應不同，可作為選擇雜種細胞的依據。利用這種特性或人為地造成雜種細胞生長和分化能力的差異來進行雜種細胞的選擇[4]。

5 如何鑒定雜種植株

在雜種植株的鑒定工作中，傳統方法常利用形態學特征[4]作為鑒定指標。例如，葉片的大小、形狀、葉脈、葉柄，花朵的顏色與結構等特征作為鑒定指標。但這種方法很難將雜種細胞的變異與非整倍體或培養條件引起的體細胞克隆的無性系變異區分開來。

細胞學染色體的觀察也是鑒定雜種植株的常用方法。因為自然物種的染色體數是恒定的。不過，通過染色體數和染色體顯帶技術來鑒定特異的染色體，往往不能排除培養過程中所造成的染色體丟失等變異。

在體細胞雜種鑒定中應用最普遍的生化方法是同工酶分析法。其依據是體細胞雜種的同工酶譜可表現為雙親酶帶的總和，或同時出現雙親特有的譜帶，或者也有可能出現新的雜種帶和丟失部分親本帶[1]。

目前，應用 DNA重組技術從分子水平上來鑒定雜種的方法受到很多科學家的青睞。由于每個物種都有其特定的RFLP圖譜，即限制性內切酶片段長度多態性指紋圖譜。用物種特異的重復DNA作探針，與 DNA限制片段雜交以后，就可以根據特異的圖譜鑒定出雜種[2]植株。

6 如何確定雜種植株的染色體數目和基因型

植物體細胞雜交即兩個細胞融合成一個細胞，如果不發生細胞核或染色體的丟失，則不管染色體數、基因型、基因組數還是染色體組數都是兩者之和，屬于染色體變異。例如，某植物細胞含2N條染色體，2個染色體組，基因型為AaBb；另一植物細胞含有2M條染色體，2個染色體組，基因型為ccDd。則雜種植株細胞含染色體2N+2M條，含染色體組4個，屬于4倍體，其基因型為AaBbccDd。

7 雜種植株可育嗎

單從理論上分析，雜種植株是否可育，取決于其能不能正常進行減數分裂，產生正常的生殖細胞，如若可以則是可育的，否則就是不育。例如，兩種親本細胞都是二倍體，雜種細胞就含有雙親細胞的各兩個染色體組，能夠進行正常的減數分裂，產生正常配子且是可育的；如果是兩種植物的花粉細胞雜交的雜種植株，由于染色體不能正常聯會形成正常配子，就是不育的，但若用秋水仙素處理，使染色體數目加倍，就能正常進行減數分裂，產生正常配子且就成為可育的了。而現實的情況是，雜種植株的形成過程中往往會發生細胞核或染色體的丟失等現象，大多不能形成正常配子且是不育的。