有機雙光子pH熒光探針研究進展

楊志廣 李寧寧 張旭亮 孔輝華 郭 達 劉亞麗

(河南省周口師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院 466001)

細胞內(nèi)pH在生命體系許多生理過程中扮演著重要角色，包括細胞的代謝、生長、增殖、凋亡、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及離子轉(zhuǎn)運等。研究發(fā)現(xiàn)，pH值的微小變化就有可能導(dǎo)致細胞功能紊亂，如引起癌癥、腎衰竭、肺病、阿爾茨海默病等疾病。因此，檢測細胞內(nèi)pH的動態(tài)變化對于研究細胞的生理和病理過程具有十分重要的意義。熒光探針法因具有操作簡便、靈敏度高、選擇性好以及對細胞無損傷等特點，在檢測細胞內(nèi)pH變化中得到了廣泛的應(yīng)用。pH熒光探針主要是通過識別基團的質(zhì)子化或去質(zhì)子化來改變探針分子的熒光信號而實現(xiàn)pH響應(yīng)的一類物質(zhì)，大體可分為兩類：一類是pH在6.80～7.40范圍內(nèi)靈敏響應(yīng)的細胞質(zhì)探針；另一類是pH在4.50～6.00范圍內(nèi)靈敏響應(yīng)的酸性細胞器探針，如溶酶體探針。與傳統(tǒng)的單光子熒光探針相比，雙光子熒光探針具有近紅外光激發(fā)、光毒性小和光漂白、自發(fā)熒光干擾弱以及組織穿透深度大等優(yōu)點。特別是雙光子共聚焦成像在細胞中能夠延長活細胞和組織的觀察時間[1～3]，這一獨特優(yōu)勢使得雙光子熒光探針技術(shù)在生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有強大的發(fā)展?jié)摿蛷V闊的應(yīng)用前景。本文介紹了有機雙光子吸收的基本原理以及近年有機雙光子pH熒光探針的研究現(xiàn)狀，同時對有機雙光子pH熒光探針未來的發(fā)展趨勢進行了展望。

1 雙光子吸收基本原理

眾所周知，單光子吸收一般是利用紫外或可見光激發(fā)熒光分子，只有當(dāng)吸收的一個光子的能量與基態(tài)和激發(fā)態(tài)之間的能量差相匹配時才會發(fā)生。而雙光子吸收是指在脈沖激光等強光激發(fā)下，在較短的時間內(nèi)，經(jīng)過一個中間虛擬態(tài)，介質(zhì)分子同時或者先后吸收兩個相同或者不同頻率的光子，從基態(tài)向激發(fā)態(tài)躍遷的過程。與傳統(tǒng)的單光子吸收線性過程相比，雙光子吸收強度與激發(fā)光強度的平方成正比，是一個非線性過程。另外，雙光子吸收為長波激發(fā)(700～1100 nm)短波發(fā)射，光損傷、光漂白、光毒性都較小，自發(fā)熒光干擾弱，而單光子吸收為短波激發(fā)(≤400 nm)長波發(fā)射，容易造成光損傷、光漂白和背景顏色的干擾。因此，雙光子吸收在生物醫(yī)學(xué)、材料、信息等多領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

2 有機雙光子pH熒光探針研究現(xiàn)狀

目前文獻報道的有機pH熒光探針多數(shù)為單光子熒光探針。有關(guān)雙光子pH熒光探針的報道相對較少，特別能夠?qū)崟r成像活細胞內(nèi)pH值動態(tài)變化的雙光子熒光探針更少。Park等[4]設(shè)計合成了一個比率雙光子pH熒光探針NP1。該探針雙光子活性吸收截面大，光穩(wěn)定性好，生物毒性低，能夠進入活細胞，并能深入人體胃和食管組織90～180 μm處進行雙光子熒光比率成像，為各種人體組織中pH的檢測與非糜爛性反流病的診斷提供了強有力的幫助。Kong等[5]首次報道了基于以碳點(C-Dot)為基礎(chǔ)的無機-有機納米復(fù)合體系雙光子pH熒光探針CD-TPY。該探針靈敏度高，選擇性好，檢測pH值范圍寬，具有低毒性、光穩(wěn)定性好、良好的生物相容性和細胞通透性，能夠成功應(yīng)用于活細胞生理pH值以及活組織深度達65～185 μm的雙光子生物熒光成像，為未來以碳點為基礎(chǔ)進行設(shè)計合成檢測生物體內(nèi)金屬離子、蛋白質(zhì)、DNA和其他的生物相關(guān)分析物的雙光子熒光探針提供了新思路和方法。

Kim等[6]報道了一系列基于苯并咪唑衍生物檢測酸性pH的雙光子比率熒光探針BH(BH1-3和BH1L)。研究表明，這些探針具有細胞加載方便、毒性低、光穩(wěn)定好等特點，當(dāng)酸度指數(shù)(pKa)值在4.9～6.1時范圍時，具有較強的雙光子激發(fā)熒光，熒光顏色從藍色向綠色轉(zhuǎn)變，同時出現(xiàn)一個明顯的等發(fā)射點，可以定量分析細胞內(nèi)pH的變化。利用雙光子熒光顯微技術(shù)，探針BH1L還可以直接實時地觀測活細胞內(nèi)和活老鼠大腦組織中溶酶體隔室的pH變化情況。這些研究成果證實，BH系列探針在生物醫(yī)學(xué)研究中具有重要的應(yīng)用價值。

Wang等[7]設(shè)計合成了一個用于活細胞和活組織成像并能定量測量活細胞內(nèi)pH的雙光子比率熒光探針CBT 。該探針擁有大的雙光子吸收截面、低毒性、較高的光學(xué)穩(wěn)定性、良好的細胞膜穿透性和優(yōu)良的生物相容性等特點，成功地實現(xiàn)了在HeLa細胞內(nèi)H+的雙光子熒光比率成像。同時該探針還可應(yīng)用于大鼠肝臟活組織切片的雙光子熒光顯微成像，成像深度可達66 μm，為進一步的生物細胞病理研究和臨床應(yīng)用提供了有力的支持。

Mao等[8]設(shè)計合成了首個利用激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移(ESIPT)和分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(ICT) 雙重響應(yīng)機理檢測細胞內(nèi)pH變化的多色雙光子熒光探針BNO。研究表明，由于ESIPT效應(yīng)，該探針在中性和弱堿性環(huán)境中無熒光，一旦在酸性和強堿性環(huán)境中，熒光迅速增強，同時發(fā)射不同顏色的熒光(酸性環(huán)境顯示綠色，堿性環(huán)境顯示青色)。此外，該探針具有pH值響應(yīng)范圍寬、靈敏度高、選擇性好、光穩(wěn)定好、探針毒性低等特點，成功實現(xiàn)了跟蹤細胞內(nèi)pH的動態(tài)變化和雙光子熒光顯微成像。

Sarkar等[9]以三苯基季磷鹽陽離子為線粒體識別基團成功開發(fā)了一個能夠定量成像活細胞和活組織線粒體內(nèi)pH變化的雙光子比率熒光探針CMP1。該探針具有細胞加載方便、選擇性好、細胞毒性低、較強的線粒體定位能力等優(yōu)點，當(dāng)pH在6.0～9.0范圍變化時，熒光發(fā)生從黃色到紅色的顏色變化，實現(xiàn)了活細胞中線粒體內(nèi)pH的雙光子比率熒光成像。而成像結(jié)果表明細胞線粒體內(nèi)pH分布存在異質(zhì)性，細胞核處的線粒體內(nèi)pH高于細胞外圍的線粒體，該探針為在生物醫(yī)學(xué)中研究線粒體內(nèi)pH變化提供了一個強有力的工具。

Chen等[10]基于 A-π-D-π-A共軛體系設(shè)計合成了兩個專一性檢測活細胞中pH變化的雙光子比率熒光探針L1和L2。探針L1和L2具有靈敏度高、熒光量子產(chǎn)率高、雙光子吸收截面大、細胞毒性低以及生物相容性好等特點，實現(xiàn)了活細胞中pH變化的雙光子比率熒光成像，為重要的生物過程研究提供了一種有效的工具。

Dong等[11]首次報道了一個標記腫瘤細胞中溶酶體pH變化的雙光子熒光探針BN-lys。該探針在正常細胞中熒光較弱，而對腫瘤細胞中溶酶體pH表現(xiàn)出了較強的單-雙光子熒光響應(yīng)活性，具有靈敏度高、響應(yīng)速度快、生物毒性低、優(yōu)異的光穩(wěn)定性和可逆性等特點，實現(xiàn)了腫瘤細胞中溶酶體pH變化的雙光子熒光成像，有望在生物研究中具有重要的實際應(yīng)用價值。

3 展望

綜上所述，目前有機單光子pH熒光探針已有很多報道，而雙光子pH熒光探針報道相對較少，雖然取得了一定的發(fā)展，但仍存在一些問題，主要表現(xiàn)為以下幾個方面：①進一步探索合成雙光子pH熒光探針的新方法和種類，尋找大雙光子吸收截面、高熒光量子產(chǎn)率及大Stokes位移的有機雙光子pH熒光探針具有重要的研究意義；②開發(fā)生物透膜性好、生物相溶性好、能夠?qū)罴毎蜕顚咏M織成像(尤其對細胞器內(nèi)pH變化)的有機雙光子pH熒光探針是人們未來的一個研究重點；③發(fā)展毒性很低甚至無毒，實現(xiàn)多種活體細胞內(nèi)比率熒光成像的雙光子pH熒光探針是一個重要的發(fā)展方向。總之，有機雙光子pH熒光探針在生物、化學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)等方面具有潛在的應(yīng)用價值。