Y-box結合蛋白1過表達對肝內膽管癌患者術后輔助化療預后的影響

劉 衡，姜 莉，許曉勇，夏 俊，宋育林

(1安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 a.消化內科； b.肝膽外科，合肥 230022；2 合肥市第三人民醫(yī)院 檢驗科，合肥 230022)

Y-box結合蛋白1過表達對肝內膽管癌患者術后輔助化療預后的影響

劉 衡1a，姜 莉2，許曉勇1a，夏 俊1b，宋育林1a

(1安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 a.消化內科； b.肝膽外科，合肥 230022；2 合肥市第三人民醫(yī)院 檢驗科，合肥 230022)

目的 探討Y-box結合蛋白(YB)1過表達與肝內膽管癌患者術后輔助化療預后的關系。方法 收集2010年1月-2015年1月于安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院行手術治療并輔助術后化療的58例肝內膽管癌患者的石蠟標本。使用免疫組化方法檢測肝內膽管癌組織中YB-1表達情況，使用噻唑藍方法檢測YB-1質粒轉染肝內膽管癌細胞對吉西他濱藥物敏感性的改變。qPCR檢測YB-1質粒轉染肝內膽管癌細胞后多藥耐受基因表達改變情況。計量資料2組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗；Kaplan-Meier方法計算生存曲線，生存分析采用log-rank檢驗。結果 58例患者中44例(75.9%)患者YB-1在肝內膽管癌組織細胞胞漿中呈高表達(YB-1胞漿陽性組)，14例(24.1%)YB-1胞漿陰性(YB-1胞漿陰性組)；44例YB-1胞漿陽性患者中有18例(40.9%)癌組織的細胞中出現(xiàn)YB-1核染色陽性(YB-1胞核陽性組)，其余40例為YB-1胞核陰性組。YB-1胞核陰性組患者術后輔助化療生存時間顯著長于YB-1胞核陽性組患者(63 個月 vs 28 個月，χ2=17.99，P<0.05)。對照質粒組HCCC-9810對吉西他濱的半數(shù)抑制量(IC50)為0.054 μmol,YB-1過表達后pSG5-YB-1質粒轉染組IC50增加至0.460 μmol,較前者升高近10倍，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。pSG5-YB-1質粒轉染HCCC-9810細胞后，YB-1轉錄水平明顯升高(t=19.02，P<0.05)。HCCC-9810細胞在過表達YB-1之后多藥耐受蛋白(MDR)1、多藥耐受相關蛋白(MRP)1轉錄水均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(t值分別為13.34、11.35，P值均<0.05)。結論 YB-1在大多數(shù)肝內膽管癌組織中呈過表達，其中YB-1胞核陽性表達可能預示術后輔助化療效果不佳，與MDR1、MRP1多藥耐受基因表達后多藥耐受性的增加有關。

膽道腫瘤； Y盒結合蛋白質1； 藥物耐受性； 預后

Y-box結合蛋白(Y-box binding protein，YB)1作為一種與目的基因啟動子、增強子內部Y-box序列(5’-CTGATTGGCCAA-3’)特異性結合的轉錄因子，可發(fā)揮調節(jié)細胞增殖、分化、遷移等多種重要的生物學功能[1]。YB-1作為一種可分泌的多功能蛋白，其生物學功能不僅與其自身結構域有關，亞細胞定位也是重要的決定因素[2]。生理情況下YB-1大多定位于細胞漿中，作為包裝信使核糖核蛋白體的功能蛋白，起到調節(jié)mRNA翻譯、穩(wěn)定性以及定位的作用[2]。當細胞受到各種應激因素刺激(如紫外線、加熱、抗腫瘤藥物、感染等)時，YB-1可由胞漿轉移至胞核內，作為轉錄因子調節(jié)多種基因表達，同時還涉及DNA修復、復制以及前mRNA拼接[1-2]。目前關于YB-1在肝內膽管癌中表達的研究尚少，本研究通過免疫組化檢測YB-1在肝內膽管癌組織中的表達情況，并觀察YB-1過表達對肝內膽管細胞癌多藥耐受性的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2010年1月-2015年1月于安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院行手術治療并輔助術后化療的58例肝內膽管癌患者的石蠟標本，其中男32例，女26例，年齡41～77歲，中位發(fā)病年齡63歲。按照《2014 年美國肝膽胰學會共識聲明:肝內膽管癌管理》[3]臨床分期標準分為：Ⅲ期37例，Ⅳ期21例。術后給予吉西他濱聯(lián)合順鉑治療27例，吉西他濱聯(lián)合環(huán)磷酰胺15例，單用環(huán)磷酰胺10例，使用其他化療藥物6例。隨訪截止日期為2015年12月30日，中位隨訪26個月，2例失訪(失訪率3.4%)。

1.2 材料與試劑 人肝內膽管癌細胞株HCCC-9810購自中國科學院細胞庫，培養(yǎng)于含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基(購自Gibco公司)中，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。Lipofectamine2000轉染試劑購自Invitrogen公司，pSG5-YB-1質粒由德國奧托·馮·居里克大學Peter R Mertens教授惠贈，pSG5-Vector購自Agilent公司，噻唑藍購自碧云天生物科技研究所，高純度RNA提取試劑盒購自Roche公司，第一鏈cDNA反轉錄試劑盒和SYBR Green PCR熒光定量PCR試劑盒購自TaKaRa公司，兔抗人YB-1單克隆抗體購自Abcam公司，即用型兔超敏二步法免疫組織化學檢測試劑、二氨基聯(lián)苯胺顯色試劑盒購于北京中杉金橋生物科技有限公司。

1.3 免疫組化方法 將石蠟標本依次脫蠟、梯度水化、采用微波法進行抗原修復，1 mmol EDTA(pH 8.4)緩沖溶液微波抗原熱修復10 min，3%過氧化氫溶液沖洗，PBS清洗3次，山羊血清室溫封閉30 min，加入兔抗人YB-1單克隆抗體(1∶100)，4 ℃濕盒過夜，PBS清洗3次，順序滴加兔超敏免疫組化試劑1、2并清洗，二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木素復染，鹽酸酒精分化，中性樹膠封片。以PBS代替一抗作為陰性對照組，以已知的表達陽性的組織切片作為陽性對照組。由2位高資歷的病理醫(yī)師進行雙盲式閱片。在顯微鏡100倍視野下，每張切片隨機選擇5個區(qū)域，YB-1主要定位于細胞質，呈黃色顆粒樣，其中部分病例還出現(xiàn)胞核染色陽性。根據陽性細胞的比例和染色強度進行半定量積分：陽性細胞所占比例為0、1%～10%、11%～30%、31%～50%、51%～80%、81%～100%，依次計為0、1、2、3、4、5分；染色強度為：陰性、弱陽性(淡黃色)、中等陽性(棕黃色)和強陽性(棕褐色)，依次計為0、1、2、3分。免疫組化積分=陽性細胞占比分數(shù)×染色強度分數(shù)，理論分值為0～15分，其中≥3分判定為陽性表達，0～2分判定為無陽性表達。

1.4 質粒轉染 取對數(shù)生長期HCCC-9810細胞，采用Lipofectamine2000轉染法進行YB-1過表達治療轉染，操作流程按照說明書進行。48 h后取細胞用于后續(xù)實驗。

1.5 肝內膽管癌細胞對吉西他濱敏感性測定 分別取對照質粒組及pSG5-YB-1質粒轉染組的HCCC-9810細胞配制成1×105/ml的細胞懸液，以200 μl/孔接種于96孔，37 ℃孵育箱中培養(yǎng)6 h，使細胞貼壁。更換培養(yǎng)基后，按終濃度0.01、0.1、1、10、100 μmol分別向每組中加入吉西他濱，其中0 μmol組加入等體積PBS設為對照組。繼續(xù)培養(yǎng)48 h。采用噻唑藍方法檢測細胞增殖能力，每組設6個復孔。采用GraphPad Prim 6軟件分別計算對照質粒組、pSG5-YB-1質粒轉染組HCCC-9810對吉西他濱的半數(shù)抑制量(IC50)。

1.6 qPCR檢測 分別提取對照質粒組、pSG5-YB-1組HCCC-9810細胞RNA，轉錄合成cDNA，-20 ℃保存。多藥耐受蛋白(multi-drug resistance，MDR)1、多藥耐受相關蛋白(multi-drug resistant associate protein，MRP)1和乳腺癌耐藥相關蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)引物由上海生工生物技術工程服務有限公司合成，引物序列見表1。按照SYBR Green PCR熒光定量PCR試劑盒操作流程進行操作。

2 結果

2.1 免疫組化結果

2.1.1 YB-1蛋白在肝內膽管癌組織中的表達 58例患者中44例(75.9%)患者YB-1在肝內膽管癌組織細胞胞漿中呈高表達(YB-1胞漿陽性組)，14例(24.1%)YB-1胞漿陰性(YB-1胞漿陰性組)；58例患者中18例(40.9%)癌組織的細胞中出現(xiàn)YB-1核染色陽性(YB-1胞核陽性組,均為胞漿陽性)，其余40例為YB-1胞核陰性組。因此，YB-1在本研究的肝內膽管癌樣本中主要存在3種表達模式：YB-1胞漿陰性/胞核陰性(圖1a，b)、YB-1胞漿陽性/胞核陰性(圖1c，d)和YB-1胞漿陽性/胞核陽性(圖1e，f)。結合臨床資料分析發(fā)現(xiàn)，Ⅳ期(21例)肝內膽管癌組織中YB-1胞漿陽性表達率(18/21，85.7%)高于Ⅲ期患者(26/37，70.3%)，但2者間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。YB-1胞漿、胞核陽性表達率在不同性別、年齡、臨床分期組間比較差異亦無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)(表2)。

2.1.2 YB-1不同表達模式與術后輔助化療患者預后的關系 生存分析顯示，YB-1胞漿陽性組患者中位生存期為46個月，YB-1胞漿陰性組患者中位生存期為55個月，2組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖2)；YB-1胞核陽性組患者中位生存期僅28個月，但YB-1胞核陰性組中位生存期為63個月，2組間比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=17.99，P<0.05)(圖3)。

表1 引物序列

表2 YB-1表達與肝內膽管癌臨床參數(shù)的關系

圖1 YB-1在肝內膽管癌組織中的表達 a,b:YB-1胞漿陰性/胞核陰性; c,d:YB-1胞漿陽性/胞核陰性; e,f:YB-1胞漿陽性/胞核陽性

圖2 YB-1胞漿陽性組與陰性組患者術后輔助化療預后分析

圖3 YB-1胞核陽性組與陰性組患者術后輔助化療預后分析

2.2 YB-1過表達對肝內膽管癌細胞吉西他濱藥物敏感性的影響 對照質粒組HCCC-9810對吉西他濱的IC50為0.054 μmol，YB-1過表達后pSG5-YB-1質粒轉染組IC50增加至0.460 μmol，較前者升高近10倍，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖4)。

2.3 PCR結果 pSG5-YB-1質粒轉染HCCC-9810細胞后，YB-1轉錄水平明顯升高(t=19.02，P<0.05)，提示YB-1過表達實驗成功。HCCC-9810細胞在過表達YB-1之后MDR1、MRP1轉錄水均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(t值分別為13.34、11.35，P值均<0.05)，BCRP轉錄水平雖有升高趨勢，但與YB-1過表達前比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖5)。

圖4 YB-1過表達對肝內膽管癌細胞吉西他濱藥物敏感性的影響 *P<0.05

圖5 YB-1過表達對肝內膽管癌細胞MDR1、MRP1和BCRPmRNA表達的影響 *P<0.05

3 討論

肝內膽管癌是一種惡性度極高的原發(fā)肝臟腫瘤，手術是目前唯一可能治愈的手段[4]。然而由于本病早期癥狀不典型，大多數(shù)患者確診時已失去手術機會。因此，對于大部分無法手術的進展期患者來說，化療成為唯一可能改善患者預后的治療手段，但療效卻不容樂觀[4-5]。腫瘤細胞常出現(xiàn)多藥耐受性表型，是化療失敗的主要原因[6]。其中腫瘤細胞高表達藥物外排泵蛋白將細胞內抗腫瘤藥物排至細胞外是其形成多藥耐受性表型的重要機制之一[7]。

本研究結果顯示，YB-1在75.9%肝內膽管癌組織中高表達，主要表達于癌細胞胞漿，其中有40.9%合并胞核陽性表達。Yasen等[8]在肝細胞癌組織中發(fā)現(xiàn)，YB-1染色陽性率為89%(73/83)，其中11.0%(8/73)還同時存在YB-1胞核染色陽性。肝癌中YB-1胞漿高表達與腫瘤門靜脈侵犯和更晚的臨床分期有關。但在本研究中，肝內膽管癌細胞YB-1陽性表達與患者年齡、性別和臨床分期無顯著相關性。這可能與本研究的納入對象以中晚期患者為主有關。進一步生存分析顯示，YB-1胞核表達與肝內膽管癌術后輔助化療預后不佳明顯相關，而單純YB-1胞漿表達與患者預后無明顯相關性。因此，肝內膽管癌組織中出現(xiàn)YB-1胞核陽性表達提示患者術后輔助化療預后不佳，與Yasen等[8]獲得的結果相似。

既往研究[2]顯示，YB-1蛋白過表達能夠增加腫瘤多藥耐受性。本研究YB-1過表達后HCCC-9810細胞對吉西他濱的IC50升高約10倍，提示過表達YB-1蛋白后肝內膽管癌細胞對吉西他濱的藥物耐受性明顯增加。同時，HCCC0-9810過表達YB-1后MDR1和MRP1 mRNA水平均明顯升高。Shen等[9]在構建的5-氟尿嘧啶耐藥肝內膽管癌細胞株中也發(fā)現(xiàn)，MDR1和MRP1 mRNA表達水平明顯升高，而使用小干擾RNA抑制Wnt/β-catenin信號通路后，MDR1 mRNA表達水平隨之降低，細胞株的耐藥性也得到逆轉。在乳腺癌、卵巢癌、彌漫大B細胞淋巴瘤等相關研究[10-13]中，YB-1過表達或核轉移與MDR1表達水平增加明顯相關。因此，本研究結果表明YB-1蛋白過表達后可能誘導MDR1、MRP1基因表達，增加肝內膽管癌細胞多藥耐受性，從而導致術后輔助化療效果不佳。然而在一項結腸癌細胞的研究[14]中卻發(fā)現(xiàn)，過高熱誘導YB-1核轉移雖然能夠上調MDR1 mRNA水平，但對細胞耐藥性似乎并無明顯影響，這提示除YB-1途徑外，其他機制可能也參與了細胞多藥耐藥性的產生。

[1] LYABIN DN,ELISEEVA IA,OVCHINNIKOV LP.YB-1 protein:functions and regulation[J].Wiley Interdiscip Rev RNA,2014,5(1):95-110.

[2] ELISEEVA IA,KIM ER,GURYANOV SG,et al.Y-box-binding protein 1 (YB-1) and its functions[J].Biochemistry (Mosc),2011,76(13):1402-1433.

[3] ZHOU X,ZANG H,LIU HL.An excerpt of intrahepatic cholangiocarcinoma:expert consensus statement[J].J Clin Hepatol,2015,31(10):1584-1587.(in Chinese) 周霞,臧紅,劉鴻凌.《2014 年美國肝膽胰學會共識聲明:肝內膽管癌管理》摘譯[J].臨床肝膽病雜志,2015,31(10):1584-1587.

[4] RAZUMILAVA N,GORES GJ.Classification,diagnosis,and management of cholangiocarcinoma[J].Clin Gastroenterol Hepatol,2013,11(1):13-21.

[5] WANG X,LI XC.Research advances in palliative treatment of cholangiocarcinoma[J].J Clin Hepatol,2016,32(5):1022-1025.(in Chinese) 王荇,李相成.膽管癌姑息治療的研究進展[J].臨床肝膽病雜志,2016,32(5):1022-1025.

[6] KACHALAKI S,EBRAHIMI M,MOHAMED KHOSROSHAHI L,et al.Cancer chemoresistance; biochemical and molecular aspects:a brief overview[J].Eur J Pharm Sci,2016,89:20-30.

[7] LI W,ZHANG H,ASSARAF YG,et al.Overcoming ABC transporter-mediated multidrug resistance:molecular mechanisms and novel therapeutic drug strategies[J].Drug Resist Updat,2016,27:14-29.

[8] YASEN M,KAJINO K,KANO S,et al.The up-regulation of Y-box binding proteins (DNA binding protein A and Y-box binding protein-1) as prognostic markers of hepatocellular carcinoma[J].Clin Cancer Res,2005,11(20):7354-7361.

[9] SHEN DY,ZHANG W,ZENG X,et al.Inhibition of Wnt/beta-catenin signaling downregulates P-glycoprotein and reverses multi-drug resistance of cholangiocarcinoma[J].Cancer Sci,2013,104(10):1303-1308.

[10] FUJITA T,ITO K,IZUMI H,et al.Increased nuclear localization of transcription factor Y-box binding protein 1 accompanied by up-regulation of P-glycoprotein in breast cancer pretreated with paclitaxel[J].Clin Cancer Res,2005,11 (24 Pt 1):8837-8844.

[11] XU W,ZHOU L,QIN R,et al.Nuclear expression of YB-1 in diffuse large B-cell lymphoma:correlation with disease activity and patient outcome[J].Eur J Haematol,2009,83(4):313-319.

[12] ODA Y,OHISHI Y,BASAKI Y,et al.Prognostic implications of the nuclear localization of Y-box-binding protein-1 and CXCR4 expression in ovarian cancer:their correlation with activated Akt,LRP/MVP and P-glycoprotein expression[J].Cancer Sci,2007,98(7):1020-1026.

[13] VAIMAN AV,STROMSKAYA TP,RYBALKINA EY,et al.Intracellular localization and content of YB-1 protein in multidrug resistant tumor cells[J].Biochemistry (Mosc),2006,71(2):146-154.

[14] STEIN U,JüRCHOTT K,WALTHER W,et al.Hyperthermia-induced nuclear translocation of transcription factor YB-1 leads to enhanced expression of multidrug resistance-related ABC transporters[J].J Biol Chem,2001,276(30):28562-28569.

引證本文：LIU H,JIANG L,XU XY,et al.Effect of Y-box binding protein 1 overexpression on the prognosis of patients with intrahepatic cholangiocarcinoma undergoing postoperative adjuvant chemotherapy[J].J Clin Hepatol,2017,33(2):324-328.(in Chinese)

劉衡，姜莉，許曉勇，等.Y-box結合蛋白1過表達對肝內膽管癌患者術后輔助化療預后的影響[J].臨床肝膽病雜志,2017,33(2):324-328.

(本文編輯：林 姣)

Effect of Y-box binding protein 1 overexpression on the prognosis of patients with intrahepatic cholangiocarcinoma undergoing postoperative adjuvant chemotherapy

LIUHeng,JIANGLi,XUXiaoyong,etal.

(DepartmentofGastroenterology,TheFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230022,China)

Objective To investigate the association between Y-box binding protein 1 (YB-1) overexpression and the prognosis of patients with intrahepatic cholangiocarcinoma (ICC) undergoing postoperative adjuvant chemotherapy.Methods The paraffin-embedded specimens were collected from 58 patients with ICC who underwent surgical treatment and postoperative adjuvant chemotherapy in The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University from January 2010 to January 2015.Immunohistochemistry was used to measure the expression of YB-1 in ICC tissue; after ICC cells were transfected with YB-1 plasmid,the thiazolyl blue method was used to observe the change in gemcitabine sensitivity,and qPCR was used to observe the changes in the expression of multidrug resistance genes.The independent samplest-test was used for comparison of continuous data between two groups and a one-way analysis of variance was used for comparison of continuous data between multiple groups; the chi-square test was used for comparison of categorical data between groups.The Kaplan-Meier method was used to calculate survival rates and the log-rank test was used for survival difference analysis.Results Among the 58 patients,44 (75.9%) had high expression of YB-1 in the cytoplasm of ICC cells (cytoplasm YB-1 positive group) and 14 (24.1%) had no expression of YB-1 in the cytoplasm of ICC cells (cytoplasm YB-1 negative group).Of all patients in the cytoplasm YB-1 positive group,18 (40.9%) also had positive nuclear expression of YB-1 (nuclear YB-1 positive group); the other 40 patients had no nuclear expression of YB-1 (nuclear YB-1 negative group).The nuclear YB-1 negative group had a significantly longer survival time than the nuclear YB-1 positive group (63 months vs 28 months,χ2=17.99,P<0.05).In the control plasmid group,the half-maximal inhibitory concentration (IC50) of gemcitabine in HCCC-9810 cells was 0.054 μmol,and in the pSG5-YB-1 plasma transfection group,IC50increased to 0.460 μmol after YB-1 overexpression,which was 10 times higher than that in control plasmid group (P<0.05).There was a significant increase in the YB-1 transcriptional level after HCCC-9810 cells were transfected with pSG5-YB-1 plasmids (t=19.02,P<0.05).After YB-1 overexpression,HCCC-9810 cells had significant increases in the transcriptional levels of multidrug resistance protein 1 (MDR1) and multidrug resistance-associated protein 1 (MRP1) (t=13.34 and 11.35,bothP<0.05).Conclusion YB-1 overexpression can be found in most ICC tissues,and nuclear positive expression of YB-1 may indicate the poor effect of postoperative adjuvant chemotherapy,which may be associated with the increase in multidrug resistance after the expression of MDR1 and MRP1.

biliary tract neoplasms； Y-box-binding protein 1； drug tolerance； prognosis

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.02.026

2016-09-26；

2016-10-12。

2016年度安徽省高校省級科學研究項目(KJ2016A337)

劉衡(1982-)，男，主治醫(yī)師，博士，主要從事慢性肝病臨床和基礎研究。

宋育林，電子信箱：ylsongcn@163.com。

R735.8; Q513

A

1001-5256(2017)02-0324-05