苗藥黑骨藤配伍金鐵鎖的總皂苷含量測定

陳秋霞 李 江 楊 軼

貴陽中醫學院，貴州 貴陽 550002

藥物研究

苗藥黑骨藤配伍金鐵鎖的總皂苷含量測定

陳秋霞 李 江*楊 軼

貴陽中醫學院，貴州 貴陽 550002

目的：建立黑骨藤配伍金鐵鎖的總皂苷含量測定方法。方法：以齊墩果酸為對照，用5%的香草醛-冰醋酸及高氯酸進行顯色，在550nm波長下運用紫外-分光光度法對總皂苷含量進行測定。結果：齊墩果酸在0.002～0.012mg/mL濃度范圍與吸光度呈良好的線性關系，回歸方程A=62.4C-0.0101，r=0.9991，回收率為96.19%，RSD為1.43%。結論：建立了黑骨藤配伍金鐵鎖回流提取法中總皂苷含量測定方法，該方法快速、簡便，精密度和穩定性良好，可用于黑骨藤配伍金鐵鎖復方制劑的質量控制。

黑骨藤；金鐵鎖； 配伍；總皂苷； 紫外-可見分光光度法

黑骨藤與金鐵鎖均為貴州十大苗藥，兩藥均可用于風濕疼痛[1]。黑骨藤為蘿摩科杠柳屬植物黑龍骨PeriplocaforrestiiSchltr的干燥根或全株，有通經、活血、解毒，祛風的功效，用于風濕關節炎痛、跌打損傷等[2]；金鐵鎖為石竹科金鐵鎖屬植物金鐵PsammosilenetunicoidesW．C．Wu et C．Y．Wu的干燥根，具有祛風除濕，散瘀止痛，解毒消腫，用于風濕痹痛，胃脘冷痛，跌打損傷，外傷出血等[3]。本實驗研究的復方是國家名老中醫邱德文教授用于類風濕關節炎的臨床經驗方，兩藥配伍療效確切。本方是由黑骨藤與金鐵鎖組成，處方用量比例黑骨藤∶金鐵鎖為6∶1，金鐵鎖為國家2級保護稀有植物。本課題組在前期對于兩藥配伍的不同極性提取物的鎮痛、抗炎作用進行研究，發現在相同劑量下，70%乙醇提取物的鎮痛抗炎作用顯著優于水提取物的鎮痛抗炎作用[4]，且進一步實驗研究發現兩藥配伍后的總皂苷具有抗類風濕關節炎的作用(待發表)，故對兩藥配伍的70%乙醇提取物中總皂苷的含量進行研究，以期為建立兩者組成的復方的質量標準提供相關理論依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器 紫外分光光度計GBC Cintra 20(澳大利亞照生公司)；RE-2000型旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)；BT 125D 型分析天平(Sartorius，德國賽多利斯)；恒溫水浴鍋(江蘇國勝實驗儀器廠)。

1.2 材料 黑骨藤采于貴州烏當區，經貴陽中醫學院劉芃教授鑒定為蘿摩科杠柳屬植物西南杠柳PeriplocaforrestiiSchltr的根；金鐵鎖采于貴州威寧縣，經貴陽中醫學院劉芃教授鑒定為石竹科金鐵鎖屬植物金鐵鎖PsammosilenetunicoidesW.C.Wu et c.Y.Wu的根；齊墩果酸(批號：110709-200304，中國藥品生物制品檢定所提供)；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 供試品溶液的制備 精密稱定配伍藥材(黑骨藤∶金鐵鎖=6∶1)粉末(過60目篩)2.0g，加50倍量的70%乙醇，80℃水浴中冷凝回流提取3次，每次2h，濾過，合并濾液。將濾液減壓濃縮至干，用25mL水分散(混懸液)，依次用石油醚、正丁醇分別萃取3次，每次25mL，棄去石油醚萃取液，合并正丁醇萃取液，減壓回收溶劑，用甲醇定容至10mL容量瓶中，作為供試品溶液。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取齊墩果酸(不溶于水，在甲醇中溶解性好)對照品適量，加甲醇溶解配制成質量濃度為0.2mg/mL的對照品溶液。

2.3 含量測定方法及測定波長的選擇[5]精密吸取0.2mL對照品溶液和供試品溶液于10mL具塞試管中，水浴揮干甲醇，分別加入5% 香草醛-冰醋酸溶液(鮮配鮮用)0.2mL和高氯酸溶液0.8mL，于60℃水浴中顯色15min，取出后立即用冰水冷卻5min，再加冰醋酸至10mL，搖勻，靜置10min，以甲醇同法制備空白參比。在200～700nm 范圍進行掃描，兩者均在550nm處有最大吸收。見圖1、2。

2.4 標準曲線制備 分別精密吸取對照品溶液 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL于10mL具塞試管中，按“2.3 ”項下自“水浴揮干甲醇”起依法操作，在550nm處測定吸光度。以吸光度(A)為縱坐標、質量濃度(C)為橫坐標進行線性回歸。見圖3。

結果表明，齊墩果酸在0.002～0.012mg/mL濃度范圍與吸光度成呈良好的線性關系，回歸方程：A=62.4C-0.0101，r=0.9991。

2.5 穩定性試驗 精密吸取0.2mL供試品溶液，按“2.3” 項下自“水浴揮干甲醇”起依法操作，在90min內每隔10min時，在 550nm處測定一次吸光度。供試品溶液吸光度RSD為1.12%，表明供試品溶液顯色后，在90min內基本穩定。

2.6 精密度試驗 精密吸取0.2mL對照品溶液，共6份，按“2.3” 項下自“水浴揮干甲醇”起依法操作，在90min內，550nm處測定吸光度。結果表明，對照品吸光度RSD為1.11%，表明該方法的精密度良好。

2.7 重復性試驗 取同一批次配伍藥材各6份，按“2.1”項下方法操作制備供試品溶液，按“2.3” 項下自“水浴揮干甲醇”起依法操作，在550nm處測定吸光度，結果總皂苷含量RSD為1.27%。

2.8 加樣回收試驗 精密稱取“2.7”項下已知含量的同一批次配伍藥材1.0g，共6份，分別加入等量齊墩果酸對照品適量，按“2.1”項下和“2.3” 項下方法操作，在550nm處測定吸光度，并計算回收率。見表1。

表1 加樣回收率實驗結果 (n=6)

2.9 供試品提取條件的正交試驗 根據可能影響總皂苷醇提取的因素，以乙醇用量(A)、提取溫度(B)、提取時間(C)、提取次數(D)作為考察因素，每個因素取3個水平，提取液減壓濃縮至干，用25mL水分散(混懸液)，依次用石油醚、正丁醇分別萃取3次，每次25mL，棄去石油醚萃取液，合并正丁醇萃取液，減壓回收溶劑，用甲醇定容至10mL容量瓶中，作為正交試驗樣品，以總皂苷含量為主要考察指標。采用L9(34)正交設計，對配伍藥材提取工藝進行優化。因素水平表、試驗安排表、方差分析表見2～4。

表2 總皂苷提取正交試驗因素水平表

表3 總皂苷提取正交試驗安排

表4 方差分析表

方差分析表明，各因素對處方中總皂苷的含量提取均無顯著性影響。極差分析，表明四個因素對處方中總皂苷含量的提取影響因素大小順序為A>B>D>C，優選工藝為A2B3C3D3,，即藥材用50倍量70%乙醇，80℃回流提取3次，每次2h。

2.10 樣品含量的測定 精密稱定藥材粉末2.0g，按正交試驗結果制備供試品溶液，按“2.3 ”項下自“水浴揮干甲醇”起依法操作，在550nm處測定吸光度，以齊墩果酸計，計算樣品中總皂苷的含量。見表5。

表5 黑骨藤配伍金鐵鎖總皂苷含量測定

3 討論

實驗采用正交設計試驗對供試品回流提取條件進行考察，采用紫外-可見分光光度計法，以齊墩果酸為對照品，香草醛-高氯酸法顯色，對配伍中藥材中的總皂苷的含量測定進行了方法學考察。本法操作簡單、準確性高、重復性好，可為黑骨藤配伍金鐵鎖復方的質量控制研究提供了有效手段。為減少誤差， 稱樣、 加入顯色劑等操作均應由專人操作，所用的香草醛-冰醋酸溶液應現配現用，否則空白值的顏色會加深，影響測定的結果。

文獻報道采用熊果酸、齊墩果酸分別用于黑骨藤、金鐵鎖的含量測定[6-7]。熊果酸與齊墩果酸果酸均屬于五環三萜類成分，分別為烏蘇烷型、齊墩果烷型，兩種類型在分子結構上甲基位置不同，但其母核均為五環型[8]。在測定波長的選擇過程中，分別對熊果酸、齊墩果酸進行波長掃描(200～700nm)，結果均在550nm處由最大吸收，結合實驗成本，選用齊墩果酸作為對照品。

[1]邱德文,杜江.貴州十大苗藥[M].北京：中國古籍出版社,2008.

[2]貴州省藥品監督管理局.貴州省中藥材、民族藥材質量標準 [M].貴州：貴州科技出社,2003:381.

[3]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京：中國醫藥科技出版社,2015:220-221.

[4]王文春,李江,童宏龍.苗藥黑骨藤配伍金鐵鎖不同提取物鎮痛抗炎作用研究[J].時珍國醫國藥,2014,25(12):2821-2823.

[5]劉亮,杜江,潘爐臺，等.苗藥觀音草中總皂苷的含量測定[J].中國民族民間醫藥,2011(4):2-3.

[6]申海艷,龔小見,李文敏，等.苗藥黑骨藤中總皂苷含量的測定[J].中國實驗方劑學雜志,2012,18(11):94-97.

[7]王龔,周欣.金鐵鎖總皂苷含量測定[J].貴州師范大學學報,2012,5(6):4-6.

[8]匡海學.中藥化學[M].北京：中國中醫藥出版社,2003:221-222.

國家自然科學基金(No.81160426)。

陳秋霞(1992-)，女,漢族，研究方向為中藥及民族藥藥物新制劑及新劑型的研究。E-mail：1194880454@qq.com

李江(1973-)，男,漢族,博士，教授，碩士生導師，研究方向為中醫方劑配伍和民族藥物系統研究與開發。

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1007-8517(2017)03-0030-03

2016-11-22 編輯：穆麗華)