慢性牙周炎患者唾液蛋白酶譜分析

李倩 周學東 樊亞平 楊騰宇 吳松濤 余宇 陳嬌 張平 馮云

口腔疾病研究國家重點實驗室 華西口腔醫院（四川大學），成都 610041

·基礎研究·

慢性牙周炎患者唾液蛋白酶譜分析

李倩 周學東 樊亞平 楊騰宇 吳松濤 余宇 陳嬌 張平 馮云

口腔疾病研究國家重點實驗室 華西口腔醫院（四川大學），成都 610041

目的 比較慢性牙周炎患者和牙周健康者的唾液蛋白譜差異，以期為慢性牙周炎的診斷和治療監測提供依據。方法 收集慢性牙周炎患者和牙周健康者刺激性唾液，采用蛋白芯片技術，對慢性牙周炎患者和正常人的唾液蛋白酶譜進行分析。結果 慢性牙周炎患者和牙周健康者唾液蛋白酶的表達具有統計學差異。其中，慢性牙周炎患者唾液中去整合素金屬蛋白酶（ADAM）8，基質金屬蛋白酶（MMP）-8、-12，腦啡肽酶/CD10，尿激酶纖維蛋白溶酶原激活劑/尿激酶的表達高于牙周健康者（P＜0.01）；ADAM9，含凝血酶敏感素基序的去整合素金屬蛋白酶（ADAMTS）1、13，組織蛋白酶B、E、L、V、X/Z/P，激肽釋放酶6、7、11、13，MMP-9，蛋白酶3、早老素1和前蛋白轉化酶9的表達低于牙周健康者（P＜0.05）。結論 慢性牙周炎患者的唾液蛋白酶譜與牙周健康者具有顯著差異，唾液蛋白酶譜分析將有望成為慢性牙周炎臨床診斷和治療監測的實驗檢查手段。

唾液； 慢性牙周炎； 蛋白酶譜

唾液是人體的重要體液成分之一，與人類的健康和疾病密切相關，具有重要的潛在研究價值。唾液中的蛋白在口腔免疫防御系統中發揮著重要作用，其中富脯蛋白、富酪蛋白、胱蛋白、富組蛋白、黏蛋白等主要功能蛋白質的作用已經研究得比較透徹[1-3]。蛋白酶是水解蛋白肽鍵的一類酶的總稱，作為一種特殊的蛋白質，蛋白酶還有待深入研究。蛋白酶通過裂解氨基酸的肽鍵，分離水解蛋白質，進而調節改變蛋白的生物學功能[4-5]。人唾液中的蛋白酶主要來源于宿主和細菌，這些蛋白酶在代謝調控中發揮著不同的功能。從某種角度來說，對蛋白酶的研究是對唾液研究的必要補充[6]。慢性牙周炎是一種發生在牙周支持組織的慢性感染性炎癥，引起牙周支持組織的破壞，最終導致牙齒的松動、脫落。近年來，對蛋白酶與慢性牙周炎關系的研究主要集中在基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）和組織蛋白酶（cathepsin），而慢性牙周炎與其他蛋白酶的關系研究甚少，這也亟待進一步探索。

蛋白芯片作為一種高通量監測系統，利用靶分子與捕捉分子相互作用的原理來監測蛋白分子間的作用。鑒于其高通量的優點，蛋白芯片正逐步成為蛋白研究的新工具。本實驗通過蛋白芯片技術比較慢性牙周炎患者和正常人唾液蛋白酶譜的差異，以期通過檢測唾液蛋白酶譜的變化為慢性牙周炎的發病機制、無創診斷、治療及監測提供一定的實驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料

Salivette唾液收集管（Sarstedt公司，德國），高速低溫離心機（Heraeus公司，德國），-80 ℃冰箱（Thermo公司，美國），pH檢測儀（上海久世環保科技有限公司）。

人蛋白酶芯片試劑盒（Human Protease Array Kit，R&D Systems公司，美國），其中包含：芯片膜、Array Buffer 4、Array Buffer 6、Wash Buffer液、Detection Antibody Cocktail、Streptavidin-HRP、Chemi Reagent 1、Chemi Reagent 2、4-Well-Multi-dish底物盤、透明蓋。X膠片（Kodak公司，美國），X射線攝影暗盒（中國蔚藍醫療器械有限公司），X膠片烘箱（上海萬銳實驗室設備有限公司），HP LaserJet M1522nf掃描儀（中國惠普有限公司），ImageJ軟件（美國國立衛生研究院）。

1.2 分組

本實驗中唾液樣本的收集經過四川大學華西口腔醫院醫學倫理委員會的嚴格審查和批準（審查項目編號：WCHSIRB-ST-2014-082），志愿者在完全知情的情況下簽署知情同意書。

由牙周科醫生按1999年牙周病分類國際研討會制定的慢性牙周炎的診斷標準[7]，從四川大學華西口腔醫院牙周科門診隨機選擇慢性牙周炎患者和牙周健康者各6例。

慢性牙周炎患者入選標準如下。1）每個象限至少3顆牙有牙周探診深度（probing depth，PD）≥5 mm且臨床附著喪失（clinical attachment loss，CAL）≥3 mm的位點，全口探診出血（bleeding on probing，BOP）（+）位點比例＞40%，口內余留牙齒多于20顆（至少包括4顆磨牙，不包括第三磨牙）；2）年齡段為18～55歲；3）所有研究對象全身健康，無近期用藥史、無系統性疾病及過敏史；4）女性未妊娠，未服避孕藥，且不在月經期；5）3個月內未服用過抗生素及非甾體類抗炎藥；6）無明顯牙體、黏膜疾病，無正在進行治療的口腔疾病，6個月內未進行過牙周治療。

牙周健康者納入標準如下：1）無PD≥4 mm或CAL＞1 mm的位點，BOP（+）位點比例＜10%；2）年齡段為18～55歲；3）所有研究對象全身健康，無近期用藥史、無系統性疾病及過敏史；4）女性未妊娠，未服避孕藥，且不在月經期；5）3個月內未服用過抗生素及非甾體類抗炎藥；6）無明顯牙體、黏膜疾病，無正在進行治療的口腔疾病，6個月內未進行過牙周治療。

1.3 收集刺激性唾液

各組入選者在唾液收集前禁止飲水，清水漱口后將唾液收集管中的棉卷置于口腔內咀嚼5 min，待棉卷完全浸濕后放入收集管內（如唾液中含血則棄之），置于冰盒內。

唾液樣本立即轉入離心管中，4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min后，吸取上清液，由0.2 μm濾器過濾除菌，-80 ℃冰箱保存備用。

1.4 蛋白芯片分析唾液樣本

唾液樣本及反應試劑于冰上解凍。在4-Well-Multi-dish底物盤中，加入2 mL Array Buffer 6反應液，輕微搖晃使反應液均勻地分布于底物盤中。用鑷子將芯片膜從避光袋中取出，平鋪在底物盤里（帶字母標識面朝上）。然后將底物盤平穩放置于搖床上，并確保反應液與芯片膜充分接觸，在室溫下孵育1 h。

取慢性牙周炎患者和牙周健康者的唾液樣本各1 mL，分別與0.5 mL Array Buffer 4反應液混合，使最終體積為1.5 mL。然后向其中加入15 μL Detection Antibody Cocktail，混勻該混合液，在室溫下孵育1 h。

移出4-Well-Multi-dish底物盤中的Array Buffer 6反應液，將孵育好的混合液置入底物盤中，蓋好蓋子，然后在低溫（2～8 ℃）、搖床上過夜（＞12 h）孵育。

用鑷子將芯片膜從底物盤里取出，置于一個新的塑料盤中（提前加入20 mL 1×Wash Buffer），在搖床上清洗10 min，重復此步驟，共3次。同時將4-Well-Multi-dish底物盤用蒸餾水清洗并干燥。

按1︰2 000的比例，用Array Buffer 6反應液稀釋Streptavidin-HRP。然后將2 mL稀釋好的Streptavidin-HRP反應液加入清潔后的4-Well-Multi-dish底物盤里，用鑷子將芯片膜再次置于底物盤中，蓋好蓋子后置于搖床上，在室溫下孵育30 min。隨后，將芯片膜取出、置于另一個含有20 mL的1×Wash Buffer的塑料盤里，在搖床上清洗10 min，重復此步驟，共3次。

用鑷子從塑料盤里取出芯片膜，置于一片塑料薄膜上，并用吸水紙擦掉多余的Wash Buffer。然后在芯片膜上均勻滴加1 mL Chemi Reagen混合液（Reagen1與Reagen2以1︰1的比例）。于室溫下孵育1 min之后，用另一片塑料薄膜覆蓋芯片膜（注意排除兩塑料薄膜間的氣泡，以確保芯片膜在兩塑料薄膜之間，且保持芯片膜與Chemi Reagen混合液的充分接觸）。

將制作完成的薄膜片置于X射線攝影暗盒內，放入膠片，蓋好暗盒，在X線下曝光10 min。X膠片經烘箱烘干后，采用CanoScan LiDE 700F掃描儀掃描，最后用ImageJ軟件記錄平均光密度值。

1.5 統計學處理

采用SPSS 19.0軟件對數據進行統計學分析，根據資料類型采用one-way ANOVA檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

美國R&D Systems公司的人蛋白酶芯片試劑盒可以一次性檢測34種蛋白酶（圖1）：去整合素金屬蛋白酶（disintegrin and metalloproteinase，ADAM）8、ADAM9；含凝血酶敏感素基序的去整合素金屬蛋白酶（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs，ADAMTS）1、ADAMTS13；cathepsin A、cathepsin B、cathepsin C、cathepsin D、cathepsin E、cathepsin L、cathepsin S、cathepsin V、cathepsin X/Z/P；激肽釋放酶（kallikrein）3/前列腺特異抗原（prostate specific antigen，PSA）、kallikrein 5、kallikrein 6、kallikrein 7、kallikrein 10、kallikrein 11、kallikrein 13；MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MMP-12、MMP-13；蛋白酶（proteinase）3、尿激酶纖維蛋白溶酶原激活劑（uridylyl phosphate adenosine，uPA）/尿激酶（urokinase）、二肽基肽酶（dipeptidyl peptidase-Ⅳ，DPPIV）/CD26、腦啡肽酶（neprilysin）/CD10、早老素1（presenilin-1）、前蛋白轉化酶（proprotein convertase）9。

圖 1 慢性牙周炎患者與牙周健康者的唾液蛋白酶譜比較Fig 1 Analysis of salivary protease spectrum between patients with chronic periodontitis and healthy people

蛋白酶譜和含量分析結果（圖1、2）表明，慢性牙周炎患者和牙周健康者唾液蛋白酶的表達具有統計學差異。1）ADAM和ADAMST家族：慢性牙周炎患者唾液中ADAM8的表達高于牙周健康者（P＜0.01），ADAM9、ADAMTS1、ADAMTS13的表達低于牙周健康者（P＜0.01）。2）cathepsin家族：慢性牙周炎患者唾液中cathepsin B、E、L、V、X/Z/P的表達低于牙周健康者（P＜0.05）。3）kallikrein家族：慢性牙周炎患者唾液中kallikrein 6、7、11、13的表達低于牙周健康者（P＜0.05）。4）MMP家族：慢性牙周炎患者唾液中MMP-8和MMP-12的表達高于牙周健康者（P＜0.01），MMP-9的表達低于牙周健康者（P＜0.01）。5）其他：proteinase 3、presenilin 1和proprotein convertase 9的表達低于牙周健康者（P＜0.01），neprilysin/CD10、uPA/urokinase的表達高于牙周健康者（P＜0.01）。

圖 2 34種蛋白酶的表達分析Fig 2 Analysis of expression of 34 proteases

3 討論

人類對唾液的研究已有悠久的歷史。由于唾液的來源與組成復雜，其生理學、臨床學意義等近年來才受到密切關注[8]。唾液研究之所以成為熱點，主要源于其簡單無創的采集方式；同時，與血液采集相比，唾液的采集方式對受檢者和檢驗者來說都是相對安全的；而且其貯存也十分簡易經濟。這些優點都使唾液受到臨床及科研人員的青睞[9-11]。隨著檢測技術的不斷更新與提升，研究[5-8]表明，全面、綜合的唾液分析對口腔及全身疾病的生理研究、病理分析和診斷都有很大的幫助。

蛋白酶是水解蛋白肽鍵的一類酶的總稱。它通過裂解連接氨基酸的肽鍵，分離水解蛋白質，進而調節改變蛋白的生物學功能[4-5]。慢性牙周炎是宿主針對牙周致病菌感染所發生的慢性炎癥反應性疾病，以牙周支持組織的破壞、降解為主要的病理特征。MMP和cathepsin均不同程度參與了牙周支持組織的降解過程，與慢性牙周炎的發生發展密切相關。其他唾液蛋白酶與慢性牙周炎的關系還有待進一步研究發現。

本研究顯示，慢性牙周炎患者和牙周健康者的唾液蛋白酶表達具有差異性：慢性牙周炎患者唾液中ADAM8、MMP-8、MMP-12、neprilysin/CD10、uPA/urokinase的表達高于牙周健康者（P＜0.01）；ADAM9，ADAMTS1，ADAMTS13，cathepsin B、E、L、V、X/Z/P，kallikrein 6、7、11、13，MMP-9，proteinase 3，presenilin-1和proprotein convertase 9的表達低于牙周健康者（P＜ 0.01）。

proteinase 3屬于PMNs的蛋白酶，即糜蛋白酶家族中的絲氨酸蛋白酶，主要儲存于中性粒細胞。研究[12-13]指出，proteinase 3與一些炎性及非炎性疾病相關，其在感染性肺炎中發揮一定的抗菌作用，同時也在腎小球腎炎、關節炎、天皰瘡等非感染性疾病中發揮著重要作用。本課題組[14]研究發現，無齲兒童唾液中的proteinase 3濃度明顯高于低度或重度齲病患兒。慢性牙周炎患者唾液中proteinase 3的降低機制尚不清楚，有待進一步闡明。

ADAM家族[15]是近年來發現的一類錨定于細胞膜的細胞表面蛋白家族，該家族成員具有顯著的結構特點：即含有4個較為保守的潛在功能域——蛋白水解域、粘連域、融合域和胞內信號域。從這些蛋白的結構域來看，其可能在胞外基質的水解、細胞—細胞、細胞—基質的粘連、細胞融合以及信號轉導等細胞功能活動中發揮著重要作用。ADAM家族廣泛參與各種生理活動，如組織形成、傷口愈合等；同時也參與腫瘤的形成、轉移等病理過程，如ADAM8、ADAM9在腫瘤的發生發展、轉移中起著重要作用。ADAMTS[16]屬于金屬蛋白水解酶家族成員，在人類基因組中已有19個ADAMTS家族成員被發現。ADAMTS基因的缺失、突變及其蛋白的過表達均可導致多種疾病的產生，如：ADAMTS1以及ADAMTS13的異常表達、活性下調與惡性腫瘤的侵襲、轉移密切相關。慢性牙周炎患者與牙周健康者唾液中ADAM家族的表達并不一致，其是否同MMP一樣參與了牙周支持組織的降解，這是一個很有意義的問題，其能否作為慢性牙周炎臨床診斷和治療監測的實驗室生物標記物也需要進一步探索。

uPA/urokinase[17]是一種絲氨酸蛋白酶，由成纖維細胞、單核細胞、中性粒細胞、上皮細胞、腫瘤細胞等合成。慢性牙周炎患者唾液中uPA升高可能是由牙周致病菌所引起的宿主免疫反應導致的。

neprilysin/CD10[18]是一種內源性阿片肽，各種內源性阿片肽與疼痛調控的關系都是當前研究的熱點。國內外大量文獻報道了牙髓疼痛與腦啡肽酶的關系，而目前尚無腦啡肽酶與慢性牙周炎關系的相關報道。

kallikrein是激肽系統的主要限速酶，是一組存在于多數組織和體液中的絲氨酸蛋白酶。激肽釋放酶-激肽系統作為內源性多酶系統，參與調控心血管、神經系統等的生理功能，與心臟病、腎病、炎癥反應、癌癥等疾病的發生密切相關[19-20]。研究[21]表明，kallikrein4在釉質的分泌、成熟過程中扮演著重要作用，其基因突變或缺失將導致釉質發生不全。kallikrein在慢性牙周炎患者的唾液中表達明顯降低，是否與其對牙周組織血管的調控密切相關，這可能成為對牙周炎研究的又一突破。

本研究雖然發現慢性牙周炎患者與正常人唾液蛋白酶的表達存在顯著差異，為研究蛋白酶與慢性牙周炎的關系開辟了更廣闊的前景；但這些蛋白酶的差異表達是否與慢性牙周炎的發生發展相關，是否可以作為評估慢性牙周炎嚴重程度的新指標成為口腔及全身健康狀態的新指標，目前都尚不明確。本課題組將進一步研究不同程度慢性牙周炎患者的唾液蛋白酶表達差異，深入發現慢性牙周炎發生發展過程中不同階段的唾液蛋白酶表達差異及不同類型牙周炎患者的唾液蛋白酶表達差異，希望通過對唾液蛋白酶的分析檢測為牙周炎的精確診斷、個性化治療、療效及預后評估提供更有效的輔助方法。

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（本文編輯 李彩）

Analysis of salivary protease spectrum in chronic periodontitis

Li Qian, Zhou Xuedong, Fan Yaping, Yang Tengyu, Wu Songtao, Yu Yu, Chen Jiao, Zhang Ping, Feng Yun. (State Key Laboratory of Oral Diseases, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, China)
Supported by: The National Natural Science Foundation of China (81372892); Sichuan Province Science and Technology Innovation Team Program (JCPT 2011-9).

Objective This study aimed to investigate the difference in salivary protease expression in patients with chronic periodontitis and normal individuals. Methods The stimulating saliva in patients with chronic periodontitis and normal individuals were collected. Protein chip technology was adapted to analyze salivary protease spectrum. Results Among the 34 proteases in the chip, disintegrin and metalloproteinase (ADAM)8, matrix metalloproteinase (MMP)-8, MMP-12, neprilysin/ CD10, and uridylyl phosphate adenosine/urokinase showed a signifi cantly increased concentration in the saliva of chronic periodontitis patients compared with those in the saliva of normal individuals (P＜0.01). By contrast, the concentrations of ADAM9, a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs (ADAMTS)1, ADAMTS13, cathepsin B, E, L, V, X/Z/P, kallikrein 6, 7, 11, 13, MMP-9, proteinase 3, presenilin-1, and proprotein convertase 9 sharply decreased (P＜0.05). Conclusion The results demonstrated that protease spectrum in the saliva of chronic periodontitis patients and normal individuals signifi cantly differed. Analysis of salivary protease spectrum is a potential clinical method to examine, diagnose, and monitor chronic periodontitis.

saliva; chronic periodontitis; protease spectrum

R 781.4

A

10.7518/hxkq.2017.01.005

2016-02-16；

2016-06-10

國家自然科學基金（81372892）；四川省科技廳平臺建設項目（JCPT 2011-9）

李倩，碩士，E-mail：996462491@qq.com

馮云，副教授，博士，E-mail：953463551@qq.com

Correspondence: Feng Yun, E-mail: 953463551@qq.com.