基于軟骨細胞外基質的取向支架的制備及評價

李坤趙艷紅徐晨王連永楊強李洪發滕彬宏

1.天津醫科大學口腔醫院正畸科，天津 300070；2.煙臺市口腔醫院正畸科，煙臺 264000；3.南開大學生命科學學院生物活性材料教育部重點實驗室，天津 300071；4.天津市天津醫院脊柱外科，天津 300211

基于軟骨細胞外基質的取向支架的制備及評價

李坤1,2趙艷紅1徐晨1王連永3楊強4李洪發1滕彬宏1

1.天津醫科大學口腔醫院正畸科，天津 300070；2.煙臺市口腔醫院正畸科，煙臺 264000；3.南開大學生命科學學院生物活性材料教育部重點實驗室，天津 300071；4.天津市天津醫院脊柱外科，天津 300211

目的 制備軟骨細胞外基質（CECM）取向多孔支架，評價其理化特性及對脂肪干細胞（ADSCs）的相容性。方法 切取新鮮豬關節軟骨片，勻漿后離心篩選出直徑50～500 nm左右的軟骨纖維，經Triton X-100脫細胞后制備成濃度6%的CECM漿料，通過定向結晶和冷凍干燥后交聯即得CECM取向支架。對CECM取向支架的理化性能和細胞相容性進行評價。結果 CECM取向支架橫斷面為均勻的多孔網狀結構，孔壁上密布軟骨纖維，縱斷面為垂直管狀結構；支架呈蘇木精-伊紅紅染，甲苯胺藍、番紅O、天狼星紅染色均呈陽性；支架孔隙率、吸水率和縱向壓縮彈性模量分別為95.455%±0.910%、95.889%±1.071%和（40.208±5.097）kPa；ADSCs在支架上黏附和增殖，并均勻長入支架孔隙內。結論 CECM取向支架的成分與天然軟骨相似，生物相容性良好，孔隙結構、孔徑大小適于種子細胞黏附、增殖和長入，是一種比較理想的軟骨組織工程支架。

軟骨； 細胞外基質； 取向支架； 組織工程； 定向結晶； 冷凍干燥

由創傷、炎癥、腫瘤等引起的顳下頜關節軟骨組織缺損是臨床較常見的疾患。由于軟骨組織退變呈漸進性發展且自身修復能力極為有限，目前應用于臨床的多種治療方法如手術、軟骨移植等均不能達到令人滿意的治療效果。隨著組織工程技術的發展，組織工程化軟骨修復展現了其良好的臨床應用前景[1]。

軟骨組織工程主要包括支架材料、種子細胞和信號因子三要素[2]，其中，支架材料是組織工程構建的關鍵環節[3]。理想的組織工程軟骨支架材料應具有以下特征[4-6]：良好的生物相容性；促進細胞黏附與增殖；適當的可降解性；接近于正常關節軟骨的組織結構等。然而，目前尚未有一種支架材料能滿足以上全部特征。支架作為種子細胞的載體，不僅影響種子細胞的增殖與分化，而且還決定移植后能否與組織有效的結合，從而發揮其修復病變軟骨組織的作用。因此，開發性能優異的支架材料是軟骨組織工程的突破點。本實驗以豬關節軟骨細胞外基質（cartilage extracellular matrix，CECM）為材料，采用定向結晶及冷凍干燥技術，成功制備出取向性的仿生軟骨支架，并對其理化特性及與脂肪干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）的相容性進行了系列評價。

1 材料和方法

1.1 實驗主要材料、試劑及設備

新鮮豬關節軟骨購于天津市屠宰場；Triton X-100、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、DNase I、RNase A、苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）、碳二亞胺[1-ethyl-3-（3-dimethyllaminopropyl） carbodiimide，EDAC]、N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxy-succinamide，NHS）（Sigma-Aldrich公司，美國），膠原檢測試劑盒、糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）檢測試劑盒（Biocolor公司，英國），胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶、DMEM低糖培養基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（Gibco公司，美國），Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒（Dojinko公司，日本），Live/Dead染料（Life Technologies公司，美國），5810R型低溫高速離心機（Eppendorf公司，德國），FP40-HE型加熱制冷恒溫循環器（Julabo公司，德國），FD-1型冷凍干燥機（北京博醫康實驗儀器有限公司）。

1.2 豬CECM取向支架的制備

1.2.1 CECM凍干海綿的制備 切取新鮮豬關節軟骨片，采用pH7.5、0.01 mol·L-1Tris-HCl緩沖液（含0.035 mmol·L-1PMSF）浸泡軟骨片并以組織粉碎機粉碎為勻漿后，3 500 r·min-1離心15 min，提取上清液，沉淀繼續于Tris-HCl緩沖液中粉碎勻漿，反復勻漿、離心數次，直至離心后無沉淀或僅有少量沉淀。將提取的上清液9 000 r·min-1離心15 min后棄去上清，所剩沉淀即為直徑50～500 nm的軟骨纖維。加入pH7.5的含1%TritonX-100的Tris-HCl緩沖液（含0.035 mmol·L-1PMSF）混勻，在4 ℃下振蕩脫細胞12 h，9 000 r·min-1離心15 min后蒸餾水反復沖洗。加入含50 U·mL-1DNase Ⅰ與1 U·mL-1RNase A的酶消化緩沖液混勻，37 ℃下振蕩消化12 h，9 000 r·min-1離心15 min后超純水反復沖洗，冷凍干燥后即得到CECM凍干海綿，4 ℃保存備用。

1.2.2 CECM取向支架的制備及交聯 用超純水溶解CECM凍干海綿并配制為濃度6%的漿料后加入圓柱型聚丙烯模具（直徑15 mm，高30 mm，厚度1 mm），離心去氣泡，模具周圍以聚苯乙烯保溫材料包裹，底部暴露。將裝有CECM漿料的模具與保溫材料置于預冷至-20 ℃的循環冷卻液表面，使模具底部與循環冷卻液接觸，從而形成由模具頂部到底部的溫度梯度差，使CECM漿料由模具底部至頂部定向結晶，12 h后將模具及CECM轉移至冷凍干燥機中冰相升華干燥24 h定型支架，取出模具內支架浸泡于含50 mmol·L-1EDAC和20 mmol·L-1NHS的無水乙醇中37 ℃下交聯24 h，用超純水洗3 d，每天換水10次，然后50 ℃真空干燥箱內干燥12 h，將支架切成直徑5 mm、高2.5 mm的圓柱狀（圖1），輻照滅菌備用。

圖 1 CECM取向支架大體觀察Fig 1 The general observation of CECM oriented scaffold

1.3 CECM取向支架與兔ADSCs的復合

滅菌后的CECM取向支架置于12孔板中，每孔一個支架。將第三代兔ADSCs調節細胞密度至5× 106個·mL-1，吹勻。用1 mL注射器將細胞懸液注入支架內部至支架飽和，接種后將支架-細胞復合體移至37 ℃細胞培養箱中孵育1 h，翻轉支架后繼續孵育1 h，每孔加入2 mL含10%FBS的低糖DMEM培養基后于細胞培養箱中培養，每3天更換一次培養基，構建細胞-支架復合體。

1.4 CECM取向支架理化性能評價

掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）觀察：分別切取厚度為0.5 mm的CECM取向支架橫斷面和縱斷面，表面噴金處理后SEM觀察。

支架組織學染色：將支架于二甲苯中透明30 min后常規石蠟包埋，厚度10 μm橫斷切片，進行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）、甲苯胺藍、番紅O和天狼星紅染色觀察。

支架生化成分定量分析：將支架以胰蛋白酶完全消化后，分別以膠原檢測試劑盒和糖胺聚糖檢測試劑盒定量分析支架中總膠原含量和總糖胺聚糖含量（以牛硫酸軟骨素作為標準品）。

支架孔隙率測定：利用無水乙醇法測試支架的孔隙率。測試3次，取平均值。

支架吸水率測定：取支架5個浸于超純水中，接真空泵抽吸脫氣至無氣泡逸出，取出后擦凈支架表面水分，稱得質量m，然后將支架在50 ℃的真空干燥箱內干燥12 h，取出后稱得質量m0，吸水率X=（m-m0）/m。測試3次，取平均值。

支架力學性能測定：利用微材料力學測試系統檢測支架的縱向壓縮彈性模量，繪制支架應力—應變曲線。測試3個支架，取平均值。

1.5 CECM取向支架細胞相容性評價

支架浸提液毒性檢測：以含有10%FBS的低糖DMEM培養基浸泡支架48 h制備支架浸提液，取第一代兔ADSCs進行實驗，將200 μL細胞密度為1.0× 104個·mL-1的細胞懸液接種到96孔細胞培養板上，待細胞貼壁后加入支架浸提液培養（支架浸提液組），以含10%FBS的低糖DMEM培養基作為對照組，連續培養7 d，分別在培養1、3、5、7 d后采用CCK-8試劑盒檢測其對細胞增殖的影響。

細胞-支架復合體活-死（Live/Dead）細胞染色：細胞-支架復合體培養7 d后取出，加入Live/Dead染液，在激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞活性。

細胞-支架復合體SEM觀察：細胞-支架復合體培養48 h后取出，固定、脫水，干燥后切為厚度0.5 mm的薄片，表面噴金處理后SEM觀察。

細胞-支架復合體組織學染色：細胞-支架復合體培養7 d后取出，固定、脫水、二甲苯透明，常規石蠟包埋，厚度10 μm切片，HE染色觀察。

1.6 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件包進行分析，所有數據以均數±標準差的形式表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CECM取向支架的SEM觀察

SEM下可見，支架橫斷面呈均勻的多孔網狀結構，孔徑100～200 μm（圖2A），孔壁上密布軟骨纖維（圖2C、D，箭頭所示）；支架縱斷面呈垂直取向的管狀結構，管徑100～200 μm，孔隙之間連通性好（圖2B）。

圖 2 CECM取向支架 SEMFig 2 CECM oriented scaffold SEM

2.2 CECM取向支架的組織學染色觀察

組織學染色可見，支架HE單純紅染，無藍染（圖3A），表明CECM材料中已無完整的細胞及細胞核；甲苯胺藍、番紅O、天狼星紅染色均呈陽性（圖3B、C、D），表明CECM取向支架含有蛋白多糖、膠原成分，與天然軟骨成分相似。

圖 3 CECM取向支架組織學染色觀察 × 50Fig 3 The histological staining observation of CECM oriented scaffold × 50

2.3 CECM取向支架的生化成分定量分析

生化成分定量分析結果顯示，空支架本身含有膠原和糖胺聚糖成分，其含量（樣品濕重）分別為（8.73±0.26）μg·mg-1和（1.66±0.14）μg·mg-1，表明關節軟骨組織中的天然膠原和糖胺聚糖成分被保留下來。

2.4 CECM取向支架的孔隙率、吸水率及力學特性

CECM取向支架的孔隙率為95.455%±0.910%，吸水率為95.889%±1.071%；濕潤狀態下支架縱向壓縮彈性模量為（40.208±5.097） kPa（圖4）。

2.5 CECM取向支架的細胞相容性相關檢測

支架浸提液CCK-8檢測結果（圖5A）顯示：不同時間點支架浸提液對兔ADSCs的增殖與對照組相比無明顯差異（P>0.05），表明支架浸提液無細胞毒性。Live/Dead細胞染色結果（圖5B）顯示：復合體培養7 d后，支架上的細胞均顯綠色熒光（活細胞），無紅色熒光（死細胞）；SEM觀察細胞-支架復合體（圖5C），可見細胞貼附支架孔壁生長并分泌細胞外基質；細胞-支架復合體HE染色（圖5D）可見，復合培養7 d后，細胞在支架孔隙內分布均勻，表明支架孔隙結構適于細胞的黏附、長入。

圖 4 CECM取向支架的應力—應變曲線Fig 4 The stress strain curve of CECM oriented scaffold

圖 5 CECM取向支架的細胞相容性相關檢測Fig 5 The biocompatibility detection of CECM oriented scaffold

3 討論

可用于軟骨組織工程支架構建的材料主要有合成材料、天然生物材料、復合材料等[7]。早期應用于軟骨組織工程的支架材料主要為合成材料，如聚羥基乙酸[8]、聚乳酸[9]、聚乳酸聚羥基乙酸共聚物[10-11]等。由于合成材料生物相容性較差，容易引起機體免疫排斥反應以及體內降解產物偏酸性可能引起炎癥等缺點，臨床應用價值有限。天然生物材料最突出的優點是抗原性低，與正常組織細胞外基質成分相似，能夠參與組織愈合過程，有效地克服了合成材料的不足之處；因而天然生物材料是軟骨組織工程中極具發展前景和臨床應用價值的一類支架材料。

因為豬在解剖學、生理學特性、發病機理、營養代謝等方面與人極其相似而備受組織工程界的青睞，并且豬關節軟骨來源廣泛、成本低廉、生物安全性高[12]，因此，本實驗選用豬關節軟骨作為支架的材料來源。未經處理的豬關節軟骨含有細胞成分，具有抗原性，體內移植可能引起免疫排斥反應，對此，本實驗采用作用柔和的去垢劑Triton X-100[13-14]對其進行脫細胞處理后，去除了大部分抗原性并保留了關節軟骨的天然成分如膠原、蛋白多糖、生長因子等[15-16]，這些天然成分能夠為種子細胞提供高度仿生的生化環境并對干細胞產生定向誘導分化作用[17-18]。既往國內外有對整塊軟骨組織脫細胞后應用于組織工程的相關報道[19-20]，但塊狀的脫細胞軟骨存在脫細胞不徹底、孔隙過小和孔隙連通性差不利于種子細胞長入和遷徙等缺陷，而本實驗中超微勻漿、定向結晶和冷凍干燥再成型技術的結合，有效地彌補了上述缺陷。

超微勻漿技術徹底破壞關節軟骨原有的物理結構，形成軟骨纖維脫細胞更加徹底，經進一步冷凍干燥而成CECM凍干海綿，方便保存和配制。超微勻漿過程為單純物理變化過程，能夠在極大限度上保留關節軟骨的天然成分，這是在Jia等[21]的物理粉碎與化學消化結合法基礎上的優化。對于軟骨細胞外基質凍干海綿的重溶過程，姚軍等[22]采用了稀鹽酸重溶法，而由于本實驗所制備的CECM凍干海綿結構更加微細，超純水即可完全重溶，從而進一步避免了酸對天然軟骨成分的破壞；定向結晶技術即在體系中建立一定的溫度梯度差，使CECM漿料中水分能逆著溫度梯度差的方向結晶生長，從而控制冰晶在體系中的形成方向；冷凍干燥后，冰晶升華，留下的空隙即為支架的孔隙結構。為了控制支架的孔隙率和吸水率，將CECM漿料濃度調節為6%，定向結晶溫度梯度最低值控制在-20 ℃，經過此流程制備而成的取向性CECM支架孔隙率和吸水率均在95%以上，孔隙連通性好，滿足軟骨組織工程對支架結構的要求。

軟骨支架作為種子細胞再生組織的模板，具有搭載種子細胞并引導種子細胞及其分泌的新生細胞外基質的積累排列，最終決定新生組織的形態、結構及功能的作用[23]，因此，在結構上高度仿生也是軟骨組織工程對軟骨支架的另一要求。早期國內外對軟骨組織工程支架的研究多局限于制備成無規則的、隨機排列的孔隙結構，而本實驗方法所制備的軟骨支架具備類似于正常關節軟骨垂直于關節面的柱狀組織排列結構，在結構上達到了高度仿生的要求。此外，由于解剖部位的特殊性，顳下頜關節軟骨組織通常需承受相當的載荷來支持關節的活動，因而軟骨支架的力學特性也應盡量接近于正常關節軟骨組織，具有足夠的載荷能力，而垂直取向的結構同時也大大提高了軟骨支架本身的縱向抗壓縮性能，這對于在新生軟骨組織形成、成熟前支架能夠為種子細胞提供足夠的修復空間以及保護種子細胞有重要意義。

種子細胞是缺損組織修復再生的細胞來源，種子細胞的持續增殖、分化以及其細胞外基質的積累使得缺損組織能夠修復、再生。早期應用于軟骨組織工程研究的種子細胞多為終末分化的組織細胞，然而這類細胞在分離培養、增殖潛能等方面均存在著一定的困難和缺陷，因而對干細胞誘導分化已經成為當今軟骨組織工程研究的熱點和重點。ADSCs是一種以極小的手術創傷即可大量獲得的自體干細胞，且其定向成軟骨誘導潛能已被國內外研究所證實。本研究結果表明CECM取向支架對ADSCs具有良好的相容性，為進一步探討以CECM取向支架搭載自體ADSCs構建組織工程化軟骨的可行性奠定了基礎。

綜上，本實驗成功制備了豬關節軟骨細胞外基質來源的取向性軟骨支架，結構上具有一定仿生性，理化性能優良，生物相容性好，是一種比較理想的軟骨組織工程支架。在后續研究中，我們將進一步結合動物實驗，探索其構建組織工程軟骨及體內再生修復軟骨損傷的生物可行性。

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（本文編輯 李彩）

Development and characterization of oriented scaffolds derived from cartilage extracellular matrix

Li Kun1,2, Zhao Yanhong1, Xu Chen1, Wang Lianyong3, Yang Qiang4, Li Hongfa1, Teng Binhong1. (1. Dept. of Orthodontics, Stomatological Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China; 2. Dept. of Orthodontics, Yantai Stomatological Hospital, Yantai 264000, China; 3. The Key Laboratory of Bioactive Materials, Ministry of Education, College of Life Sciences, Nankai University, Tianjin 300071, China; 4. Dept. of Spine Surgery, Tianjin Hospital, Tianjin 300211, China)
Supported by: The National Natural Science Foundation of China (31300798, 31470937, 81572154); The Key Project of Science and Technology Research of Tianjin Health Bureau (15KG125, 16KG114).

Objective This study aimed to prepare oriented scaffolds derived from a cartilage extracellular matrix (CECM) and to investigate their physicochemical property and compatibility with adipose-derived stem cells (ADSCs). Methods A fresh porcine articular cartilage was cut into pieces. Cartilage nanofi bers with diameters of 50–500 nm were collected through homogenization and centrifugation. These nanofi bers were then decellularized by using Triton X-100 to produce 6% CECM. The oriented scaffolds derived from the nanoscale CECM were fabricated through unidirectional solidifi cation and lyophilization. Afterward, these scaffolds were crosslinked. The physical and chemical performances and cell compatibility of CECM-oriented scaffolds were evaluated. Results The cross-sections of the scaffolds contained homogeneous reticular porous structures with nanofi bers on the walls of the pores, and the longitudinal sections revealed vertical tubular structures. Hematoxylin–eosin staining revealed that the scaffolds were red without blue. Toluidine blue, safranin O, and Sirius red staining showed positive results. The porosity, water absorption rate, and vertical compressive elastic modulus of the scaffolds were 95.455%± 0.910%, 95.889%±1.071%, and (40.208±5.097) kPa, respectively. Conclusion The components of the oriented scaffolds derived from CECM are similar to those of native cartilage with favorable biocompatibility. The porous structures and sizes of the scaffolds are suitable for the adhesion, proliferation, and infiltration of ADSCs. The oriented scaffolds derived from CECM are relatively optimal for cartilagetissue engineering.

cartilage; extracellular matrix; oriented scaffolds; tissue engineering; unidirectional solidifi cation; lyophilization

Q 81

A

10.7518/hxkq.2017.01.007

2016-06-20；

2016-08-10

國家自然科學基金（31300798，31470937，81572154）；天津市衛生局科技攻關重點項目（15KG125，16KG114）

李坤，住院醫師，碩士，E-mail：likun_630216@163.com

趙艷紅，副主任醫師，博士，E-mail：leafzh@126.com

Correspondence: Zhao Yanhong, E-mail:leafzh@126.com.