人釉原蛋白亮氨酸富集片段的冷凍電子顯微鏡觀察及其引導礦化性能研究

田鯤 馮小云 杜芹 廖楚航 任小華

電子科技大學附屬醫院·四川省人民醫院口腔科，成都 610072

人釉原蛋白亮氨酸富集片段的冷凍電子顯微鏡觀察及其引導礦化性能研究

田鯤 馮小云 杜芹 廖楚航 任小華

電子科技大學附屬醫院·四川省人民醫院口腔科，成都 610072

目的 采用冷凍電子顯微鏡觀察體外重組的人釉原蛋白富亮氨酸片段（LRAP），分析其細微結構和聚集狀態，結合礦化實驗評估LRAP體外引導羥磷灰石生長的定向成核能力。方法 人工合成LRAP基因，與原核表達載體pCold-SUMO行質粒構建，于宿主菌大腸桿菌BL21plys中誘導表達并純化，在冷凍電子顯微鏡下觀察LRAP在pH值從3.5到8.0的環境中聚合自組裝的過程，并在人工唾液中通過透射電鏡觀察羥磷灰石晶體的生長規律。結果 通過原核表達成功得到純度90%以上的LRAP蛋白提取物，當pH值為8.0時，LRAP能聚集成多聚體和納米小球等功能結構，在人工唾液中能誘導羥磷灰石晶體生長成熟。結論 作為簡化的釉原蛋白功能域，LRAP兼備了自組裝為納米小球和c軸誘導晶體礦化的特性，可作為運用釉基質蛋白多聚物行無細胞修復牙體硬組織缺損的備選材料之一。

冷凍電子顯微鏡； 釉原蛋白； 釉原蛋白亮氨酸富集片段； 羥磷灰石

近年來， 依據仿生礦化原理，體外搭建高度仿真的有機礦化模板，營造合適的鈣、磷微環境逐步成為釉質晶體再生的可行方法。仿真礦化模板也經歷了從最初簡單的高分子到復雜多肽，再到直接提取體內釉質礦化模板的發展歷程[1-3]。組成釉質的無機晶體組分是完全相同的，但它能達到普通磷酸鈣硬度的5倍，唯一的差別就是晶體生長和組裝的取向。釉柱和柱間質形成網球拍樣結構，二者的差異是由礦化模板中納米纖維長軸轉角來架構的：其過程是成釉細胞的分泌單位Tomes突從兩個位點分泌互成60°夾角的蛋白，在空間的排列走勢分為輻射向和切線向，循著正弦曲線移動而形成網球拍樣的人牙釉柱結構[4-5]。已有研究[4]佐證，礦化模板對釉基質的模仿程度越高，生成的羥磷灰石晶體就越接近牙齒釉柱的排列；相關基因敲除的小鼠，在釉質結構編排或羥磷灰石結晶相上均存在發育缺陷。近年來對釉基質蛋白特別是釉原蛋白的深入破解和探索成為研究釉質仿生合成的主流，故本實驗擬對發育中的原位引導蛋白加以利用，體外再現牙體組織缺損處有機模板編織框架的過程，無縫延長這種編織模式，實現晶核的生長和發育。

造就釉質獨特結構的主體是釉質發育期由成釉細胞分泌的釉基質蛋白， 釉原蛋白占全部釉基質蛋白的90%，是最主要的釉質形成蛋白。人釉原蛋白由175個氨基酸組成，其序列主要由疏水殘基和親水C-末端構成[4]，分為3個區域：富含酪氨酸的N-末端序列，X-Y-脯氨酸重復序列構成的中央主段，以及11個亮氨酸殘基架構的親水性C-末端。釉原蛋白亮氨酸富集片段 （leucine-rich amelogenin peptide，LRAP）是經mRNA選擇性剪切所形成的釉原蛋白的一個剪接變異體，富集了釉原蛋白的主要功能域。該片段由釉原蛋白的26個C-末端氨基酸和33個N-末端氨基酸構成，在1981年首次被發現[6]。在哺乳動物中，N-末端和C-末端的氨基酸序列是高度保守的[7]，因此本實驗擬對LRAP進行重組和純化，并于冷凍電子顯微鏡（cryogenic transmission electron microscopy，cryoTEM）下觀察其團聚、組裝成納米小球的生理過程，進一步檢測其在礦化溶液中對鈣磷離子的引導能力，為運用釉原蛋白體外實現釉質的生長提供基礎數據。

獲取正確的LRAP片段后，將首尾兩段LRAP片段連接，設計引物（正向：5’-CGTAGGATCCGATGGGGACCTGGATTTTGTT-3’；反向：5’-GCAGCTCGAGTTAATCCACTTCCTCCTGCT-3’），參照Khan等[10]所述方法進行擴增、回收、克隆及篩選和鑒定。將LRAP片段與pCold-SUMO原核表達載體構建重組質粒，通過熱激法將其轉化入原核表達菌株的宿主菌大腸桿菌（Escherichia coli，E. coli）BL21plys，鑒定、培養，要求OD600達到0.6，以0.3 mmol·L-1異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）誘導，電泳檢測。以高效液相色譜儀（AKTA Purifi er 900型，瑞典通用醫療公司）進行分離，收集含有小泛素相關修飾物（small ubiquitinrelated modifi er，SUMO）的重組蛋白，經rTEV蛋白酶切割融合蛋白得到LRAP蛋白，通過透析將蛋白溶液的pH值調整為7.0，凍干保存。

以pH值為3.5的雙蒸水溶解LRAP蛋白，緩慢加入4 mmol·L-1pH=8.0的PBS，冰浴中調整蛋白的最終質量濃度為100 μg·mL-1。此時蛋白液的pH值由3.5躍升為8.0，單體蛋白開始自組裝，分別在1、10、20 min時終止自組裝反應。將20～50 μL的蛋白溶液滴至銅網多孔碳側，凍干后將銅網置于cryoTEM（Tecnai F20 TEM型，FEI公司，美國）下觀察。

部分質量濃度為10 g·L-1蛋白液置入 37 ℃人工唾液[11]（MgCl20.2 mmol·L-1，CaCl2·H2O 1 mmol·L-1，HEPES buffer 20 mmol·L-1，KH2PO44 mmol·L-1，KCl 16 mmol·L-1，NH4Cl 4.5 mmol·L-1，NaF 7 mmol·L-1，用1 mmol·L-1NaOH 調整pH值為7.0）反應1～3 d，要求溶液中LRAP終質量濃度為10 g·L-1。3 d后將反應液滴于200目的碳膜銅網上，乙酯雙氧鈾染色，采用透射電子顯微鏡（Tecnai T12型，FEI公司，美國）觀察，通過選區衍射確定晶體性質。

2 結果

1 材料和方法

根據GenBank公布的人釉原蛋白全長序列（Genebank M86932），參考文獻[8-9]及蛋白質序列分析網絡服務器對LRAP功能片段進行定義，確定剪切片段如下：ATGCCTCTACCACCTCATCCTGGGCACCCTGGTTATATCAACTTCAGCTATGAGGTGCTTACCCCTTTGAAGTGGTACCAGAGCATAAGGCCACCG—CCCCTGCCGCCACAGCCACCTCTGCCTCCGATGTTCCCCATGCAGCCCCTGCCTCCCATGCTTCCTGATCTGACTCTGGAAGCTTGGCCATCAACAGACAAGACCAAGCGGGAGGAAGTGGAT。

擴增的LRAP經1%瓊脂糖凝膠電泳后，可見大小為220 bp左右的特異性條帶，與預期一致，結果見圖1，其中第二泳道為釉原蛋白N端酪氨酸富集片段（tyrosine-rich amelogenin peptide，TRAP）。DNA測序結果及配對結果顯示，本研究擴增的LRAP與NCBI基因庫中人LRAP序列的契合度達99%。轉染原核表達載體后經培養、鑒定，純化提取得到蛋白液體，明膠電泳結果顯示其相對分子質量約6.03×103（圖2），與計算所得LRAP的相對分子質量基本吻合。總體鑒定結果提示，重組純化實驗所得到的產物即為人LRAP。

圖 1 擴增的LRAP DNA凝膠電泳圖Fig 1 DNA gel electrophoresis of LRAP

圖 2 LRAP蛋白電泳圖Fig 2 Protein electrophoresis of LRAP

cryoTEM下全視野圖見圖3。分析3個時間點（1、10、20 min）的全景圖可以發現溶液中LRAP由散在單體團聚為納米小球，再組裝為串珠網的整體構建趨勢。LRAP蛋白溶液的pH值由3.5迅速變為8.0，反應1 min時可見5～8 nm的LRAP單體以每6～8個為集落組裝為10～30 nm的多聚體（圖3左）；反應10 min后，多聚體增多，集合為50～100 nm的納米小球（圖3中）；反應20 min，納米小球首尾相接自組裝為鏈狀長條，各長條結構相互平行或垂直堆積，構成羥磷灰石晶體平行排列的分子基礎（圖3右）。

當LRAP的pH值由3.5劇烈躍升至8.0時，LRAP的單體即開始聚合，圖4是圖3全景圖中細節的等比例截取圖：1 min時數量最多的是6～8個單體形成的環狀多聚體（圖4A），也有少量在此結構上的進一步構架，包括2個多聚體相鄰結合（圖4B）、3～4個多聚體以一定角度串起（圖4C），或是5～8個多聚體在空間上三維重疊（圖4D），形式多樣。反應至10 min時，大體積結構增多（圖3中），多聚體在某一個方向上開始延伸，形成4～8單位不等的直線串珠狀多聚體（圖4E），或是巨大的納米小球（圖4F），直徑50～100 nm不等；納米小球并不是孤立存在的，團聚仍在三維方向上繼續，形成如圖4G所示的延伸結構。反應20 min后（圖3右），LRAP在溶液中的結構趨于穩定，納米球和串珠狀多聚體形成的三維網架成為鏡下主體（圖4H）。

圖 3 LRAP在1、10、20 min的自組裝過程 cryoTEM × 50 000Fig 3 Micrographs of assembly of LRAP at 1, 10, and 20 min in the reaction cryoTEM × 50 000

將10 g·L-1的LRAP（pH值為3.5）置入37 ℃人工唾液（pH值為7.0）孵育后，可見蛋白溶液逐步自組裝為多聚體及納米小球，與圖3所示聚合步驟一致。反應0.5 h后，透射電子顯微鏡下觀察溶液可見LRAP團聚成20～50 nm的納米小球（圖5A中黑色框），背景可見10～30 nm的多聚體和大量5～8個LRAP單體首尾相接形成的環狀初級結構，選區電子衍射未能檢出晶體環。2 h后，納米小球變大變厚，提示晶核開始各向生長，但未見明顯的晶胞，仍無衍射環（圖5B）。孵育24 h時，晶胞密度加大，但形態仍以納米小球及其衍生物為主，此時可以檢出稚嫩晶體環，選區電子衍射（圖5C右下角）提示晶體主要為磷酸三鈣[Ca3(PO4)2]。4 d后，可見大體積結晶，晶胞已趨成熟，融合為長度為2～4 μm的晶體，選區電子衍射（圖5D右下角）可見晶體的成分包含磷酸八鈣[Ca8H2(PO4)6·5H2O]和羥磷灰石[Ca10(PO4)6(OH)2]。

圖 4 各種形態的多聚體和納米小球 透射電子顯微鏡 × 50 000Fig 4 Various oligomers and nanospheres transmission electron microscopy × 50 000

圖 5 LRAP蛋白液與人工唾液孵育后的礦化產物 透射電子顯微鏡Fig 5 Mineralization products form reaction of LRAP and mimic saliva transmission electron microscopy

3 討論

釉原蛋白歸屬于固有非結構化蛋白質，沒有明確的二級或三級蛋白質三維結構卻具有特定的生物學功能，能遵循其與靶標之間的作用而轉化為折疊狀態，在釉質晶體生長發育的動態運動中扮演多種職能[7]。釉原蛋白整個主鏈結構中親水性的C端主要吸附無機晶體，同時抑制其沿a、b軸方向的生長，防止晶體間發生融合[5]；中段X-Y-脯氨酸重復序列的作用目前尚未見明確報道；疏水的N端主要影響釉原蛋白的自組裝和蛋白間的相互作用，TRAP中的三酪氨酸基序（PYPSYGYEPMGGW）能夠糖基化，并與其他細胞外基質蛋白（如成釉蛋白或釉蛋白）結合[12]。已有研究[13]證實該片段能實現全蛋白初期階段的串珠狀聚集而誘導出不規則棒狀晶體。

研究[4,14]表明，在中性pH和37 ℃環境中，釉原蛋白N端疏水的氨基酸富集區域相互聚攏，C端親水的帶電荷氨基酸尾巴TLAGGVA指向外部，形成直徑約20 nm的球狀自組裝體（如圖4），表面暴露多個可以與多種非釉原蛋白相結合的氨基酸序列（如氨基三甲叉磷酸：PYPSYGYEPMGGW），可以進一步自組裝形成超分子集團[15]。本實驗圖3、4中的基本亞單位可聚合為20～40 nm的多聚體，進而組裝為50～100 nm的納米小球甚至超分子集團，但聚合單位尺寸較大，或許是LRAP較之全長蛋白缺少了中央X-Y-脯氨酸重復序列，在分子結構組裝時對框架大小的掌控能力有所欠缺所致。Snead[5]提出，新分泌的釉原蛋白單體自組裝的納米球沉積于帶狀晶體之間或周圍，封閉a、b軸方向的生長，只允許c軸的晶核延長發育，最終形成遠大于骨組織羥磷灰石厚度（3～6 nm）的釉質羥磷灰石（20～30 nm）。本研究使用的LRAP因為中央重復序列的缺失，形成的礦化框架形態與全長蛋白有差異，當將LRAP單獨提取出來并與礦化液共同孵育時，由于溶液中無附著相，因此沒有形成針狀晶體棒，而是從散在的納米球狀晶體顆粒直接融合為脈絡花樣結構，結晶型也相對稚嫩，從最初的磷酸三鈣到礦化結束時以磷酸八鈣為主，羥磷灰石含量相對較低。

體內礦化模板不只由釉原蛋白單一組裝，還包含成釉蛋白、釉蛋白、釉成熟蛋白、激肽釋放酶-4等在內的釉基質蛋白家族。本實驗溶液中僅存在LRAP單一成分，雖然其全長釉原蛋白占釉基質蛋白的95%，但釉蛋白、釉質溶解素等物質的缺失還是導致了所形成的納米小球在結構和功能上與體內礦化過程有所不同。

Fang等[14]證實，釉原蛋白分層逐步進行的自組裝和形成的低聚物受多肽和親水C端之間的相互作用所引導。自組裝在成核前穩定集聚礦物質，使其排列成線性長鏈，然后組成平行陣列，未成核的礦物質長鏈形成針狀的礦物質顆粒，最后構成成束的晶體。所有這些推論都是建立在單中心晶體生長的模式下，因為體內釉質在礦化時，模板沒有預先成型，而是不斷由成釉細胞分泌并適時實現自組裝，自組裝是依附于已有的蛋白框架進行的。換言之，最早的模板生發中心只有一個，在此中心的長軸模板不斷編織伸長，礦物離子跟進礦化，模板再向空間生長，晶體繼續沿c軸發育，如此循環往復數年之久，方可形成2～3 mm厚的羥磷灰石層。本實驗的礦化觀測于溶液中進行，意味著蛋白模板的編織是多中心的，只要蛋白濃度適宜（＞10 g·L-1），納米小球就在不斷形成，網絡樣的超分子結構也在不同中心發育，沒能統一形成單方向延長的長鏈結構，這或許是本研究未能得到針狀羥磷灰石而只有花朵樣散發晶體生成的原因。總而言之，LRAP的引導成核過程與釉原蛋白全長蛋白的成核雖有所差異，但它獲取簡單，提純方便，若能與釉基質蛋白中其他調控晶體平行生長的蛋白配伍使用，可以使體外非細胞再造牙樣羥磷灰石的設想離臨床使用更近一步。

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（本文編輯 吳愛華）

Study of human leucine-rich amelogenin peptide and its regulation of mineralization by cryogenic transmission electron microscopy

Tian Kun, Feng Xiaoyun, Du Qin, Liao Chuhang, Ren Xiaohua. (Dept. of Stomatology, Hospital of University of Electronic Science and Technology of China (UESTC) & Sichuan Provincial People’s Hosptial, Chengdu 610072, China)
Supported by: The National Natural Science Foundation of China (81100786).

Objective Recombinant human leucine-rich amelogenin peptide (LRAP) was studied by cryogenic transmission electron microscopy (TEM); evaluation focused on its self-assembly and crystal growth in vitro. Methods Human LRAP was recombined through prokaryotic expression vector pCold-SUMO and transformed into Escherichia coli BL21plys to acquire purifi ed proteins. Cryogen TEM recorded assembly and self-assembling of LRAP from pH 3.5 to pH 8.0, and the hydroxyapatite crystal growth in the mixture of LRAP protein solution and artifi cial saliva was observed using TEM and selected area electron diffraction. Results More than 90% purity LRAP was expressed, purifi ed and identifi ed as described in methods. LRAP linked into oligomers, nanospheres, nanochains, and microribbons, whereas pH value increased from 3.5 to 8.0. Mature hydroxyapatite crystal growth was guided in artifi cial saliva fi lled with calcium phosphate. Conclusion LRAP is simplifi ed amelogenin functional domain and conserved the basic characters of amelogenin such as self-assembling and inducing crystallization along c axis. In the area of acellular synthesis of hydroxyapatite using extracellular enamel matrix protein, LRAP is one of candidate repair materials for irregular hard tissue defection.

cryogenic transmission electron microscopy; amelogenin; leucine-rich amelogenin peptide; hydroxyapatite

R 783

A

10.7518/hxkq.2017.01.009

2016-07-30；

2016-10-20

國家自然科學基金（81100786）

田鯤，副主任醫師，博士，E-mail：tiankun@med.uestc. edu.cn

任小華，副主任醫師，碩士，E-mail：renxiaohua@med. uestc.edu.cn

Correspondence: Ren Xiaohua, E-mail: ren-xiaohua@med.uestc.edu.cn.