微振動對成骨細胞成骨效應(yīng)的瞬時影響

朱卓立 張玲 馬瑞陽 甘雪琦

口腔疾病研究國家重點實驗室 華西口腔醫(yī)院修復(fù)科（四川大學(xué)），成都 610041

微振動對成骨細胞成骨效應(yīng)的瞬時影響

朱卓立 張玲 馬瑞陽 甘雪琦

口腔疾病研究國家重點實驗室 華西口腔醫(yī)院修復(fù)科（四川大學(xué)），成都 610041

目的 在不考慮間歇期的介入所帶來的延時效應(yīng)下，研究高頻率低振幅微振動（LMHFV）刺激對成骨細胞成骨效應(yīng)的瞬時影響。方法 培養(yǎng)小鼠成骨前體細胞系（MC3T3-E1），實驗組在施加高頻率（40 Hz）、低振幅（0.49 g）微振動30 min后，立即通過實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測早期成骨分化標(biāo)志物Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runx2）、Ⅰ型膠原蛋白（Col-Ⅰ）、堿性磷酸酶（ALP）的表達，并檢測活性氧（ROS）濃度變化及線粒體形態(tài)變化，后加入抗氧化劑后繼續(xù)觀察上述指標(biāo)的變化。結(jié)果 LMHFV刺激后Runx2、Col-Ⅰ、ALP的mRNA表達明顯下調(diào)（P＜0.01），線粒體ROS濃度升高（P＜0.01），線粒體長度縮短（P＜0.01）；抗氧化劑的使用則使上述變化得到顯著緩解（P＜0.01）。結(jié)論 排除間歇期的干擾后，LMHFV（40 Hz，0.49 g）可降低成骨細胞內(nèi)早期成骨分化標(biāo)志物的表達，促進線粒體ROS的產(chǎn)生與積累并導(dǎo)致線粒體的過度分裂。

微振動； 成骨分化； 活性氧； 線粒體形態(tài)

骨組織是人體內(nèi)一種典型的力學(xué)敏感器官，可以通過骨改建來適應(yīng)多種不同的力學(xué)刺激信號，如拉力、壓力、流體靜壓力、剪切力、微振動等[1-3]。其中，既往研究[4-6]表明高頻率低振幅微振動（lowmagnitude high-frequency vibration，LMHFV）可促進成骨分化，抑制破骨分化，使骨改建更傾向于骨生成方向。但在這些相關(guān)研究的實驗設(shè)計中，每一個微動刺激周期被固定的間隙期所阻隔，這使最終檢測的成骨效應(yīng)并非單純來自于微動刺激本身，還摻入了間隙期的影響。有學(xué)者[7-9]已證實，間歇期插入所致的延時效應(yīng)可增強成骨細胞對固有微振動刺激的敏感性，促進成骨。然而，在研究微振動對成骨細胞的成骨變化的瞬時影響方面卻鮮有報道。此外，近年來線粒體活性氧（reactive oxygen species，ROS）作為一種胞內(nèi)信號傳遞分子已成為細胞分化方面的研究熱點，有學(xué)者[10-13]認(rèn)為ROS可作為成骨分化的一個新興指標(biāo)。因此，本實驗擬在排除間隙期的干擾下，研究LMHFV刺激對小鼠成骨前體細胞（MC3T3-E1）所造成的瞬時成骨效應(yīng)，并觀察線粒體內(nèi)ROS是否與此瞬時效應(yīng)相關(guān)。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

小鼠MC3T3-E1細胞系由四川大學(xué)口腔疾病研究國家重點實驗室提供。改良α-MEM 培養(yǎng)基（Hyclone公司，美國），胎牛血清（fetal calf serum，F(xiàn)BS）、胰蛋白酶、雙抗（Millipore公司，美國），Mitotracker? Red CMXRos染料、Mitosox? Red染料、Mitotracker? Green染料、Trizol（Invitrogen公司，美國）。GJX-5型振動傳感器校準(zhǔn)儀（北京森德格科技有限公司），ABI 7300熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀（ABI公司，美國）。

1.2 細胞培養(yǎng)與傳代

將MC3T3-E1細胞接種于含10%FBS的改良α-MEM培養(yǎng)基中，并置于37 ℃、5%CO2的飽和濕度孵箱中培養(yǎng)。當(dāng)貼壁細胞達90%時，以0.25%胰蛋白酶進行消化傳代培養(yǎng)。復(fù)蘇后細胞傳代培養(yǎng)至2～3代用于實驗。

1.3 微振動刺激

將MC3T3-E1細胞接種于6孔板（接種濃度為6× 104個·mL-1，用于檢測mRNA變化）或24孔板（接種濃度為2×104個·mL-1，用于檢測ROS和線粒體形態(tài)變化）中培養(yǎng)至貼壁細胞達90%時，進行微振動刺激，振動參數(shù)設(shè)為40 Hz、0.49 g、30 min。所有檢測在振動結(jié)束后立即進行。

1.4 抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl cysteine，NAC）的處理

MC3T3-E1細胞在含1.0 mmol·L-1NAC的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，施加微振動刺激，并進行相關(guān)檢測。

1.5 檢測方法

1.5.1 實時熒光定量PCR 在微振動刺激結(jié)束后，立即采用Trizol收集6孔板內(nèi)的細胞，加入氯仿（每管200 mL），劇烈振蕩15 s至乳膠狀，冰上靜置至其自然分層。4 ℃，12 850 r·min-1離心15 min，后取上清約每管500 μL并加入等體積的異丙醇，混合均勻后，冰上靜置10 min。4 ℃，12 850 r·min-1離心15 min。緩慢棄掉上清，加入預(yù)冷的75%乙醇，振蕩離心管使沉淀懸浮。4 ℃，11 130 r·min-1離心5 min。緩慢棄掉上清，室溫干燥RNA沉淀約5 min，加入焦碳酸二乙酯（diethy pyrocarbonate，DEPC）水30 μL（每管）溶解RNA。采用分光光度法檢測RNA的濃度和純度。然后依次使用PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser（大連TAKARA公司）和SYBR?Premix Ex Taq? Ⅱ（TliRNaseH Plus）（大連TAKARA公司）進行逆轉(zhuǎn)錄和擴增。最后于ABI 7300熒光定量PCR儀中進行反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95 ℃ 3 min；95 ℃5 s，63 ℃ 31 s，40個循環(huán)。各檢測基因?qū)嶒炓锶缦隆unt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）正向引物序列：CCCAGCCACCTTTACCTACA，反向引物序列：TATGGAGTGCTGCTGGTCTG；Ⅰ型膠原蛋白（collagen typeⅠ，Col-Ⅰ）正向引物序列：CCCAAGGAAAAGAAGCACGTC，反向引物序列：AGGTCAGCTGGATAGCGACATC；堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）正向引物序列：CCAACTCTTTTGTGCCAGAGA，反向引物序列：GGCTACATTGGTGTTGAGCTTTT；磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）正向引物序列：ACTTTGTCAAGCTCATTTCC，反向引物序列：TGCAGCGAACTTTATTGATG。

1.5.2 ALP活性檢測 振動加載結(jié)束后，立即棄掉舊培養(yǎng)基，1%PBS輕輕漂洗2次后，用細胞刮刮下孔底細胞，經(jīng)超聲裂解后，4 ℃，10 000 r·min-1離心5 min，取上清液進行檢測，上述操作均在冰上進行。后根據(jù)ALP活性檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）的說明書進行ALP活性檢測，并利用BCA蛋白試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）測定細胞內(nèi)總蛋白濃度。

1.5.3 線粒體內(nèi)ROS濃度檢測 采用微振動處理后，立即棄掉細胞培養(yǎng)基，并在孔板內(nèi)加入Mitosox?Red染料（2.5 μmol·L-1）和Mitotracker? Green染料（100 nmol·L-1），37 ℃孵育30 min后，用緩沖液溫和沖洗2次，并在熒光顯微鏡下觀察，利用NIH Image J軟件進行圖片分析。

1.5.4 線粒體形態(tài)檢測 在24孔板中放置圓形的載玻片，并在其上培養(yǎng)細胞。微振動處理后，立即棄掉細胞培養(yǎng)基，并在孔板內(nèi)加入Mitotracker? Red CMXRos染料（200 nmol·L-1），37 ℃孵育30 min后，用緩沖液溫和沖洗2次。加入4%多聚甲醛后，于37 ℃固定30 min，后棄掉固定液，用緩沖液溫和沖洗2次。將載玻片取出，放在長方形載玻片之上，蓋上蓋玻片，并用含抗熒光淬滅的封片劑（KPL公司，美國）進行封片。最后置于熒光顯微鏡下觀察線粒體形態(tài)，并利用NIH Image J軟件進行圖片分析。

1.5.5 動力相關(guān)蛋白（dynamin-like protein 1，Drp1）檢測 振動加載結(jié)束后，立即進行細胞裂解，過程為：4 ℃、1 2 000 r·min-1離心15 min，取上清液，后用裂解液裂解細胞，并收集裂解液至離心管中，在振蕩器上混勻4～15 min，4 ℃、14 000 r·min-1離心15 min，取上清液備用。然后，取15 μL上清液至10 cm×10 cm膠上電泳，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，1∶1 000加入血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）抗體，再加入羊抗兔二抗，37 ℃孵育45 min，緩沖液洗滌30 min，每10 min換液1次。在暗室中壓片，顯影、定影后進行圖像分析。

1.6 統(tǒng)計分析

所有檢測均重復(fù)至少3次。數(shù)據(jù)形式表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。利用統(tǒng)計分析軟件GraphPad Prism 6.0（Graph-pad Software公司，美國）對所得數(shù)據(jù)進行兩獨立樣本t檢驗或方差分析。P＜0.01被視為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 微振動對早期成骨分化標(biāo)志物基因表達的影響

Runx2、Col-Ⅰ、ALP三者作為早期成骨分化的標(biāo)志物，在受到LMHFV瞬時刺激后，其mRNA表達水平及ALP活性顯著降低（P＜0.01）（圖1）。

圖 1 LMHFV和NAC對早期成骨標(biāo)志物表達的影響Fig 1 Infl uence of LMHFV and NAC on early osteogenic markers levels

2.2 微振動對線粒體形態(tài)及ROS產(chǎn)生的影響

LMHFV刺激下ROS水平的變化及線粒體平均長度的變化見圖2。施加0.49 g、40 Hz的微振動刺激30 min后，線粒體內(nèi)ROS的含量明顯高于對照組（P＜0.01），且與靜態(tài)培養(yǎng)的成骨細胞內(nèi)的線粒體相比，振動組內(nèi)的線粒體平均長度縮短（P＜0.01），表現(xiàn)為線粒體碎片化增加。

圖 2 LMHFV和NAC對ROS水平及線粒體平均長度變化的影響Fig 2 Infl uence of LMHFV and NAC on ROS level and average mitochondrial length

2.3 NAC對線粒體形態(tài)及ROS產(chǎn)生的影響

抗氧化劑NAC的使用，顯著降低了振動組線粒體內(nèi)ROS的含量（P＜0.01），與對照組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖2）。NAC的加入明顯逆轉(zhuǎn)了由微振動所造成的Drp1表達升高（P＜0.01）以及線粒體過度分裂（P＜0.01），使線粒體的平均長度與對照組無顯著性區(qū)別（圖2～4）。

圖 3 Drp1蛋白表達水平Fig 3 Expression of Drp1

圖 4 NAC對線粒體形態(tài)的影響Fig 4 Infl uence of NAC on mitochondrial morphology

2.4 NAC對微振動瞬時成骨效應(yīng)的影響

NAC對微振動瞬時成骨效應(yīng)的影響見圖1。抗氧化劑NAC的使用，顯著緩解了微振動所導(dǎo)致的瞬時成骨效應(yīng)，表現(xiàn)為NAC預(yù)處理后微振動組內(nèi)的Runx2、Col-Ⅰ、ALP mRNA水平及ALP活性程度較微振動組均發(fā)生不同程度的上調(diào)（P＜0.01），并且與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

近年來，高頻率（f=20～90 Hz）、低振幅（a＜1 g，1 g=9.81 m·s-2）微振動常作為一種促進骨改建的力學(xué)刺激而被廣泛研究[3-6,14-15]。雖然既往研究[16-18]已證實在微振動刺激中插入間歇期可促進成骨分化，有利于骨生成和骨質(zhì)愈合，但是關(guān)于微振動的瞬時成骨效應(yīng)卻鮮有報道。此外，有學(xué)者[10,19-20]稱線粒體ROS在成骨細胞分化過程中可發(fā)揮一定作用，但在微振動誘導(dǎo)下成骨細胞分化過程ROS的表達水平及線粒體形態(tài)的變化卻未被研究過。因此，LMHFV對成骨細胞瞬時成骨變化的影響及線粒體ROS在此過程中的變化，成為了本研究的亮點和突破點。

在本研究中，微振動組的Runx2、Col-Ⅰ、ALP這三個早期成骨分化標(biāo)志物的基因表達水平及ALP活性程度均顯著低于對照組，表明單純的、瞬時的微振動刺激可以抑制成骨分化。結(jié)合前人對間隙期的研究結(jié)果，筆者猜測間歇期所致的延時效應(yīng)可以緩解甚至逆轉(zhuǎn)由單純微動刺激所導(dǎo)致的瞬時成骨效應(yīng)，使長期微動刺激的綜合成骨效應(yīng)表現(xiàn)為促進成骨分化，抑制破骨分化，促進骨生成，這一猜想與其他研究[6,8-9]結(jié)果一致。

在正常情況下，線粒體的形態(tài)常在融合與分裂之間維持著平衡，并且這種平衡與線粒體內(nèi)ROS的含量相關(guān)[21-23]。當(dāng)線粒體內(nèi)ROS水平過低時，線粒體融合大于分裂，其平均長度增加；反之，當(dāng)線粒體內(nèi)ROS水平過高時，線粒體分裂大于融合，其平均長度縮短。本實驗對線粒體ROS的含量及線粒體形態(tài)的檢測結(jié)果表明，微振動在下調(diào)成骨分化標(biāo)志物基因表達水平的同時，明顯提高了線粒體內(nèi)ROS的水平，氧化應(yīng)激增強，進而促進了線粒體結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化趨向于線粒體分裂，表現(xiàn)為線粒體平均長度縮短。當(dāng)使用抗氧化劑NAC后，線粒體ROS的含量顯著下調(diào)，線粒體的動態(tài)結(jié)構(gòu)變化也趨于平衡。由于Drp1在調(diào)控線粒體分裂的過程中起著非常關(guān)鍵的作用[19-20]，因此在本實驗中隨著NAC的加入，由微振動造成的Drp1過度表達現(xiàn)象也得到顯著改善。與此同時，NAC減弱了ROS來源的氧化應(yīng)激對成骨細胞的損傷程度，使Runx2、Col-Ⅰ、ALP mRNA水平及ALP活性程度上調(diào)，并與對照組無顯著性差異。

Arakaki等[10]的研究結(jié)果表明，成骨誘導(dǎo)液的使用可促進基質(zhì)礦化、ALP mRNA的表達，同時還伴隨ROS水平的上調(diào)及線粒體結(jié)構(gòu)的異常變化；當(dāng)抑制ROS的產(chǎn)生后，成骨細胞分化同樣也受到抑制。這一研究結(jié)果與本實驗結(jié)果之所以不同，其原因可能是由于不同的刺激因素造成的ROS水平的升高程度不同所致。

綜上所述，本研究闡述了微振動對小鼠成骨細胞成骨變化的瞬時影響，并探討了線粒體ROS以及線粒體分裂活動在此過程中的變化，對微振動這一傳統(tǒng)的力學(xué)刺激有了更加全面和深入的認(rèn)識。此外，線粒體ROS是如何調(diào)控微振動刺激下的成骨分化過程，則有待進一步的研究。

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（本文編輯 杜冰）

Infl uences of vibration on rapid osteogenic response of osteoblasts

Zhu Zhuoli, Zhang Ling, Ma Ruiyang, Gan Xueqi. (State Key Laboratory of Oral Diseases, Dept. of Prosthodontics, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, China)
Supported by: Specialized Research Fund for The Doctoral Program of Higher Education (20120181120007).

Objective This study investigated the rapid response of osteoblasts, which were derived from low-magnitude high-frequency vibration (LMHFV). Refractory period-derived memory response was also observed. Methods MC3T3-E1 cells were incubated and received LMHFV stimulation (0.49 g, 40 Hz) for 30 min. After application of LMHFV, mRNA levels of earlier osteogenic differentiation markers Runt-related transcription factor 2 (Runx2), collagen typeⅠ(Col-Ⅰ), and alkaline phosphatase (ALP) were immediately detected by real-time fl uorescence quantitative polymerase chain reaction in the absence or presence of antioxidant. Simultaneously, concentrations of mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and average mitochondrial length were also measured. Results Osteoblasts in the vibration group showed decreased gene expressions of Runx2, Col-Ⅰ, and ALP (P＜0.01) and increased levels of mitochondrial ROS (P＜0.01) and shortened mitochondria (P＜0.01), whereas antioxidant treatment resulted in recovery from changes in the above indicators (P＜0.01). Conclusion LMHFV can downregulate mRNA levels of early osteogenic differentiation markers, promote ROS generation, and mitochondrial fi ssion.

vibration; osteogenic differentiation; reactive oxygen species; mitochondrial morphology

Q 68

A

10.7518/hxkq.2017.01.010

2016-04-17；

2016-11-10

高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金（20120181120007）

朱卓立，講師，博士，E-mail：494218289@qq.com

甘雪琦，副教授，博士，E-mail：522707976@qq.com

Correspondence: Gan Xueqi, E-mail: 522707976@qq.com.