昭通葡萄中黃酮提取工藝及含量測定

李啟彭，李成楊，祁 岑，沈燕瓊

（1.昭通學院化學與生命科學學院，云南昭通 657000；2.昭通市農產品質量安全中心，云南昭通 657000）

昭通葡萄中黃酮提取工藝及含量測定

李啟彭1，李成楊1，祁 岑1，沈燕瓊2*

（1.昭通學院化學與生命科學學院，云南昭通 657000；2.昭通市農產品質量安全中心，云南昭通 657000）

分別設計單因素實驗和正交實驗，優化昭通葡萄中黃酮的提取工藝，并采用紫外分光光度法測定其含量。研究結果表明，最佳提取工藝為乙醇體積分數為60%，料液比為1：10，提取90 min，提取溫度80℃。以蘆丁為標準溶液，在510 nm處測定昭通葡萄的黃酮含量，該方法的回收率為98.6%～110.4%，相對標準偏差小于1%，可作為葡萄中黃酮的提取工藝及含量測定的新方法。

昭通葡萄；黃酮；提取工藝；含量測定

葡萄（Vitisυinifera L）又稱提子，是落葉木質藤本植物，果實不僅美味可口，而且富含維生素、黃酮和各種氨基酸等營養成分，具有很高的營養價值［1-2］。其中，黃酮類化合物對“三高”有一定療效，也具有擴張冠狀動脈和腦血管等功效［3-6］。黃酮的提取方法主要有回流法，超聲波提取法和超臨界萃取法，測定方法主要有紫外分光光度法、高效液相色譜法和比色法等［7-10］。目前，關于葡萄中黃酮的提取工藝及測定方法的報道還比較少，需要建立簡單、易重復和精度高的提取新工藝和測試方法［11-13］。

云南省昭通的地理和氣候等因素，有利于葡萄的生長，果實品質優越，深受人們喜愛。由于黃酮具有良好的藥用價值，探索昭通葡萄中黃酮的高效提取工藝和快速準確的測定方法，為昭通葡萄的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試葡萄有紅玫瑰葡萄和巨峰葡萄，均為昭通特產，購買自昭通市農貿市場。新鮮葡萄用清水洗凈，然后剝皮，將果皮和果肉分別烘干，粉碎，過40目篩（孔徑0.42 mm）備用。

1.2 標準溶液的配制及測定

稱取蘆丁標準品25 mg置于燒杯中，用70%的乙醇溶解，然后轉移到100 m L容量瓶中，定容到刻度，即得到0.25 mg·mL-1標準液［14］。量取0.25 mg·m L-1標準溶液2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和10.0 mL分別置于25 mL容量瓶中，分別加入5%NaNO2溶液1 m L搖勻，靜置5 m in，加入1%Al（NO3）3溶液1 m L搖勻，靜置5 min，加入4%NaOH溶液10 mL，用70%乙醇定容，放置10 min［14］。用紫外分光光度計在460～550 nm間測定溶液的吸光度，得到蘆丁的最大吸收波長曲線和標準溶液的工作曲線。

1.3 單因素實驗

1.3.1 提取溶劑

分別稱取1 g紅玫瑰葡萄皮在3個圓底燒瓶中，分別加入10 m L甲醇、乙醇和水，80℃回流提取2 h，冷卻后過濾，濾液轉移到50 m L容量瓶中，定容到刻度。分別量取2.0 mL提取液于25 m L容量瓶中，然后加入5%NaNO2溶液1 m L，1%Al（NO3）3溶液1 m L，4%NaOH溶液10 m L，定容到刻度，搖勻，然后在510 nm波長測定其吸光度［14］。

1.3.2 脫脂

分別稱取1 g紅玫瑰葡萄皮置于2個圓底燒瓶中，一個瓶內加入5 mL石油醚，另外一個為空白對照，進行脫脂處理，研究脫脂和不脫脂對黃酮提取效果的影響［14］。

1.4 正交實驗

設計乙醇體積分數（A）、提取時間（B）、提取溫度（C）和料液比（D）為4個主要考察因素，每個因素設計3個水平，選用L9（34）表設計實驗［15］，以葡萄中黃酮的得率為考察指標，獲得最佳的提取工藝（表1）。3個水平1、2、3，分別對應A乙醇體積分數50%、60%、70%，B提取時間60、90、120 min，C提取溫度60、70、80℃，D料液比1：10、1：20、1：30 g·m L-1。

1.5 昭通葡萄中黃酮含量的測定及加標回收率

在最佳提取工藝條件下，分別稱取1 g（紅玫瑰和巨峰）的果皮和果肉進行提取實驗，在波長為510 nm下測定其吸光度。按照上述方法重復3次，并計算相對標準偏差［15］。此外，分別在果皮樣品中加入20 mg，葡萄果肉樣品中加入5 mg的蘆丁標準樣品，在相同條件下進行回收率實驗。

2 結果與分析

2.1 最大吸收波長的選擇及標準曲線的建立

隨著掃描波長增加，吸光度逐漸增加，在510 nm波長處出現最大吸收峰；再增加掃描波長，吸光度開始下降，故確定510 nm為蘆丁的最大吸收波長［15］。此外，取510 nm處的吸光度，根據濃度和吸光度可得回歸方程為：A=10.113 3 C+ 0.033 13，R2=0.999 84，表明濃度為0.017～0.103 mg·m L-1時，蘆丁濃度和吸光度之間呈線性關系。

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 提取溶劑

采用乙醇、甲醇、水做提取溶劑，樣品在510 nm處的吸光度分別為0.425、0.208、0.367，故采用乙醇提取效果最好，水次之，甲醇效果最差。可能因為乙醇沸點較低且容易揮發，因此最佳提取溶劑是乙醇［14］。

2.2.2 樣品脫脂

用石油醚進行脫脂后，樣品的吸光度為0.481，比不脫脂處理的吸光度（0.243）大，可能因為提取溶劑能溶解脂類物質，降低對黃酮類物質的溶解。若對樣品進行脫脂處理，可以提高黃酮的得率［14］。

2.3 正交實驗結果

4個因素對黃酮提取率的影響為D＞B＞C＞A。以得率作為昭通葡萄中黃酮提取的考察指標，可以得最優提取工藝組合為A2B2C3D1，即乙醇體積分數為60%，提取時間為90 m in，提取溫度為80℃和料液比為1：10，此時得率為3.55%（表1）。

表1 正交實驗結果及分析

2.4 葡萄中黃酮含量的測定及加標回收率

采用上述最佳提取工藝，提取昭通特色葡萄中的黃酮，并在最佳吸收波長510 nm處，測定提取樣品溶液的吸光度，由回歸方程求出2種葡萄中黃酮的含量。紅玫瑰果皮含量最高為3.52%，巨峰果皮為3.49%，紅玫瑰果肉為0.59%，巨峰果肉為0.49%（表2），表明2種葡萄中果皮黃酮含量比果肉的高，本研究所得數值比文獻［11-13］稍微偏低。

表2 葡萄樣品中黃酮的含量及加標回收率（n=3）

3 小結

設計單因素實驗和正交實驗優化提取昭通葡萄中的黃酮，并用紫外分光光度法測定其含量。該方法操作簡便，結果準確，易重復且適用于基層實驗室，可作為昭通葡萄中黃酮的提取工藝及含量測定的新方法，為昭通葡萄的開發利用提供理論依據。

［1］ 張縱圓，彭秧.葡萄葉中總黃酮的提取工藝研究［J］.生物技術，2007，17（6）：58-60.

［2］ BRAD K，LIUW，ZHANG Y.Optimization of the extraction of flavonoids from grape leaves by response surfacemethodology［J］.Journal-Chemical Society of Pakistan，2013，35（4）：1103-1105.

［3］ YE L，WANG H，DUNCAN S E，et al.Antioxidant activities of Vine Tea（Ampelopsis g rosseden tata）extract and its major component dihydromyricetin in soybean oil and cooked ground beef［J］.Food Chem istry，2015，172：416-422.

［4］ YING Z，HAN X，LI J.Ultrasound-assisted extraction of polysaccharides from mulberry leaves［J］.Food Chemistry，2011，127（3）：1273-1279.

［5］ 古麗巴哈爾·阿巴拜克力.新疆瑣瑣葡萄葉總黃酮提取工藝及抗氧化活性［J］.食品科學，2013，34（12）：104-108.

［6］ 庫爾班江·巴拉提，周兆祥.葡萄葉總黃酮的提取及體外抑菌活性研究［J］.動物醫學進展，2016，37（1）：58-62.

［7］ ZHAO S，KWOK K C，LIANG H.Investigation on ultrasound assisted extraction of saikosaponins from Radix Bupleuri［J］. Separation&Purification Technology，2007，55（3）：307-312.

［8］ 魏鳳華，倪艷，宋強，等.響應曲面法優化葛根總黃酮的提取工藝研究［J］.世界科學技術：中醫藥現代化，2015，17（1）：261-266.

［9］ 朱德艷.葛根黃酮不同提取方法比較［J］.江蘇農業科學，2015（5）：265-267.

［10］ 邊梅娜，李松澤，白紅進，等.響應面法優化赤霞珠葡萄葉總黃酮的提取工藝［J］.新疆農業科學，2013，50（11）：2037-2045.

［11］ 鄭朝華，陳建秋.葡萄皮總黃酮的提取及其對羥基自由基清除作用的研究［J］.安徽農業科學，2012，40（29）：14486-14487.

［12］ ZHONG G，CHEN Z，MIN Y.Major flavonoids and their antioxidant capacity in grape seeds and skins［J］.Journal of Southwest Agricultural University，2005.

［13］ 尚永輝，孫家娟，劉彬，等.三波長分光光度法測定葡萄籽中總黃酮含量［J］.分析科學學報，2013，29（5）：706-708.

［14］ 祖麗皮亞·玉努斯.瑣瑣葡萄果實總黃酮提取工藝［J］.食品科學，2010，31（24）：159-162.

［15］ 沈燕瓊，李啟彭.會澤葛根中黃酮提取的優化工藝及含量測定［J］.食品安全質量檢測學報，2016，7（2）：741-745.

（責任編輯：侯春曉）

S663.1；TQ463

B

0528-9017（2017）01-0126-02

文獻著錄格式：李啟彭，李成楊，祁岑，等.昭通葡萄中黃酮提取工藝及含量測定［J］.浙江農業科學，2017，58（1）：126-128.

10.16178/j.issn.0528-9017.20170140

2016-08-18

昭通學院校級課題（2016xj35）

李啟彭（1987-），男，云南會澤人，講師，博士，研究方向為無機及分析化學，E-mail：83064313@qq.com。

沈燕瓊，E-mail：184696105@qq.com。