黃芪多糖對腹腔注射大腸桿菌小鼠TLR信號通路MyD88、ERK及細胞因子的影響

劉 燦，王 嬋，左之才*，王正中，李學偉，馬繼登

（1.四川農業大學動物醫學院環境公害與動物疾病四川省高校重點實驗室，四川雅安 625014；2.四川農業大學動物科技學院動物遺傳育種研究所，四川成都 611130）

黃芪多糖對腹腔注射大腸桿菌小鼠TLR信號通路MyD88、ERK及細胞因子的影響

劉 燦1，王 嬋1，左之才1*，王正中1，李學偉2，馬繼登2

（1.四川農業大學動物醫學院環境公害與動物疾病四川省高校重點實驗室，四川雅安 625014；2.四川農業大學動物科技學院動物遺傳育種研究所，四川成都 611130）

研究黃芪多糖調節動物機體的基本免疫應答的機理。試驗選取了132只健康小鼠飼養并采樣，其中6只為初始對照記為感染前72 h（-72 h），其余小鼠分為3組。Ⅰ組為黃芪多糖組（66 mg·kg-1灌胃黃芪多糖），Ⅱ組為模型組（66 mg·kg-1蒸餾水灌胃），Ⅲ組為健康對照組（66 mg·kg-1蒸餾水灌胃），每日1次，連用3 d；試驗第4天，Ⅰ、Ⅱ組小鼠腹腔注射大腸桿菌液（0.1 mL·只-1），Ⅲ組小鼠腹腔注射等體積生理鹽水。在注射后0、3、6、12、24、48、168 h，每組隨機選取6只小鼠眼球采血分離血清，采用ELISA試劑盒檢測MyD88、ERK、TNF-α、IL-6指標。與Ⅲ組比較，Ⅱ組小鼠在0～48 h的MyD88、ERK、TNF-α、IL-6均升高。與Ⅱ組比較，Ⅰ組小鼠在0 h的MyD88、ERK、TNF-α均升高，在3～24 h的MyD88、ERK，在3～12 h的IL-6均顯著下降（P＜0.05），TNF-α在168 h顯著升高（P＜0.05）。感染大腸桿菌會明顯激活小鼠MyD88-ERK通路，但當預防用黃芪多糖激活小鼠MyD88-ERK通路后，再感染大腸桿菌時則并不能引起MyD88-ERK通路的進一步激活。預防用黃芪多糖可減輕大腸桿菌感染引起的應激反應，緩解其引起的MyD88-ERK通路激活，進而達到調節機體免疫平衡的作用。

黃芪多糖；大腸桿菌；ERK通路；炎癥

Toll受體（Toll-ike receptor，TLR）信號通路在自身免疫中有著非常重要的作用［1］，內毒素（lipopolysaccharide，LPS）為大腸桿菌的致病因子之一，主要激活機體TLR信號通路，引起機體炎癥反應。LPS與LBP（脂多糖結合蛋白）結合后，通過CD14傳遞給TLR4/MD2復合體，形成異源二聚體，通過兩種不同的接頭蛋白啟動兩條信號通路：TIRAP-MyD88［髓樣分化因子（myeloid differentiation factor 88，MyD88）］通路（MyD88依賴性途徑）及TRIF-TRAM通路（非MyD88依賴性途徑）。在MyD88依賴性途徑中，通過一系列胞內信號轉導因子的信息傳遞可激活IKK/NF-κB及絲裂原活化的蛋白激酶（MAPKs）途徑，MAPKs包括ERK（細胞外信號調節激酶）、P38、JNK，當他們被激活后可誘導核轉錄因子AP-1進入胞核，啟動一系列與應激相關的炎性介質如TNF-α（腫瘤壞死因子-α）、IL-1（白細胞介素-1）、IL-6（白細胞介素-6）等合成［2］。ERK，稱為細胞外信號調節激酶。當其被激活時可進入核內，磷酸化AP-1，調控基因的表達［3-5］。TNF-α是由巨噬細胞和單核細胞產生的炎性細胞因子，有免疫調節、參與發熱和炎癥發生的功能［6］。IL-6主要由T細胞、B細胞等細胞產生，是參與免疫調節和炎性反應的重要細胞因子之一［7］。另一方面，非MyD88依賴性途徑主要通過TRIF/IRF3誘導IFN-β（干擾素-β）的產生［8-10］。

黃芪多糖作為一種具有多重功效的天然提取物質，對機體免疫系統具有非常廣泛的調節作用，能全面提高機體的免疫監視和免疫防御功能，增強免疫力，抵抗外界不良因素的侵害［11］。為進一步探討黃芪多糖作為感染性疾病預防用藥的科學性與合理性，試驗研究預防用黃芪多糖對腹腔注射大腸桿菌小鼠MyD88依賴性途徑ERK以及下游細胞因子的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

清潔級昆明小鼠132只，6～8周齡，體重18～22 g，雌雄各半，購自四川大學華西醫學中心實驗動物中心。

1.2 試驗藥物

黃芪多糖注射液（質量體積比10 mg·m L-1），成都乾坤動物藥業有限公司，批號：20150601。

1.3 試驗菌株及菌液配制

大腸桿菌（E.coli）從患水腫病竹鼠腹腔積液中分離，由四川農業大學獸醫內科實驗室保存。對該菌的前期研究表明，該大腸桿菌對昆明小鼠的LD0為1.7×107，LD50為9.9×107，LD100為4.3× 108。本試驗參照此菌對昆明小鼠的最大耐受量作為注射濃度。

將E.coli復蘇并接種于5 m L MH肉湯培養基37℃培養16～18 h，用平板菌落計數法，估算其菌液濃度，再將菌液濃度稀釋至約為1.7×108m L-1，備用。

1.4 主要試劑及儀器

全自動熒光酶標分析儀（PR-521）。小鼠MyD88、ERK、TNF-α和IL-6的ELISA檢測試劑盒，均購自武漢基因美生物科技有限公司（Lot. 201601）。

1.5 試驗動物分組及處理

待小鼠適應飼養后，按照性別、體重選取6只未作任何處理的健康小鼠直接采樣，作為各組小鼠的初始對照，記為-72 h；另將精神、體況接近的126只小鼠按照性別、體重分為3組。其中Ⅰ組為黃芪多糖組；Ⅱ組為模型組；Ⅲ組為健康對照組。Ⅰ組于每日8：00，將制備的黃芪多糖按66 mg· kg-1灌胃，每日1次，連用3 d，Ⅱ、Ⅲ組灌胃同體積蒸餾水。在試驗第4天上午8：00，Ⅰ、Ⅱ組小鼠腹腔注射大腸桿菌液（0.1 m L·只-1），Ⅲ組小鼠腹腔注射0.1 m L生理鹽水。在注射后0、3、6、12、24、48、168 h，每組隨機處死6只小鼠，通過眼球采血法獲取血液分離血清，進行試驗。各組按常規飼養管理。

1.6 樣本采集與檢測指標

1.6.1 臨床觀察

觀察小鼠自主活動、體重變化、皮毛、呼吸、攝食、飲水、排泄、死亡等情況。

1.6.2 檢測指標及方法

于試驗各個時間點，每組隨機選取6只小鼠，摘除眼球采血0.7 mL，4℃3 000 r·min-1離心20 min，分離血清，-20℃保存備用。按照試劑盒說明書測定血清中MyD88、ERK、TNF-α、IL-6的含量。

1.7 數據處理

用SPSS 11.0軟件進行方差分析和多重比較，數據用平均值±標準差表示。P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著，P＞0.05表示差異不顯著。

2 結果和分析

2.1 各組小鼠腹腔注射大腸桿菌前后的臨床表現

腹腔注射大腸桿菌前各組小鼠精神狀況良好，飲、食欲正常。腹腔注射大腸桿菌后，小鼠相繼出現患病癥狀，其中Ⅰ組僅有部分小鼠在注射后3～12 h有精神稍差、活動減少的表現；24 h后小鼠的行為表現及精神狀態基本恢復正常。Ⅱ組在注射后3 h，多數小鼠的飲、食欲顯著下降，并出現蜷縮現象；6 h左右，部分小鼠精神高度沉郁、呼吸急促，部分小鼠眼周出現分泌物等癥狀；12 h左右，小鼠病情基本穩定，與6 h時觀察到的癥狀相似，且可見被毛無光澤；24 h左右，小鼠逐漸恢復正常，較上次觀察時活潑，飲、食欲有所增加；注射48 h及1周（168 h）后，小鼠精神狀況良好，飲、食欲正常。Ⅲ組小鼠精神狀況良好，飲、食欲正常。各組小鼠均無死亡。

2.2 小鼠血清中M yD88的變化

與Ⅲ組相比，Ⅱ組小鼠血清MyD88含量在6～24 h均極顯著或顯著升高（表1）。組內相比，Ⅱ組小鼠在6和12 h的MyD88含量極顯著高于-72、0、48和168 h，呈先升高后下降的變化趨勢，在12 h達到峰值；Ⅲ組小鼠各時間點的指標間變化不顯著。

Ⅰ組小鼠在0 h血清中的MyD88含量極顯著高于Ⅱ組，與Ⅲ組差異不顯著。Ⅱ組在3 h的MyD88含量極顯著高于Ⅰ組；Ⅱ組在6、12、24 h的MyD88含量均顯著或極顯著高于Ⅰ組。從總體上看，Ⅰ組小鼠在感染后的MyD88含量呈下降、升高、下降、升高的變化趨勢，但整體幅度變化較小，差異不顯著。

上述結果表明，單獨腹腔注射大腸桿菌可使小鼠血清中的MyD88含量顯著升高；但當用黃芪多糖預防3 d，小鼠血清中的MyD88升高后，再腹腔注射大腸桿菌并不引起血清中MyD88的進一步增高。

2.3 小鼠血清中ERK的變化

由表2可見，Ⅱ組小鼠在3～12 h血清ERK含量均極顯著高于Ⅲ組，其余時間點差異不顯著。Ⅱ組小鼠的ERK含量，在3 h達到峰值并極顯著高于其他各時間點；在6 h、12 h極顯著高于-72、0、24、48、168 h。Ⅲ組小鼠在各時間點的ERK含量差異不顯著。

表1 小鼠血清中MyD88含量的變化ng·m L-1

表2 小鼠血清中ERK含量的變化ng·m L-1

Ⅱ組小鼠在3、6、12、24 h的ERK含量極顯著高于Ⅰ組。Ⅰ組小鼠各時間點的ERK含量差異不顯著。

結果顯示，使用3 d黃芪多糖后，可有效減緩感染大腸桿菌引起的小鼠ERK的升高。

2.4 小鼠血清中TNF-α的變化

與Ⅲ組相比，Ⅱ組小鼠血清中TNF-α含量在3～24 h均極顯著升高（表3）。組內相比，Ⅱ組在3 h的TNF-α含量極顯著高于-72、0、48、168 h，呈先升高后下降的變化趨勢，在3 h達到峰值；Ⅲ組小鼠各時間點的指標間變化不顯著。

Ⅰ組小鼠在0 h的TNF-α含量均極顯著高于Ⅱ、Ⅲ組。Ⅰ組在感染3、6、12、24、48 h的 TNF-α含量與Ⅱ組無明顯差異，而在感染168 h的TNF-α含量極顯著高于Ⅱ組。Ⅰ組小鼠在感染后TNF-α含量呈先下降、后升高的變化趨勢，但整體幅度變化較小，差異不顯著。

結果顯示，使用3 d預防用黃芪多糖后，可升高TNF-α水平，而感染大腸桿菌后并不進一步升高TNF-α水平。單獨感染大腸桿菌可明顯升高TNF-α水平。

2.5 小鼠血清中IL-6的變化

與Ⅲ組相比，Ⅱ組小鼠血清中IL-6含量在各時間點均無顯著差異（表4）。組內相比，Ⅱ組在3 h的IL-6含量極顯著高于-72、0、12、24、48、168 h，呈升高、下降、升高的趨勢變化，IL-6在3 h達到峰值。Ⅲ組小鼠各時間點的指標間變化不顯著。

表3 小鼠血清中TNF-α含量的變化ng·L-1

表4 小鼠血清中IL-6的變化ng·L-1

在使用黃芪多糖3 d（0 h）后，各組小鼠的IL-6含量均無顯著差異。Ⅰ組小鼠在感染3、6、12 h的IL-6含量極顯著低于Ⅱ組；感染24、48、168 h，各組無顯著差異。總的來看，Ⅰ組小鼠在感染后IL-6含量呈下降、升高的變化趨勢。

結果顯示，使用3 d預防用黃芪多糖后，可輕度抑制小鼠IL-6水平，而感染大腸桿菌后繼續抑制IL-6。單獨感染大腸桿菌可升高IL-6水平。

3 討論

3.1 腹腔注射大腸桿菌對小鼠M yD88依賴途徑ERK及下游細胞因子IL-6、TNF-α的影響革蘭氏陰性菌侵入機體后釋放出LPS，引起機體炎癥應答。小鼠腹腔內注射大腸桿菌會誘發急性腹膜炎，引起嚴重的內毒素血癥，致使小鼠出現感染性休克癥狀，最終死亡。而內毒素血癥可激活各類免疫細胞釋放多種炎性介質和細胞因子，如TNF-α、lL-6等［12］。

本試驗中，當小鼠腹腔注射大腸桿菌后，Ⅱ組小鼠血清中MyD88含量在12 h達到峰值，ERK含量在3 h達到峰值，而細胞因子IL-6、TNF-α含量也在3 h達到高峰，隨后呈下降趨勢。表明細菌侵入機體后，激活MyD88依賴途徑，在0～3 h激活ERK通路，持續至12 h。ERK通路在0～3 h的強力激活使得細胞因子IL-6、TNF-α大量釋放，引起強烈炎癥反應。

3.2 黃芪多糖對腹腔注射大腸桿菌小鼠M yD88依賴途徑ERK及下游細胞因子IL-6、TNF-α的影響

從各組小鼠MyD88的變化可以看出，黃芪多糖組小鼠MyD88在6 h顯著降低后又逐漸升高，且整體表現為MyD88水平低于模型組。由此推測黃芪多糖可能通過抑制感染大腸桿菌小鼠的TLR4通路中MyD88接頭蛋白的水平，從而減輕機體受到的炎癥損害。有研究指出，單味中藥其有效成分或中藥復方可通過阻斷或抑制TLR4信號通路中MyD88的表達，從而減輕炎癥損害［8］。

邵曉軼等［13］指出在LPS誘導大鼠雪旺氏細胞TNF-α表達中，ERK信號通路的激活可能是LPS誘導TNF-α表達的前提，從而誘導TNF-α、IL-6等細胞因子的釋放，誘導炎癥損傷。試驗中，黃芪多糖組小鼠ERK在3 h急劇下降，極顯著低于模型組和對照組，TNF-α、IL-6也出現顯著下降，整體均表現為黃芪多糖組顯著低于模型組。張蘊穎［14］、李冬方［15］在研究黃芪多糖對炎癥模型細胞所釋放的炎癥因子中發現，黃芪多糖能夠顯著下調IL-6、TNF-α表達。小鼠灌胃黃芪多糖3 d，MyD88、ERK、TNF-α均升高，而對IL-6輕度抑制，表明預防用黃芪多糖可激活MyD88-ERK通路。當腹腔注射大腸桿菌后，黃芪多糖組在0～48 h MyD88、ERK、TNF-α、IL-6水平較感染組低，表明感染會激活MyD88-ERK通路，而預防用黃芪多糖可減輕或適度抑制感染引起的MyD88-ERK通路的進一步激活。可見，預防用黃芪多糖可減輕感染所致的應激反應，調節機體免疫平衡，進而達到增強機體免疫功能的目的。

綜上所述，感染大腸桿菌會明顯激活小鼠MyD88-ERK通路，但當預防用黃芪多糖激活小鼠MyD88-ERK通路后，再感染大腸桿菌時則并不引起MyD88-ERK通路的進一步激活。預防用黃芪多糖可減輕大腸桿菌感染引起的應激反應，緩解其引起的MyD88-ERK通路激活，進而達到調節機體免疫平衡的作用。

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（責任編輯：盧福莊）

S856.3

A

0528-9017（2017）01-0143-04

文獻著錄格式：劉燦，王嬋，左之才，等.黃芪多糖對腹腔注射大腸桿菌小鼠TLR信號通路MyD88、ERK及細胞因子的影響［J］.浙江農業科學，2017，58（1）：143-147.

10.16178/j.issn.0528-9017.20170146

2016-08-21

四川省科技支撐計劃項目（2013NZ0032）

劉 燦（1993-），女，四川郫縣人，本科，從事中西獸醫與臨床工作，E-mail：1107486614@qq.com。

左之才，E-mail：zzcjl@126.com。