豬支氣管敗血波氏桿菌的分離鑒定

羅冰冰 孫鑫鵬 韓先杰（青島農業大學動物科技學院 山東 青島 266109）

豬支氣管敗血波氏桿菌的分離鑒定

羅冰冰 孫鑫鵬 韓先杰*（青島農業大學動物科技學院 山東 青島 266109）

為了確定引起青島市某豬場發病的主要病原菌，本試驗對該豬場送檢的病死豬進行剖檢，從肺臟中分離得到一株細菌，隨后進行分離菌的形態觀察、生化試驗、細菌16S rRNA基因測序與藥敏試驗。結果顯示該株分離菌為革蘭氏陰性桿菌；生化試驗結果表明該株菌分解氨基酸、不分解糖類，與支氣管敗血波氏桿菌的生化試驗結果大致相同；16S rRNA基因序列與支氣管敗血波氏桿菌(GenBank序列號：AP014582.1)同源性為100%；藥敏試驗結果表明該株分離菌對部分氟喹諾酮類、氨基糖苷類藥物敏感。細菌分離鑒定和藥敏試驗的結果為豬場發生該病時如何用藥治療提供參考依據。

支氣管敗血波氏桿菌 分離鑒定 藥敏試驗

支氣管敗血波氏桿菌可引起豬發生非進行性萎縮性鼻炎和支氣管肺炎[1]，也是豬呼吸道綜合征的重要致病因子之一[2]。近年來，隨著豬的跨區域引種頻繁，以及中國集約化養殖的開展，由支氣管敗血波氏桿菌引起的呼吸道疾病也隨之擴散[3]。2016年3月，青島市某豬場仔豬發生呼吸道綜合征并出現死亡現象，給該養殖場造成較大的經濟損失。為了進一步做好該病的防治工作，本研究對病死豬進行了致病菌的分離鑒定與藥敏試驗，以期為豬場控制該病提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 某豬場送檢的病死豬，無菌采集具有明顯病變的肺臟。

1.1.2 主要試劑 PCR試劑(10×PCR Buffer、dNTPs、

ExTaq酶)、DL2000 DNA Marker購自寶生物工程(大連)有限公司；胰蛋白胨大豆瓊脂、MH瓊脂和腦心浸液購自青島高科技工業園海博生物技術有限公司；通用型柱式基因組提取試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司；藥敏紙片、細菌微量發酵管購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.1.3 試驗動物 ICR小白鼠(體重約20g)購自青島大吳富城養殖有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌的分離培養 無菌操作從病死豬的肺臟中分離細菌，劃線接種于胰蛋白胨大豆瓊脂平板，37℃培養

18～24h后觀察。挑取單個菌落進行染色、鏡檢，觀察細菌的形態。

1.2.2 生化試驗 挑取單個分離菌接種于細菌微量發酵管中，37℃培養18～24h，觀察、記錄生化反應結果。

1.2.3 16S rRNA基因的PCR擴增 按照通用型柱式基因組提取試劑盒說明書提取細菌基因組DNA。參照文獻報道的方法合成一對用于擴增細菌16S rRNA基因序列的引物[4]，上游引物：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′；下游引物：5′-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′，引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。以基因組DNA為模板進行PCR反應，PCR反應體系(50μl)包括：10×PCR Buffer 5.0μl，dNTP4.0μl，上、下游引物各2.0μl，DNA模板2.0μl，Ex Taq酶1.0μl，去離子水34.0μl。PCR反應條件：94℃預變性5min；94℃變性30s，54℃退火30s。72℃延伸1.5min，33個循環；72℃延伸7min；4℃終止反應。PCR產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 PCR產物測序與DNA序列分析 純化、回收PCR產物，送交寶生物工程(大連)有限公司測序，利用NCBI的BLAST工具對分離菌的16S rRNA的基因序列進行同源性比對。

1.2.5 動物試驗 將分離菌的純培養物接種于腦心浸液中37℃培養18～24h，并計算活菌數。選取5只健康ICR小白鼠，每只腹腔注射菌液0.25ml(2.1×108CFU/ml)菌液；另取5只體重相近的健康ICR小白鼠，每只腹腔注射等量滅菌腦心浸液。小鼠攻毒后連續7天觀察臨床表現及死亡情況。

1.2.5 藥敏試驗 按照Kirby-Bauer瓊脂擴散法進行分離菌的藥敏試驗[5]，參照文獻報道的方法進行藥物敏感性的判定[6]。

2 結果

2.1 細菌分離及形態觀察

分離菌株37℃培養18～24h后，在胰蛋白胨大豆瓊脂平板上生長出圓形、光滑、米黃色的小菌落。經革蘭氏染色、鏡檢，結果為革蘭氏陰性中等大小桿菌，多呈單個排列。

2.2 生化試驗結果

該株分離菌生化試驗結果見表1。該菌分解氨基酸，不分解糖類，不產硫化氫，枸櫞酸鹽、脲酶、氧化酶試驗為陽性，ONPG、VP、吲哚試驗為陰性。與支氣管波氏桿菌生化反應結果大致相符[7]。

表1 博檢革蘭氏陰性細菌鑒定系統生化試驗結果

2.3 分離菌16S rRNA基因的PCR擴增

分離菌16S rRNA基因序列的PCR產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，在1500bp左右出現目的條帶(附圖)，與預期大小相符。

附圖 PCR擴增分離菌16S rRNA 基因結果M. DNA標準DL2000； 1. 分離菌；2，陰性對照

2.4 基因測序分析

利用NCBI的BLAST工具與數據庫中登錄的序列進行了同源性比對分析，結果顯示該菌株與序列(GenBank序列號：AP014582.1)同源性為100%，因此可確定分離菌株為支氣管敗血波氏桿菌。

2.5 動物試驗

試驗小鼠于接種菌液后出現精神萎靡，食欲、飲欲廢絕，被毛雜亂等臨床癥狀，在48h內全部死亡。對照組小鼠在觀察期內，全部健康存活。死亡小鼠眼觀主要病變為肺臟、肝臟和腸等出血、壞死。取死亡小鼠的肺、肝接種胰蛋白胨大豆瓊脂平板，均生長出與原分離菌相同的菌。

2.6 藥敏試驗

分離菌的藥敏試驗結果見表2。分離菌對部分氨基糖苷類、氟喹諾酮類藥物高度敏感，對新霉素中介，對利福平、頭孢拉定耐藥。

表2 分離菌各種藥敏紙片的抑菌直徑測量結果 (μg、mm)

3 討論

（1）支氣管敗血波氏桿菌廣泛分布于自然界，可以引起豬萎縮性鼻炎，也可引起豬生長緩慢飼料利用率低，同時其先期感染能夠促進其它多種病原的繼發感染并造成嚴重損失[8]。支氣管敗血波氏桿菌在仔豬群中主要通過呼吸道和飛沫等方式進行傳播[9]。本研究的病料來自2016年3月青島某養豬場的病死仔豬，根據解剖病變結果，進一步結合細菌分離、生化試驗和分子生物學技術鑒定，最終確診為支氣管敗血波氏桿菌感染，分離菌對小鼠有一定的致病力。藥敏試驗結果表明分離菌部分氨基糖苷類、氟喹諾酮類藥物高度敏感，對新霉素中介，對利福平、頭孢拉定耐藥。（2）支氣管敗血波氏桿菌一般要在一系列的誘因作用下才能發病，因此，建議養殖場定期打掃衛生、及時消毒、通風、注意保暖，減少發病的誘因。另外，當豬場發生細菌性疾病時，應當進行藥敏試驗，選擇敏感藥物進行交替用藥治療，避免產生耐藥性。

[1] 趙德明, 張中秋, 沈建忠譯.豬病學(第8版). 北京: 中國農業大學出版社, 2000: 369-396.

[2] Bochev I. Porcine respiratory disease complex(PRDC): a review. I.Etiology, epidemiology, clinical forms and pathoanatomical features.Bulgarian Journal of Veterinary Medicine, 2007, 10(3): 131-146.

[3] 吳斌, 陳煥春, 何啟蓋等. 應用乳膠凝集試驗進行豬傳染性萎縮性鼻炎血清流行病學調查[J]. 中國獸醫科技, 2001, 31(6): 21-22.

[4] 陳香碧, 蘇以榮, 何尋陽等. 喀斯特原生土壤與退化生態系統土壤細菌群落結構[J]. 應用生態學報, 2009, 20(4): 863-871.

[5] CLSI. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing(Twenty-Third Informational Supplement) , 2013.

[6] 裴潔.豬支氣管敗血波氏桿菌分離鑒定及疫苗菌株的生物學特性研究[D]. 武漢：華中農業大學, 2006:17.

[7] 李一經(主編). 獸醫微生物學[M]. 北京: 高等教育出版社, 2011: 192.

[8] 趙戰勤, 裴潔, 薛云等. 豬源支氣管敗血波氏桿菌的分離鑒定及生物學特性研究[J]. 中國農業科學 2008, 41(12): 4209-4217.

[9] 羅滿林. 動物傳染病學[M]. 北京: 中國林業出版社, 2013: 236.

S852.61+3

A

1007-1733(2017)02-0012-02

2016–10–26）

山東省應用型人才培養特色名校建設大學生科技創新項目；山東省現代農業產業技術體系生豬創新團隊養豬生產與環境控制崗位（SDAIT-08-10）；青島農業大學大學生創業實訓項目

*通訊作者