高谷物日糧促進山羊瘤胃上皮單羧酸轉運蛋白1及鈉鉀ATP酶mRNA的表達

劉軍花，朱偉云，毛勝勇

(江蘇省消化道營養與動物健康重點實驗室，南京農業大學消化道微生物研究室, 江蘇 南京210095)

高谷物日糧促進山羊瘤胃上皮單羧酸轉運蛋白1及鈉鉀ATP酶mRNA的表達

劉軍花，朱偉云，毛勝勇*

(江蘇省消化道營養與動物健康重點實驗室，南京農業大學消化道微生物研究室, 江蘇 南京210095)

本試驗旨在研究高谷物日糧對山羊瘤胃上皮形態結構及單羧酸轉運蛋白(monocarboxylate transporter, MCT)和鈉鉀ATP酶mRNA表達的影響。將10頭裝有永久性瘤胃瘺管的健康閹割公山羊隨機分為飼喂全粗料日糧的對照組(Hay,0%谷物,n=5)和飼喂高谷物日糧的處理組(HG,65%谷物,n=5)，試驗期為7周。試驗開始后，于每周晨飼后的0、2、3、4、6、8和12 h連續采集瘤胃液監測瘤胃pH值的變化，收集其中第0、3、6和12 h的瘤胃液待測揮發性脂肪酸(volatile fatty acid, VFA)濃度。試驗的第50天，屠宰采集瘤胃上皮用于形態學及基因定量分析。研究結果顯示：與全粗料組山羊相比，高谷物組山羊瘤胃pH值、乙酸濃度及乙丙比都顯著下降(P<0.001)，而瘤胃丙酸濃度、丁酸濃度及其他VFA濃度都顯著升高(P<0.001)；高谷物日糧組的瘤胃乳頭長度顯著高于對照組(P=0.001)，瘤胃乳頭寬度顯著低于對照組(P<0.001)，但是兩組間的瘤胃乳頭表面積并無顯著差異；透射電鏡結果顯示，長期飼喂高谷物日糧導致瘤胃上皮細胞線粒體發生降解；實時定量PCR結果表明，與對照組相比，高谷物日糧顯著升高了MCT1(P<0.001)和鈉鉀ATP酶(P=0.001)的mRNA表達量，顯著降低了MCT4的mRNA表達量(P=0.041)，但對MCT2的表達沒有顯著影響(P=0.305)；進一步分析這些基因的mRNA表達量與pH值和VFA濃度之間的相關性，結果顯示，MCT1和鈉鉀ATP酶的mRNA表達量與瘤胃pH值和乙酸濃度呈顯著負相關，與總VFA、丙酸、丁酸的含量呈顯著正相關，而MCT4的mRNA表達量與pH值呈顯著正相關，與總VFA、丙酸、丁酸的含量呈顯著負相關。以上結果提示：高精料引起的瘤胃pH值下降和VFA的變化可能與瘤胃上皮MCT和鈉鉀ATP酶表達量的變化相關。研究結果對深入認識高谷物飼喂引發的瘤胃功能紊亂具有重要意義。

高谷物日糧；瘤胃上皮；單羧酸轉運蛋白；鈉鉀ATP酶；山羊

在現代集約化養殖系統中，常常給高產反芻動物飼喂大量的精料以滿足其快速生長或是高產奶量的能量需要[1-4]。然而，大量的易發酵碳水化合物使得瘤胃的發酵速度超過瘤胃上皮對揮發性脂肪酸(volatile fatty acid, VFA)的吸收速度，導致VFA濃度上升，pH值下降[3,5]，而瘤胃內環境的改變對瘤胃上皮代謝及細胞內pH穩態都將是巨大挑戰。

瘤胃是反芻動物最大的消化吸收器官，瘤胃上皮對VFA的吸收除了能夠為機體提供能量需要外，還可以調節瘤胃內環境和瘤胃pH。瘤胃內產生的VFA約有65%至85%通過瘤胃上皮被吸收，同時瘤胃上皮也是Na+和Mg2+的主要吸收部位[6]。日糧中精料或代謝能水平的升高會增加瘤胃上皮對這些底物的轉運能力[7-8]。更高的轉運速率主要是依賴于瘤胃上皮形態學的改變，即高精料導致瘤胃上皮乳頭表面積增加，最終增加瘤胃上皮的吸收表面積[6-7]。大量研究結果顯示，高精料日糧可促進瘤胃上皮的生長發育，增加其吸收面積，最終促進VFA的吸收轉運[7,9]。但是，對于山羊瘤胃上皮上的VFA轉運相關蛋白如何快速適應高精料日糧并不是很清楚。因此，本研究的主要目的將研究飼喂高谷物日糧對山羊瘤胃吸收表面積及VFA轉運相關基因[包括：單羧酸轉運蛋白(monocarboxylate transporter, MCT)和鈉鉀ATP酶(Na+/K+-ATPase)] mRNA表達的影響，預期結果將對深入認識高谷物飼喂引發的瘤胃功能紊亂具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗設計與動物飼養

試驗于2012年1-4月在南京農業大學動物實驗基地進行。為了讓動物適應低能量日糧，試驗開始前5周，所有動物自由采食全粗料日糧。試驗開始，將10頭裝有瘤胃瘺管的2到3歲去勢公山羊(波爾山羊×淮南羊雜交山羊)隨機分為飼喂全粗料的對照組(Hay, 0%谷物,n=5)和飼喂高谷物日糧的處理組(HG, 65%谷物,n=5)，自由飲水，單欄飼喂。試驗開始前，兩組山羊的體重沒有顯著差異(29.8±0.86 vs. 30.0±1.05 kg,P=0.886)。依據山羊營養需要標準(NY/Y816-2004, 中國農業部, 2004)設計飼糧配方，對照組的代謝能略高于30 kg山羊的維持需要， 處理組的代謝能滿足30 kg山羊每天200 g 的生長需要。 對照組和處理組的日糧組成見表1。日糧平均分成兩份，于每天早晨八點半和下午四點半分別飼喂，飼喂量為每日750 g干物質每頭山羊，連續飼喂7周。

1.2 樣品采集

試驗開始后，于每周晨飼后的0、2、3、4、6、8和12 h連續采集瘤胃腹囊部瘤胃液監測瘤胃pH的變化，收集其中第0、3、6和12 h的瘤胃液-20 ℃保存待測VFA濃度。試驗的第50天，在晨飼后的4～5 h對山羊進行屠宰。屠宰后5 min之內，采集一塊腹囊部的瘤胃壁并用鈍物將漿膜層和肌肉層分離，得到的瘤胃上皮在冰的磷酸緩沖溶液里清洗3次，并將組織剪成0.5 cm×0.5 cm的小碎塊置于液氮保存，用于RNA的提取。清洗后的瘤胃乳頭4%多聚甲醛(Sigma，美國)和2.5%戊二醛(國藥)中固定保存，用于石蠟切片和透射電鏡觀察。

1.3 瘤胃生理參數測定

用便攜式pH計 (HI 9024C; HANNA Instruments, 美國) 測定瘤胃pH值。氣相色譜測定(GC-14B, 島津, 日本; 毛細管柱: 30 m×0.32 mm×0.25 mm 膜厚度) VFA濃度，參照秦為琳[10]的方法(柱溫=110 ℃, 汽化室溫度=180 ℃, 檢測器=180 ℃)。

1.4 組織形態學分析

每頭山羊取10根多聚甲醛固定的瘤胃乳頭做石蠟切片，蘇木精伊紅染色，切片厚度為6 μm，具體方法參見Odongo等[11]。我們在進行組織形態學分析時采用盲檢的方法, 在2倍鏡下對瘤胃乳頭的長度和寬度進行測量，每根乳頭選取5張片子，每頭動物每個-未檢測。-Not determined.指標共有50個重復。戊二醛固定的瘤胃乳頭參照Graham等[12]的方法進行處理。 瘤胃乳頭在2.5%的戊二醛溶液中固定至少24 h，固定好的樣品在酒精溶液中梯度脫水。脫水樣品在1∶1的樹脂和丙酮混合液中置換30 min，之后再在100%的樹脂中置換10 h。含有樹脂的樣品放入模具中，在40 ℃ 或 60 ℃溫度下聚合48 h。用玻璃刀切成半薄片(0.25～0.50 μm)，再用1%甲苯胺藍和1%硼酸鈉染色，用鉆石刀切出超微薄片(70～90 nm)，然后再用甲醇醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，最后透射電鏡進行觀察 (Hitachi H-7650, 日立, 日本)。

表1 試驗日糧組成及營養水平Table 1 Ingredient and nutrient levels of the experimental diets

1.5 RNA的提取和cDNA的合成

瘤胃上皮總RNA的提取參照Chomczynski等[13]的方法。使用微量核酸蛋白測定儀測定RNA的濃度和純度。所有樣品的吸收比例(260/280 nm)都在1.8～2.0之間，證明RNA純度較高。用1.4%的瓊脂糖膠檢測RNA的完整性。將所有的RNA濃度調整到1 μg/μL，置于-80 ℃冰箱保存備用。利用含基因組RNA酶的反轉錄試劑盒(Takara 生物, 日本)進行cDNA的合成。

1.6 引物的合成和實時定量PCR

MCT1, MCT2和MCT4的引物序列參照Naeem等[14]，Na+/K+-ATPase的引物序列參照Kuzinski等[6]，內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)的引物序列參照Wang等[15]。利用ABI 7300 定量PCR儀對目的基因及內參基因GAPDH進行定量。反應條件為：95 ℃ 30 s預變性，95 ℃ 5 s，57.5 ℃ (GAPDH) 或是 60 ℃ (目的基因) 31 s， 重復40個循環。反應體積20 μL，含有2×SYBRGreen PCR Master Mix，1～10 ng cDNA和200 nmol/L的上游和下游引物。所有樣品設3個重復。目的基因的相對表達量以管家基因GAPDH作為內參進行校正，數據分析采用2-△△CT的方法。

1.7 數據處理

結果以平均值±標準誤(means±SE)進行表示。采用SPSS 18.0中的混合模型(mixed model)對表2中的瘤胃生理參數進行統計，其中日糧(diet)及飼喂周數(week)作為固定效應(fixed effect)，山羊作為隨機效應(random effect)，每天的采樣時間點(time)作為重復測量(repeated measurement)。其他數據采用獨立樣本t檢驗進行顯著性分析。采用GraphPad Prism 5.00 (www.graphpad.com) 軟件分析目的基因的mRNA表達量與pH值和VFA濃度之間的相關性。P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 長期飼喂高谷物日糧對瘤胃內環境的影響

如表2所示，與全粗料組山羊相比，高谷物飼喂組山羊瘤胃pH值(P<0.001)、總VFA濃度(P<0.001)、乙酸濃度(P<0.001)及乙丙比(P<0.001)顯著下降；與全粗料組山羊相比，高谷物飼喂組山羊瘤胃丙酸濃度(P<0.001)、丁酸濃度(P<0.001)及其他VFA濃度(P<0.001)都顯著升高。隨著飼喂周數的變化，瘤胃pH值(P<0.001)、總VFA濃度(P<0.001)、乙酸濃度(P<0.001)、丙酸濃度(P=0.001)、丁酸濃度(P<0.001)、其他VFA濃度(P<0.001)及乙丙比(P<0.001)變化差異都顯著。飼喂周與日糧對瘤胃pH值(P<0.001)、總VFA濃度(P=0.004)、乙酸濃度(P=0.001)、丙酸濃度(P=0.002)及乙丙比(P<0.001)的影響存在顯著的交互作用。飼喂周與日糧對丁酸濃度(P=0.263)和其他VFA濃度(P=0.944)的影響不存在顯著的交互作用。

表2 連續7周高谷物飼喂對山羊瘤胃發酵參數的影響Table 2 Effects of high-grain (HG) diet on rumen fermentation during 7 weeks feeding

2.2 高谷物日糧對瘤胃乳頭形態結構的影響

如表3所示，高谷物日糧組的瘤胃乳頭長度顯著高于對照組(P=0.001)，瘤胃乳頭寬度顯著低于對照組(P<0.001)，但是兩組間的瘤胃乳頭表面積并無顯著差異；透射電鏡結果顯示(圖1)，高谷物日糧導致瘤胃上皮細胞的線粒體發生腫脹和降解。

2.3 高谷物日糧對瘤胃上皮MCT和Na+/K+-ATPase mRNA表達的影響

如圖2所示，與對照組相比，高谷物日糧顯著升高了 MCT1(P<0.001)和Na+/K+-ATPase(P=0.001)量(P=0.041)，但對MCT2的表達沒有顯著影響(P=0.305)。

表3 飼糧營養水平對瘤胃乳頭數目和表面積的影響Table 3 Effects of nutrition level on number and surface of rumen papillae in goats

注：數據以平均值±標準誤形式表示，n=5。

圖1 高谷物日糧對瘤胃上皮細胞線粒體結構的影響Fig. 1 Effects of HG diet on ruminal epithelial cell mitochondrial structure N：細胞核；M：線粒體。N: Nuclei; M: Mitochondria.

Note: Value are means±SEM,n=5.的mRNA表達量，顯著降低了MCT4的mRNA表達

圖2 高谷物日糧對瘤胃上皮單羧酸轉運蛋白和Na+/K+-ATPase mRNA 的相對表達量的影響Fig.2 The effect of HG diet on relative mRNA expression of ruminal epithelial MCT and Na+/K+-ATPase*,**,*** indicate significat difference.

2.4 瘤胃上皮營養轉運蛋白mRNA表達水平與瘤胃內pH值和VFA濃度的關系

進一步分析這些基因的mRNA表達量與pH值和VFA濃度之間的關系(表4)，結果顯示，MCT1和Na+/K+-ATPase的mRNA表達量與瘤胃pH值和乙酸濃度呈顯著負相關，與總VFA、丙酸、丁酸的含量呈顯著正相關，而MCT4的mRNA表達量與pH值呈顯著正相關，與總VFA、丙酸、丁酸的含量呈顯著負相關。

表4 目的基因的mRNA表達量與瘤胃生理指標之間的相關性Table 4 Relationship between target gene mRNA expression and ruminal physiological parameters

3 討論

瘤胃上皮發育受日糧等因素的影響。早期研究表明，增加日糧能量水平使瘤胃乳頭表面積在6～8周后增加到最大[16]。Bannink等[17]報道，給奶牛飼喂含高比例易發酵碳水化合物的日糧，其瘤胃上皮增殖速率迅速增加。Shen等[7]研究發現，高精料飼喂促進山羊瘤胃乳頭的增殖，使瘤胃乳頭吸收面積增加。許多學者對此結果的解釋為：動物對于瘤胃內高濃度的VFA可做出適應性反應，即通過增加瘤胃上皮的吸收面積來促進上皮對VFA的吸收，從而短時間緩解由高精料引起的瘤胃環境惡化[1,16]。本研究發現，長期飼喂高谷物日糧導致瘤胃乳頭長度增加，但并未對瘤胃乳頭的吸收面積產生顯著影響，推測其原因可能是短時間飼喂高谷物可促進瘤胃乳頭的生長，但長期飼喂導致瘤胃乳頭損傷，寬度變窄，雖然長度變長，但在寬度變窄的情況下，瘤胃乳頭的總吸收面積未發生改變，該推測也能在一定程度上解釋瘤胃內VFA的變化規律。在短期飼喂高谷物日糧時，瘤胃有一個適應過程(增加瘤胃乳頭的吸收面積)，此時瘤胃上皮對VFA的吸收能力增強，因而瘤胃內VFA的濃度有一個階段性下降的過程。但隨后在長期酸性及毒性物質的作用下，瘤胃乳頭形態受損，寬度變窄，吸收面積逐漸和對照組接近，這也使動物通過瘤胃上皮吸收來減少瘤胃內VFA累積的能力減弱，因而山羊瘤胃內VFA的濃度在短暫下降后又出現一個反彈的上升過程。

單羧酸轉運蛋白家族是反芻動物瘤胃上皮細胞膜上一類重要的跨膜轉運蛋白，負責乳酸、VFA等單羧酸類化合物的跨膜轉運。近年來有研究發現，高精料日糧或是亞急性瘤胃酸中毒會改變與瘤胃上皮單羧酸(VFA、乳酸和酮體等)轉運密切相關的MCT的表達[1]。Metzler-Zebeli等[9]研究發現，高谷物飼喂顯著上調山羊瘤胃上皮MCT1的表達，但是顯著下調MCT4的表達。本文的研究結果與上述研究結果相吻合。早期研究表明，MCT1主要位于瘤胃上皮細胞的底端(棘狀和基底層細胞)，介導VFA從上皮細胞轉運到血液，其基因表達具有底物依賴性[18]。這就能很好地解釋為什么高谷物飼喂可導致MCT1表達上升，并且其與瘤胃內VFA濃度顯著相關。MCT4主要位于瘤胃上皮的頂端(顆粒層細胞)，介導VFA從瘤胃腔轉運到上皮細胞[19]。這兩種單羧酸轉運蛋白位置及功能的差異決定了其表達變化的差異。我們前期研究表明，高谷物飼喂導致瘤胃上皮顆粒層細胞厚度顯著降低[20]，這可能與MCT4表達的下降密切相關。另一方面，研究表明，MCT4對VFA的轉運能力相對較弱[21]，那么高谷物飼喂引發的MCT4表達的下降可能是瘤胃上皮通過被動運輸和VFA-/HCO3-交換過度攝取VFA的一種平衡反應。上述結果也暗示，MCT1和MCT4在介導VFA吸收方面發揮著不一樣的作用。

Na+/K+-ATPase位于瘤胃上皮的棘裝層和基底層，對于建立其他營養物質轉運所必需的細胞間電化學梯度具有重要的作用。由Na+/K+-ATPase建立的Na+轉運動力對Na+的吸收及非直接的通過Na+/H+交換的VFA的吸收都是必需的[22]。已有研究證明，高精料日糧顯著增加綿羊瘤胃上皮急性轉運蛋白Na+/K+-ATPase的活性[6]。高谷物飼喂可導致瘤胃內的滲透壓升高[1]，瘤胃上皮Na+/K+-ATPase表達的上升可適應高強度的鈉離子轉運。同時透射電鏡的結果也進一步證實，高谷物飼喂導致瘤胃上皮細胞線粒體結構破壞，能量供應不足，從而導致Na+/K+-ATPase的表達適應性增強。因此，Na+/K+-ATPase表達上升更多可看作是山羊瘤胃上皮適應高能量日糧的一種調節機制。

4 結論

長期飼喂高谷物日糧并未改變瘤胃乳頭的吸收表面積，但導致瘤胃上皮細胞線粒體發生降解；同時，高谷物日糧顯著升高了 MCT1和Na+/K+-ATPase的mRNA表達量，顯著降低了MCT4的mRNA表達量。相關性分析結果表明，高精料引起的瘤胃pH值下降和VFA含量的變化與瘤胃上皮MCT和Na+/K+-ATPase表達量的變化相關。研究結果將對深入認識高谷物日糧引起的瘤胃功能紊亂具有重要意義。

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A high-grain diet promotes expression of MCT1 and Na+/K+-ATPase mRNAs in the ruminal epithelium of goats

LIU Jun-Hua, ZHU Wei-Yun, MAO Sheng-Yong*

JiangsuKeyLaboratoryofGastrointestinalNutritionandAnimalHealth,LaboratoryofGastrointestinalMicrobiology,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China

The objective of this study was to investigate the effect of a high-grain (HG) diet on the ruminal epithelial structure and the transcript levels of genes encoding monocarboxylate transporters (MCTs) and a Na+/K+-ATPase in goats. Ten ruminally fistulated, castrated male goats were randomly assigned to either a hay diet (Hay,0% grain,n=5) or a HG diet (HG,65% grain,n=5) with continuous feeding for 7 weeks. Each week, at 0, 2, 3, 4, 6, 8 and 12 h after morning feeding, rumen fluid was collected to monitor the changes in ruminal pH. The rumen fluid collected at 0, 3, 6, and 12 h after morning feeding was used to determine the volatile fatty acid (VFA) concentration. The results showed that, compared with the control, the HG diet significantly reduced rumen pH, acetate concentration, and the acetate-propionate ratio (P<0.001), and significantly increased the concentrations of ruminal propionate, butyrate, and other VFAs (P<0.001). The HG diet significantly increased the length but decreased the width of rumen papillae. The surface of the rumen papillae did not differ significantly between the two groups. The HG diet caused substantial damage to ruminal epithelial cell mitochondria. Compared with the hay-fed group, the HG-fed group showed increased transcript levels of genes encoding MCT1 (P<0.001) and the Na+/K+-ATPase (P=0.001), but decreased transcript levels of the gene encoding MCT4 (P=0.041). There was no significant difference in the transcript levels of MCT2 between the hay-fed and HG-fed groups (P=0.305). Correlation analyses revealed that the transcript levels of the genes encoding MCT1 and Na+/K+-ATPase were negatively correlated with ruminal pH and acetate concentration, but positively correlated with total VFA, propionate, and butyrate concentrations. The MCT4 mRNA level was positively correlated with pH, but negatively correlated with total VFA, propionate, and butyrate concentrations. These results suggested that the changes in ruminal pH and VFA concentrations were associated with the changes in the expression levels of MCTs and Na+/K+-ATPase. These findings provide important information for understanding HG diet-induced ruminal epithelial function disorder in ruminants.Key words: high-grain diet; rumen epithelium; monocarboxylate transporter; Na+/K+-ATPase; goats

10.11686/cyxb2016121

http://cyxb.lzu.edu.cn

2016-03-23；改回日期：2016-05-11

國家自然科學基金(31172228)資助。

劉軍花(1984-)，女，江西新干人，博士，講師。E-mail:liujunhua0011@163.com

*通信作者Corresponding author. E-mail:maoshengyong@163.com

劉軍花, 朱偉云, 毛勝勇. 高谷物日糧促進山羊瘤胃上皮單羧酸轉運蛋白1及鈉鉀ATP酶mRNA的表達. 草業學報, 2017, 26(2): 95-101.

LIU Jun-Hua, ZHU Wei-Yun, MAO Sheng-Yong. A high-grain diet promotes expression of MCT1 and Na+/K+-ATPase mRNAs in the ruminal epithelium of goats. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(2): 95-101.