水產(chǎn)品中孔雀石綠檢測(cè)方法的優(yōu)化

左舜宇，張?zhí)炻?/p>

(福建省海洋環(huán)境與漁業(yè)資源監(jiān)測(cè)中心，福建，福州 350003)

水產(chǎn)品中孔雀石綠檢測(cè)方法的優(yōu)化

左舜宇，張?zhí)炻?

(福建省海洋環(huán)境與漁業(yè)資源監(jiān)測(cè)中心，福建，福州 350003)

對(duì)水產(chǎn)品中孔雀石綠及隱色孔雀石綠的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法進(jìn)行了優(yōu)化。樣品依靠緩沖鹽體系將目標(biāo)物質(zhì)離子化后用酸性氧化鋁除脂，利用乙腈提取，濃縮后過中性氧化鋁小柱凈化，35 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)近干，用1.00 mL 5 mmol/L乙酸銨0.1%甲酸-甲醇溶液(1 ∶1，V/V)定容，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后上機(jī)檢測(cè)，采用同位素內(nèi)標(biāo)法定量。方法優(yōu)化后孔雀石綠和隱色孔雀石綠的線性范圍為0.5～20.0 ng/mL，相關(guān)系數(shù)均為0.999 9，檢出限為0.500 μg/kg,平均回收率分別為83.4%～101%和86.1%～101%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=5)分別為3.44%～7.76%和2.28%～8.74%。該方法靈敏度高，準(zhǔn)確性好，與現(xiàn)有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)相比，本方法減少了有機(jī)溶劑使用量、簡(jiǎn)化了前處理步驟，并且穩(wěn)定了目標(biāo)物質(zhì)回收率。通過驗(yàn)證，該方法適用于水產(chǎn)品中孔雀石綠及隱色孔雀石綠殘留的檢測(cè)。[中國(guó)漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)，2017,7(1):35-40]

水產(chǎn)品；孔雀石綠；隱色孔雀石綠；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

孔雀石綠(四甲基代二氨基三苯甲烷，malachite green，MG)又名堿性綠、孔雀綠、鹽基塊綠和苯胺綠，極易溶于水，水溶液呈藍(lán)綠色，是人工合成的綠色帶有金屬關(guān)澤的結(jié)晶體，屬于三苯甲烷型的綠色染料[1-2]，曾作為工業(yè)染料廣泛用于絲綢、皮革、羊毛等染色劑[3]。因其具有抗菌效果好、抗菌譜廣、價(jià)格便宜、容易獲得等優(yōu)點(diǎn)，從20世紀(jì)30年代開始，就被作為驅(qū)蟲劑、防腐劑、殺菌劑[4-6]用于水產(chǎn)品養(yǎng)殖中；后來還被廣泛用于治療和預(yù)防各類水生動(dòng)物的鰓霉病、水霉病和小瓜蟲病[7]等，尤其在治療水霉病上具有特殊療效；另外還被用于活魚運(yùn)輸、池塘?xí)簳r(shí)養(yǎng)殖過程中以及環(huán)境消毒等[8-11]。MG一般以草酸鹽或者氯化物的形式存在，吸附并富集在肌肉中，通過還原酶的作用很快代謝為溶脂性的隱色孔雀石綠(leucomalachite green, LMG)，其在肌肉組織中消除緩慢殘留時(shí)間較長(zhǎng)。

1992年，國(guó)外有關(guān)研究人員提出MG等物質(zhì)的官能團(tuán)三苯甲基可導(dǎo)致肝癌，被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(International Agency for Research on Cancer，IARC)列為了二類致癌物，經(jīng)研究表明長(zhǎng)期食用含有MG和LMG殘留的水產(chǎn)品，容易在體內(nèi)富集引起肝、心臟、腎、眼睛、血液、脾、皮膚等臟器和組織慢性中毒[12]。但由于缺乏有效的替代物以及利益驅(qū)使，MG的違禁使用仍然時(shí)有發(fā)生。在2005年6月，英國(guó)食品標(biāo)準(zhǔn)局在英國(guó)當(dāng)?shù)爻谐闄z水產(chǎn)品時(shí)檢測(cè)出MG；同年，重慶執(zhí)法人員在水產(chǎn)交易市場(chǎng)查獲含MG的甲魚600多只；在2016年，5月廣東省食藥監(jiān)局在惠州市酒店抽檢的散裝桂花魚中被檢測(cè)出LMG，6月香港食物環(huán)境衛(wèi)生署食物安全中心在白鱔樣本中驗(yàn)出含微量MG，同月山東省食品藥品監(jiān)督管理局在市區(qū)一超市所售鯽中檢出MG[13-17]。

如何能快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)孔雀石綠是當(dāng)前全面開展水產(chǎn)品食品安全監(jiān)管的內(nèi)容之一。目前，通常采用GB/T 19857—2005《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定》中推薦的方法進(jìn)行檢測(cè)，然而該方法專業(yè)性要求高，步驟繁瑣，且回收率不穩(wěn)定。本研究旨在優(yōu)化建立水產(chǎn)品中MG及LMG的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，通過采用固相萃取凈化，對(duì)前處理步驟進(jìn)行優(yōu)化研究，在保證精密度高、回收率穩(wěn)定的前提下優(yōu)化方法以達(dá)到快速、準(zhǔn)確的要求。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑、耗材及儀器

乙腈(CH3CN，色譜純)；甲醇(CH3OH，色譜純)；二氯甲烷(CH2Cl2，色譜純)；無水乙酸(C2H4O2，色譜純)；乙酸銨緩沖溶液(0.1 mol/L CH3COONH4，用冰乙酸調(diào)至pH=4.5)；乙酸銨緩沖溶液(5 mmol/L CH3COONH4，用冰乙酸調(diào)至pH=4.5)；乙酸銨-甲醇溶液(5%)；陽離子交換柱(Waters，MCX，60 mg/3 mL)；鹽酸羥胺溶液(HONH3Cl，0.25 g/mL)；對(duì)一甲苯磺酸溶液(p-CH3C6H4SO3H，1.0 mol/L)；中性氧化鋁柱(ANPEL 1 g/3 mL)；(超純水，電阻率為18.2 MΩ·cm，Milli-Q Gradient超純水，美國(guó)Millipore公司)。

超高效液相色譜(Acquity UPLC，美國(guó)Waters公司)；三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(AB Sciex Triple Quad 5500，美國(guó)AB公司，配有電噴霧ESI離子源)；離心機(jī)(Sigma 3K-30)；渦旋式混合器(IKA MS 3，德國(guó)IKA公司)；勻漿機(jī)(IKA T25)；pH計(jì)(Eutech pH510)；分析天平(Sartorius-SQP)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI公司)。

1.2 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

色譜柱為 Acquity UPLCTMBEH C18柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相 A為5 mmol/L乙酸銨-0.1%甲酸 (1 ∶1,V/V)，流動(dòng)相B為乙腈；流速為0.3 mL/min；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣量為1.0 μL；樣品室溫度為10 ℃；離子源為電噴霧離子源ESI；毛細(xì)管電壓為3.5 kV；脫溶劑氣流量為600 L/h；錐孔氣流量50 L/h。采用正離子掃描方式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)。液相色譜梯度洗脫條件見表1，質(zhì)譜定性定量離子對(duì)信息見表2。

表1 液相色譜梯度洗脫條件

表2 目標(biāo)化合物信息

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

優(yōu)化前實(shí)驗(yàn)過程參照GB/T 19857—2005《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定》進(jìn)行操作。

優(yōu)化后實(shí)驗(yàn)過程按照以下步驟進(jìn)行：稱取5.00 g樣品于50 mL離心管中，分別加入100 ng/mL內(nèi)標(biāo)溶液0.050 mL，0.100 mol/L 乙酸銨(甲酸調(diào)pH=4.50)2.00 mL，1.00 mol/L 對(duì)甲苯磺酸2.00 mL，250 mg/mL鹽酸羥胺1 mL，10.0 mL 乙腈，振蕩1 min后，再加入5.00 g酸性氧化鋁，振蕩混勻1 min，然后11 000 r/min離心5 min，取出上清液；殘?jiān)? mL乙腈重復(fù)溶解，振蕩混勻1 min后，10 000 r/min離心5 min，合并離心上清液至另一離心管中，在該試管中加5 mL水，使用10.0 mL二氯甲烷萃取2次，振蕩混勻1 min，再次10 000 r/min離心5 min，將有機(jī)相通過無水硫酸鈉除水合并后取出，30 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。

用2.00 mL 乙腈溶解殘?jiān)?次，溶解液轉(zhuǎn)移至中性氧化鋁柱(1 g/3 mL，先用乙腈潤(rùn)洗)，收集流出液，30 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用1.00 mL 5mmol/L乙酸銨(含0.1%甲酸)-甲醇(1 ∶1,V/V)溶液定容，0.22 μm濾膜過濾，供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)化前方法檢測(cè)結(jié)果

各取10份鰻鱺樣品進(jìn)行加標(biāo)(MG和LMG 各10 μg)，使用國(guó)標(biāo)GB/T 19857—2005《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定》中生鮮水產(chǎn)品和加工水產(chǎn)品的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)分析結(jié)果見表3、表4。

表3 使用鮮活水產(chǎn)品檢測(cè)方法測(cè)定鮮活鰻鱺樣品實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 使用加工水產(chǎn)品檢測(cè)方法測(cè)定鮮活鰻鱺樣品實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從結(jié)果可知，參照GB/T 19857—2005《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定》方法在提取后大部分檢測(cè)結(jié)果無法滿足回收率要求(70%～120%)，生鮮水產(chǎn)品前處理方法提取效率低，方法雖然步驟簡(jiǎn)單，可是回收率偏差較大。而對(duì)加工水產(chǎn)品的檢測(cè)方法，出現(xiàn)回收率普遍偏高的情況，但其回收率相對(duì)穩(wěn)定，因此將其作為本次優(yōu)化方法改進(jìn)的基礎(chǔ)。

2.2 方法優(yōu)化

2.2.1提取過程優(yōu)化

在GB/T 19857—2005《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定》方法中，需對(duì)樣品進(jìn)行勻漿，在勻漿結(jié)束后損失在刀頭上的樣品較多，即使在用乙腈清洗刀頭仍會(huì)造成樣品和目標(biāo)物質(zhì)的損失。因此本實(shí)驗(yàn)將國(guó)標(biāo)勻漿過程優(yōu)化為使用渦旋振蕩儀，在3 000 r/min下渦旋1 min，既避免了目標(biāo)物的損失，又提高樣品的提取速度，減少實(shí)驗(yàn)時(shí)間。

原國(guó)標(biāo)方法使用分液漏斗進(jìn)行液體分層，在振蕩后有部分樣品發(fā)生乳化，待分層過程等待時(shí)間長(zhǎng)，且乳化層含水量高，不利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)將分液漏斗改為用試管渦旋振蕩后離心，同時(shí)將下層有機(jī)相通過無水硫酸鈉除水后進(jìn)行收集，避免了有機(jī)相中乙腈攜帶的水溶液收集到收集瓶中，影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2.2實(shí)驗(yàn)試劑用量?jī)?yōu)化

對(duì)有機(jī)試劑加入量進(jìn)行了優(yōu)化(表5)，通過減少有機(jī)試劑的用量不僅可以降低實(shí)驗(yàn)成本，還可以有效控制實(shí)驗(yàn)風(fēng)險(xiǎn)。原國(guó)標(biāo)方法中乙腈與二氯甲烷的混合液比例接近2 ∶1 (V/V)會(huì)導(dǎo)致乙腈層與水相可能存在無法分離的情況，并且提取液中含有水相，后續(xù)濃縮過程無法完全蒸發(fā)干，將會(huì)延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)時(shí)間且存在暴沸的風(fēng)險(xiǎn)。

表5 實(shí)驗(yàn)試劑使用量?jī)?yōu)化

2.2.3 凈化方法優(yōu)化

LMG具有很好的親脂性，當(dāng)樣品基質(zhì)復(fù)雜時(shí)，將不利于樣品中目標(biāo)物質(zhì)的提取和凈化。比較了常用的凈化柱C18、HLB、MCX和氧化鋁柱的凈化效果，其中在氧化鋁柱的選擇上，由于酸性氧化鋁小柱在用乙腈活化后對(duì)脂肪的吸附能力變?nèi)酰鴫A性氧化鋁在凈化過程中對(duì)MG也有吸附作用，容易使目標(biāo)物造成損失，所以本次實(shí)驗(yàn)選用中性氧化鋁小柱。各類型回收率對(duì)比結(jié)果見圖1。從對(duì)比結(jié)果可知中性氧化鋁柱凈化效果最好。

2.3 優(yōu)化后方法檢測(cè)結(jié)果

采用添加標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的方法考察方法靈敏度。參考國(guó)標(biāo)GB/T 19857—2005中檢出限為0.500 μg/kg，在優(yōu)化方法實(shí)驗(yàn)條件下，以最低含量0.500 μg/kg進(jìn)行加標(biāo)，添加水平結(jié)果和離子色譜圖見圖2,方法優(yōu)化后的檢出限為0.500 μg/kg。通過觀察總離子流圖可知MG與LMG的峰形明顯，出峰時(shí)間準(zhǔn)確，響應(yīng)值強(qiáng)，靈敏度高。

用質(zhì)量濃度為0.500、1.00、2.00、5.00、10.0、20.0 ng/mL的工作液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)為0.999 9，可知曲線具有較好的線性相關(guān)性，線性回歸方程見表6。

圖1 各固相萃取柱凈化效果對(duì)比(n=3)Fig.1 Thepurified effects contrast of each SPE column

圖 2 0.500 μg·kg-1加標(biāo)樣品質(zhì)譜圖Fig.2 The spectrum of spiked 0.500 μg·kg-1 sample

采用優(yōu)化后的方法對(duì)大黃魚、鯉、鱸、黑鯛、草魚、鯽、鮑、鰻鱺、鋸緣青蟹和南美白對(duì)蝦進(jìn)行加標(biāo)比對(duì)，檢測(cè)結(jié)果見表7、表8。從檢測(cè)結(jié)果可以看出，優(yōu)化后的檢測(cè)方法MG回收率在83.4%～101%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=5)為3.44%～7.76%，LMG回收率在86.1%～101%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=5)為2.28%～8.74%，比優(yōu)化前的檢測(cè)方法有了較大程度的改善，符合實(shí)際工作的需求。

表6 MG和LMG的回歸方程以及相關(guān)系數(shù)

表7 水產(chǎn)品中MG回收率和精密度

表8 LMG回收率和精密度

3 結(jié)論

隨著儀器設(shè)備和檢測(cè)分析方法不斷更新，樣品前處理就顯得尤為重要。相比國(guó)標(biāo)，本研究做出了部分優(yōu)化改進(jìn)，有機(jī)溶劑和材料用量減少，檢測(cè)成本降低，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，MG和LMG加標(biāo)回收率在83.4%～101%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%。將優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)方法應(yīng)用于不同樣品的實(shí)際檢測(cè)，證明了該方法具有準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快速的優(yōu)點(diǎn)，滿足實(shí)際檢測(cè)工作需求。

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Research on determination method of malachite green in aquatic products

ZUO Shunyu, ZHANG Tianwen*

(Fujian Marine Environment and Fishery Resources Monitoring Center, Fuzhou 350003, China)

Establish a UPLC-ESI-MS/MS method for rapid determination of malachite green (MG) and its metabolite leucomalachite green (LMG) in aquatic fingerlings with quantification. UPLC and MS/MS analytical conditions were examined and optimized by a series of experiments. The compound was oxidated by buffered salt system and acid Al2O3, and extracted by acetonitrile and dichloromethane; the concentrated liquid was purified on a neutral Al2O3solid phase extraction cartridge. All eluates were collected and evaporated to dryness. The residue was re-dissolved in 5 mmol/L ammonium acetate with 0.1% formic acid and methanol (1 ∶1,V/V), sonficated and filtered prior to UPLC analysis by isotope-labeled internal standard method. Malachite green and leucomalachite green showed good linearity over the range of 0.5 to 20.0 ng/mL with correlation coefficient of 0.999 9,the detection limit was 0.5 ng/mL,the average recoveries ranged from 83.4% to 101% and from 86.1% to 101%, with relative standard deviations from 3.44% to 7.76% and from 2.28% to 8.74%. In addition, the method showed advantages of simplicity, accuracy, sensitivity and coverage. Compared to the existing national standard，it has made some improvements in pretreatment, reduced organic reagents, shortened the step and stabled recovery experiment, and could be applied to simultaneous determination of malachite green and metabolite leucomalachite green in aquatic products. [Chinese Fishery Quality and Standards, 2017, 7(1):35-40]

aquatic products; malachite green; leucomalachite green; ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry

ZHANG Tianwen, zhangtw1986@163.com

10.3969/j.issn.2095-1833.2017.01.006

2016-07-27；接收日期：2016-10-25

福建省社會(huì)發(fā)展引導(dǎo)性項(xiàng)目(2016Y0004)

左舜宇(1987-)，男，本科，助理工程師，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品質(zhì)量安全，342006355@qq.com 通信作者：張?zhí)炻劊こ處煟芯糠较驗(yàn)樗a(chǎn)品質(zhì)量安全，zhangtw1986@163.com

S945

A

2095-1833(2017)01-0035-06