一例雛番鴨感染鴨1型甲肝病毒的診斷

盧榮輝 劉小龍 肖隆華 胡小榕 祁保民

（福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院福州350002）

一例雛番鴨感染鴨1型甲肝病毒的診斷

盧榮輝＊劉小龍＊肖隆華 胡小榕 祁保民＊＊

（福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院福州350002）

2016年3月，廣東茂名某鴨場雛番鴨出現(xiàn)大量死亡，死亡雛番鴨多呈運動失調(diào)、角弓反張癥狀。解剖死亡雛鴨可見肝臟點狀出血、腎臟腫大出血。初步診斷疑似鴨病毒性肝炎。采集病死鴨肝臟、脾臟等組織，分別進行細菌分離鑒定及病毒RT-PCR檢測。結(jié)果顯示，送檢樣品能擴增出約321 bp大小的鴨甲型肝炎病毒特異性引物條帶，細菌分離為陰性。結(jié)合臨床剖檢癥狀和實驗室檢測結(jié)果，確診該群雛番鴨發(fā)病的病原為鴨1型甲肝病毒。

鴨1型甲肝病毒檢測診斷

鴨病毒性肝炎是由鴨甲型肝炎病毒（Duck hepatitis A virus，DHAV）引起的一種高致病性、高傳播性的病毒性疫病[1]。該病以發(fā)病快、死亡率高為特征，主要感染3周齡以內(nèi)的雛鴨，病死率高達80%以上，給養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。該病臨床上主要以角弓反張、肝臟腫大出血、腎臟腫大出血為主要病變。目前發(fā)現(xiàn)，DHAV有3種血清型，分別為鴨甲肝病毒1型（即為傳統(tǒng)的血清1型鴨肝炎病毒），鴨甲肝病毒2型（臺灣新型DHAV-2）和鴨甲肝病毒3型（韓國新型DHAV-3）[2]，我國鴨群主要流行鴨甲肝病毒1型和3型。而近年來DHAV-1出現(xiàn)新的致病型（或亞型）[3]，給臨床診斷及防控帶來較大困難，嚴重影響我國水禽業(yè)的健康發(fā)展。2016年3月，廣東茂名某鴨場雛番鴨發(fā)病，診斷為鴨1型甲肝病毒感染，現(xiàn)報道如下。

1 發(fā)病情況

2016年3月，廣東省茂名市某鴨場飼養(yǎng)的約5 000羽20日齡雛番鴨突然發(fā)病，患鴨精神沉郁、采食量下降、眼半閉呈昏睡狀態(tài)，死亡雛鴨呈角弓反張樣，有的突然抽搐死亡，第2 d死亡率即達到50%。

2 剖檢病變

剖檢死亡雛番鴨，可見肝臟腫大、質(zhì)地脆弱、有典型的點狀出血；腎臟腫大、出血（見圖1-圖2）。

3 材料與方法

圖1 肝臟腫大出血

圖2 腎臟腫大出血

3.1 病料采集自病死雛鴨中無菌采集肝臟（一部分用于細菌分離）、脾臟，按照常規(guī)方法勻漿，反復(fù)凍融3次，在4℃條件下12 000 r/min離心5 min，無菌吸取上清液，于0.22 μm孔徑的濾膜過濾，于-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

3.2 細菌分離與鑒定在超凈工作臺內(nèi)取病死雛番鴨的肝臟，劃線于血瓊脂平板上，置37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。

3.3 病毒的檢測

3.3.1 主要試劑RNA提取試劑盒購自北京全氏金生物技術(shù)有限公司；AMV反轉(zhuǎn)錄酶、DL 2000 DNA Marker等試劑均購自寶生物工程（大連）有限公司；DNA提取試劑盒，dNTP Mix、Fast Pfu fly DNA聚合酶購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

3.3.2 引物設(shè)計根據(jù)GenBank提供的H9亞型禽流感病毒、鴨呼腸孤病毒、鵝細小病毒和鴨甲肝病毒序列，分別設(shè)計特異性引物，由生工（上海）生物工程有限公司合成。

3.3.3 病毒的PCR檢測取常規(guī)處理后病料的上清液，按EasyPure Viral DNA/RNA Kit SuperMix（購自全式金生物技術(shù)有限公司）的說明書提取組織的DNA和RNA進行PCR。PCR反應(yīng)體系為20 μL：2× EasyScript RT-PCR One-Step Reaction Mix 10 μL，ddH2O 7 μL，One-Step Enzyme Mix 0.4 μL，上下游引物各0.3 μL，模板2 μL。反應(yīng)程序如下：45℃反轉(zhuǎn)錄30 min，95℃預(yù)變性5 min，按94℃30 s、54℃30 s、72℃45 s進行34個循環(huán)，最后72℃延伸5 min結(jié)束反應(yīng)，取5 μL PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測擴增結(jié)果，觀察PCR結(jié)果。

4 結(jié)果

1）經(jīng)37℃恒溫箱培養(yǎng)24 h后，血瓊脂平板上未見菌落生長，可排除細菌感染。

2）分別經(jīng)H9亞型禽流感病毒[4]、鴨呼腸孤病毒[5]、鵝細小病毒[6]、鴨甲肝病毒（待檢樣品）[7]特異性引物PCR擴增后，只有鴨甲肝病毒鴨為陽性，且擴增的目的大小與預(yù)測的相符，為321 bp（見圖3）。

根據(jù)發(fā)病情況、臨床診斷、剖檢病變及實驗室檢測結(jié)果，可確診該病例為感染鴨1型甲肝病毒。

5 討論

鴨病毒性肝炎主要危害3周齡內(nèi)的雛鴨，該病傳播速度快，雛鴨一旦發(fā)病，死亡率非常高。該病最典型的臨床特征是角弓反張、肝臟出血。對于該病的診斷可根據(jù)其發(fā)病特點、臨床特征和剖檢病理變化作出初步診斷；采集患鴨肝臟、脾臟等組織，送實驗室經(jīng)病毒分離鑒定和病原學(xué)檢測可以作出明確診斷。目前，我國部分地區(qū)報道鴨甲肝病毒已發(fā)生變異[8]，采用傳統(tǒng)的防治方法效果不顯著。而現(xiàn)階段我國對于該病的防治主要使用弱毒苗和精制高免卵黃抗體，也有的在種鴨上使用滅活苗，但對預(yù)防治療鴨病毒性肝炎的效果上仍不盡人意，因此，關(guān)于鴨病毒性肝炎的防控仍需加強。

圖3 樣品的PCR檢測結(jié)果（1：DL2000DNA Marker；2：H9亞型禽流感病毒；3：鴨呼腸孤病毒；4：鵝細小病毒；5：鴨1型甲肝病毒（待檢樣品）；6：陰性對照；7：陽性對照）

[1]Liu G Q,Wang F,Ni Z,et al.Genetic diversity of the vp1 gene of duck hepatitis virus type 1(DHV-1)isolates from southeast china is related to isolate attenuation[J].Virus Research,2008,137(1):137-141.

[2]KIM M C,KWON Y K,JOH S J,et al.Recent Korenisolates of duck hepatitis virus revealed the presence of a new geno2 and serotype when compared to duck hepatitis virus type 1 type strain[J].Arch Virol,2007,152:2059-2072.

[3]傅光華,黃瑜,傅秋玲,等.致胰腺泛黃鴨1型甲肝病毒全基因組分子特征[J].微生物學(xué)報,2014,54(9):1082-1089.

[4]萬春和,林甦,施少華,等.H9亞型鴨源禽流感病毒SYBR GreenⅠ實時熒光定量RT-PCR快速檢測方法的建立[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報,2010(4):387-391.

[5]劉偉,林貴富,謝海軍,等.一例櫻桃谷種鴨坦布蘇病毒病與呼腸孤病毒病混合感染的診斷[J].福建畜牧獸醫(yī),2014,36 (4):70-72.

[6]萬春和,潘異哲,陳紅梅,等.區(qū)別鵝細小病毒和番鴨細小病毒的PCR-RFLP方法的建立[J].中國畜牧獸醫(yī),2014(9): 56-59.

[7]傅光華,陳紅梅,黃瑜,等.雛番鴨胰腺型鴨1型甲肝病毒分離鑒定及VP1基因分析[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報,2012(9):945-950.

[8]傅秋玲,陳珍,黃瑜,等.鴨1型甲肝病毒亞型的鑒定[J].中國獸醫(yī)雜志,2015(7):36-38.

B

1003-4331（2017）01-0039-02

?盧榮輝（1991-），男，碩士研究生，研究方向：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)，E-mail：luronghui163@qq.com。?劉小龍（1989-），男，碩士研究生，主要從事獸醫(yī)傳染病防治研究，E-mail：798956657@qq.com。?表示對本文貢獻相同。

＊＊通信作者：祁保民（1964-），男，教授，研究方向：主要從事病理學(xué)研究。