初期稻葉瘟病害的葉綠素熒光光譜分析

周麗娜 程樹朝 于海業 張 蕾

(1.吉林大學工程仿生教育部重點實驗室， 長春 130025； 2.吉林農業大學工程技術學院， 長春 130118)

初期稻葉瘟病害的葉綠素熒光光譜分析

周麗娜1,2程樹朝2于海業1張 蕾1

(1.吉林大學工程仿生教育部重點實驗室， 長春 130025； 2.吉林農業大學工程技術學院， 長春 130118)

為了實現稻葉瘟病害的早期、快速檢測，對稻葉瘟病害初期水稻葉片的葉綠素熒光光譜變化進行分析，建立光譜診斷模型。將稻梨孢接種于水稻葉片，分別在接種前期(0 h)、潛育期(48 h)和病斑初現期(7 d)3個時段采集水稻葉片的葉綠素熒光光譜。分析3個時段光譜變化特征，并利用Savitzky-Golay平滑(SG)和一階導數變換(FDT)對光譜進行預處理。利用高斯擬合法(GFF)分別對原始光譜、SG平滑光譜和SG-FDT光譜提取各波段光譜特征向量。將試驗樣本劃分為建模樣本和檢驗樣本，以病害初期的3個時段作為稻葉瘟病害的等級指標，分別采用全波段光譜特征向量和組合波段光譜特征向量，對3種預處理光譜利用建模樣本建立稻葉瘟病害的支持向量分類(SVC)模型，對比4個經典核函數，并利用檢驗樣本對模型進行檢驗。結果表明，藍綠光區域、紅光與遠紅光區域熒光隨初期稻葉瘟病害程度的變化而變化，SG-FDT光譜的GFF-SVC(PLOY)模型對3個時段病害的分類準確率最高，且原始光譜、SG光譜、SG-FDT光譜的不同波峰位及其組合對稻葉瘟病害的識別效果不同。

初期稻葉瘟； 高斯擬合； 支持向量分類機； 葉綠素熒光光譜

引言

稻瘟病是世界真菌性病害，為防止其對糧食生產造成重大影響，稻瘟病害的早期、快速檢測一直被人們關注。目前，稻瘟病檢測方法主要包括兩大類：一類是包括PCR法[1]、DNA陣列法[2]等基于分子生物學的檢測方法，這些技術雖然檢測結果較精確，但通常是在實驗室內進行，樣本制作復雜，很難滿足實時應用的需求；另一類是包括時間序列分析[3]、氣象信息分析[4]、菌源信息分析[5]以及光譜分析等的無損檢測。雖然氣象信息、菌源信息對稻瘟病害的發生和流行具有重要影響，時間序列分析也可依據往年病害情況對稻瘟病害提出預警，但是對于作物生產者而言，最關心的卻是作物本身是否已經被病害威脅以及病害可能發生的程度，因此，直接采用各種手段來觀測植物的生長狀態仍然是評價植物病害最主要的方法。光譜分析法是通過對植物受到病害脅迫時表現出的光譜特異性差異進行分析來實現病害的檢測分級，常見的有高光譜成像技術和葉綠素熒光光譜法。楊燕[6]利用高光譜成像技術實現稻瘟病害識別，這是一種利用植物受到病害脅迫時表現出對不同波段光譜反射特征的差異來研究植物生長狀態的方法，而植物的葉綠素熒光是植物在吸收光能過程中，除光化學反應及維持機體對熱的需求外的非光化學能量耗散部分[7-8]。當植物葉片受到病害威脅時，葉綠素含量及其光合能力會發生改變，能量分配發生改變，具有葉綠素無損“探針”之稱的葉綠素熒光光譜也會隨之改變[9]。葉綠素熒光作為一種能量的再發射過程，雖然僅占吸收總能量的2%～5%，卻足以成為植物在環境中生長狀態診斷的依據[10-11]。

近年來，隨著葉綠素熒光技術的不斷成熟，光譜分析技術的不斷完善，葉綠素熒光光譜在植物病害分析方面的應用備受關注。張永江等[12]利用Fraunhofer線原理從冠層反射光譜中成功提取日光誘導熒光信息，可反映田間小麥條銹病的發病情況；黃文江[13]發現隨著小麥條銹病的加重，685 nm處的熒光增強，740 nm處反而下降；楊昊諭等[14]利用葉綠素熒光光譜區分了黃瓜霜霉病和蚜蟲害。對于稻葉瘟而言，判斷病害是否已經發生并進行早期防治是關鍵，因此，本文旨在利用葉綠素熒光光譜分析初期稻葉瘟病害的發展狀態，為初期稻葉瘟病害的識別與診斷提供一種方法。

1 材料與方法

試驗于2015年7月在吉林農業大學校園內完成，采用盆栽形式，選擇對稻瘟病抗性極低的“蒙古稻”作為試驗對象，盆內套袋種植，維持盆內水面高于土壤表面1 cm以上，每盆3穴，共種植20盆。

1.1 稻梨孢接種方法

將稻梨孢進行擴大培養后利用米糠培養基產孢，然后用蒸餾水沖洗得到孢子懸浮液，用噴壺噴灑于處于吐穗揚花期的水稻葉片，并對水稻及花盆進行黑色塑料袋套袋處理，將其置于加濕器旁，溫度20～29℃，使孢子完成侵染過程。12 h后退去塑料袋，其它條件不變。

1.2 葉綠素熒光光譜采集

首先對60片水稻葉片旗葉進行標號，因菌絲生長溫度范圍內，稻葉瘟潛育期為4～7 d，所以分別在接種前期(0 h)、潛育期(接種后48 h)和病斑初現期(接種后7 d)3個時段采集所標記葉片的葉綠素熒光光譜，并最終保留接種7 d后病斑可見的39片葉片3個時段光譜數據作為試驗樣本。

葉綠素熒光光譜由中國科學院長春光學精密機械與物理研究所產MBL-III-473 nm型固體激光器激發產生，激光強度7.5 mW[15]，熒光探測器貼近且垂直于葉片表面，并由荷蘭產AvaSpec-2048-USB2型光纖光譜儀接收光譜。

2 結果與分析

2.1 三時段葉綠素熒光光譜變化分析

葉綠素熒光光譜在藍綠光區(502～530 nm)和紅光與遠紅光區(632～830 nm)受葉片的生理狀況影響顯著[10，16]，因此以502～830 nm波段作為研究對象，將每時段試驗樣本39片葉片的葉綠素熒光光譜取平均值，得3個時段光譜平均信息(圖1)。

圖1 3個時段光譜平均信息Fig.1 Average chlorophyll fluorescence spectral information at three stages

當稻梨孢侵入寄主水稻葉片的表皮細胞和葉肉細胞時，附著胞形成的侵染栓會穿透水稻葉片的角質以及表皮細胞壁，填充在細胞間隙中，在造成細胞結構發生改變的同時，葉綠素被破壞[6]，葉片對光合作用的能量吸收減弱，從而導致電子受到激發后能夠到達反應中心的數量減少，光系統Ⅰ(PSⅠ)和光系統Ⅱ(PSⅡ)的匹配程度減弱，進而引起來源于與PSⅠ和PSⅡ有關葉綠素的紅光區與遠紅光區的熒光強度增加，并且遠紅光區熒光強度的增加速率不及紅光區[17]。藍綠光區熒光強度在48 h增加到最大，而病斑初現期卻下降到低于接種前的水平，藍綠光區熒光峰的決定色素尚未確定，但一般被認為是屬于維生素K或一種類似的苯醌，這種物質不直接與葉綠素和光合作用相關聯，但可反映短波長區色素對葉綠素能量傳遞的有效程度[18]，在稻梨孢侵染寄主水稻葉片初期，葉綠素遭破壞，其接受藍綠光區色素傳遞能量的能力減弱，從而引起藍綠光區的熒光強度增加[17]。但隨著侵染的加劇，生理代謝的加強，在微生物分泌的阿魏酸酯酶作用下，共價結合于細胞壁表面的阿魏酸被游離出來，植物抗氧化能力減弱，能量傳遞效率雖然繼續減弱，但藍綠光區色素遭到破壞，這可能是導致藍綠光區熒光強度在病斑初現期降低的主要原因[19]。

2.2 葉綠素熒光光譜的預處理及降維處理

由于每片葉片的葉綠素熒光光譜是由575個波長的熒光值組成的曲線，為有效獲取光譜信息，對39片葉片在3個時段的原始光譜進行SG平滑和FDT處理，并對原始光譜、SG平滑光譜和SG-FDT光譜進行高斯擬合，提取各個高斯擬合峰的峰高、峰寬、峰面積作為特征參數來構建新的信息矩陣，實現光譜曲線向量空間的簡化[20]。SG平滑光譜和SG-FDT光譜及其高斯擬合見圖2和圖3，原始光譜的高斯擬合形式與SG光譜一致。因此，原始光譜和SG平滑光譜被降維為3個波峰位的9個特征向量，SG-FDT光譜被降維為6個波峰位的18個特征向量。

圖2 SG平滑光譜及其高斯擬合Fig.2 SG pretreatment spectrum and its Gaussian function fitting

圖3 SG-FDT光譜及其高斯擬合Fig.3 SG-FDT pretreatment spectrum and its Gaussian function fitting

2.3 葉綠素熒光光譜模型分析

2.3.1 全波段光譜模型分析

將試驗樣本中25片葉片的75條光譜信息作為建模樣本，其余14片葉片的42條光譜信息作為檢驗樣本。利用建模樣本的原始光譜、SG平滑光譜、SG-FDT光譜的全波段高斯擬合特征參數作為模型輸入，以稻梨孢侵染寄主水稻3個時段對應的病害等級作為模型輸出，建立初期稻葉瘟病害的葉綠素熒光光譜3個時段SVC模型。在Matlab中利用經典核函數Linear、PLOY、RBF和Sigmoid，采用一類對余類的方法進行支持向量分類，采用5-Fold交叉驗證，以建模樣本自檢驗的分類準確率最大為目標，運用網格搜索法確定懲罰參數C和其它核函數參數d、γ和α。模型參數及其在建模樣本和檢驗樣本中的分類情況見表1。

2.3.2 組合波峰位模型分析

由表1可以看出，原始光譜、SG光譜、SG-FDT光譜均以PLOY核函數SVC模型在檢驗樣本的識別準確率最高，SG光譜的SVC(RBF)模型在檢驗樣本與SVC(PLOY)模型有相同的識別效果，且光譜經SG平滑處理后，識別效果反而不及原始光譜。為進一步尋求每個波峰位與初期稻葉瘟病害之間的關系，建立基于原始光譜、SG光譜、SG-FDT光譜的GFF-SVC(PLOY)各波峰位分析模型。結果(表2)表明，各波峰位對初期稻葉瘟病害的識別能力不同，原始光譜、SG光譜的峰2、峰3對接種前期(未侵染期)的識別率明顯高于潛育期和病斑初現期(侵染完成)，SG-FDT光譜的峰4、峰5、峰6對接種前期的識別效果也較好，特別是在檢驗樣本對各侵染階段的總識別效率優于原始光譜和SG光譜的各個波段。SG-FDT光譜峰1、峰2、峰3對稻葉瘟病害3個時段的總識別正確率在建模樣本和檢驗樣本均不足60%，其中以峰1最差。

為進一步挖掘初期稻葉瘟病害與葉綠素熒光光譜之間的關系，對SG-FDT光譜分別采用峰4、峰5、峰6自結合及峰1、峰2、峰3分別與峰4+峰5+峰6相結合的形式，分析結果(表3)表明，各波峰位的組合對稻葉瘟病害的識別效率不同，峰3+峰4+峰5+峰6與峰2+峰3+峰4+峰5+峰6在建模樣本和檢驗樣本的識別正確率均在90%以上，在檢驗樣本的表現甚至優于全波段組合，但這并不能說明峰1對稻葉瘟病害的識別沒有意義，峰1的加入改變了峰4+峰5+峰6對潛育時期和病斑初現期的識別效率，這可能說明不同波峰位對稻葉瘟病害不同等級判別的貢獻不同。另外，峰4+峰5對接種前期的正確判別為22個，其它波峰位與之組合僅對另外2個時段的判別產生影響，這在證明不同波峰位對稻葉瘟病害判別貢獻不同的同時，可能也說明了峰4+峰5可以直接作為健康水稻葉片的判別依據。

表1 全波段光譜SVC模型分析結果Tab.1 Analysis results of SVC models based on all spectrum bands

表2 各波峰位GFF-SVC(PLOY)模型分析結果Tab.2 Analysis results of GFF-SVC (PLOY) models based on each band

表3 SG-FDT組合波峰位光譜GFF-SVR(PLOY)模型分析結果Tab.3 Analysis results of SVR (PLOY) models based on combination of SG-FDT bands

3 結束語

采集接種前期、潛育期、病斑初現期3個時段稻葉瘟病害的水稻葉片葉綠素熒光光譜，分析光譜變化特征，利用GFF法對原始光譜、SG光譜和SG-FDT光譜進行降維處理，以高斯特征參數作為模型輸入，3個時段病害等級作為模型輸出，建立初期稻葉瘟病害的SVC模型。結果表明，藍綠光區、紅光與遠紅光區均對初期稻葉瘟病害存在不同程度的響應，在全波段光譜的3個時段識別模型中，以SG-FDT光譜的PLOY核函數SVC模型分類準確率最高。分別利用原始光譜、SG光譜、SG-FDT光譜的不同波峰位及波峰位特征參數組合建立3個時段識別模型，發現不同波峰位及其組合對稻葉瘟病害的識別效果不同。對初期稻葉瘟病害的葉綠素熒光光譜變化分析及模型分析結果可為初期稻葉瘟病害的識別提供依據。

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Chlorophyll Fluorescence Spectra Analysis of Early Rice Blast

ZHOU Li’na1,2CHENG Shuchao2YU Haiye1ZHANG Lei1

(1.KeyLaboratoryofBionicEngineering,MinistryofEducation,JilinUniversity,Changchun130025,China2.CollegeofEngineeringandTechnology,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China)

In order to detect rice blast rapidly and accurately, chlorophyll fluorescence spectra of early rice blast were analyzed on leaf level, and the identification models of rice blast were established. Rice leaves were inoculated with rice pear spore first, and chlorophyll fluorescence spectra were achieved respectively at three stages of inoculation before (0 h), gley period (48 h) and disease spots early appearance (7 d). Meanwhile, variation characteristics of chlorophyll fluorescence spectra at three stages were analyzed, Savitzky-Golay (SG) and the first derivative transform (FDT) were applied to reduce the noises and obtain the characteristics of chlorophyll fluorescence spectra. Then the method of Gaussian function fitting (GFF) was used to achieve the dimension reduction on spectral information, and multiple feature vectors of each band were extracted. Furthermore, the spectral data were divided into calibration set and validation set. Taking three stages of early disease as rice blast levels, and comparing four classic kernel function，support vector classification (SVC) models were established respectively with full bands feature vectors and composite bands feature vectors based on calibration set, and the models were tested with validation set. The results indicated that chlorophyll fluorescence spectra of blue green region, red and far-red region were changed with the change of severity of early disease, GFF-SVC model with SG-FDT pretreatment for three stages disease had the highest classification accuracy rate, and the recognition results of different bands combination of primary spectrum, SG spectrum, SG-FDT spectrum were different for rice blast.

early rice blast; Gaussian function fitting; support vector classification；chlorophyll fluorescence spectrum

10.6041/j.issn.1000-1298.2017.02.027

2016-09-02

2016-12-02

國家高技術研究發展計劃(863計劃)項目(2013AA103005-04)

周麗娜(1981—)，女，博士生，吉林農業大學講師，主要從事農業生物環境與能源工程研究，E-mail： zhoulina976430@163.com

于海業(1963—)，男，教授，博士生導師，主要從事農業生物環境與能源工程研究，E-mail： haiye@jlu.edu.cn

S123； S435.111.4+1

A

1000-1298(2017)02-0203-05