準噶爾山楂葉抗氧化及抑制α-葡萄糖苷酶活性

劉偉，任艷利，讓鳳菊，何曉燕，歐陽艷

（伊犁師范學院新疆維吾爾自治區普通高校天然產物化學與應用重點實驗室，新疆伊寧835000）

準噶爾山楂葉抗氧化及抑制α-葡萄糖苷酶活性

劉偉，任艷利，讓鳳菊，何曉燕，歐陽艷*

（伊犁師范學院新疆維吾爾自治區普通高校天然產物化學與應用重點實驗室，新疆伊寧835000）

采用超聲提取不同月份準噶爾山楂葉，系統溶劑萃取其醇提物得到環己烷部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位，分別測定其總黃酮含量，通過清除DPPH自由基、鐵離子還原能力和α-葡萄糖苷酶抑制活性評價準噶爾山楂葉不同提取物的體外抗氧化活性及降血糖活性。結果表明，準噶爾山楂葉各提取物均有不同程度的抗氧化和α-葡萄糖苷酶抑制活性，其中以總黃酮含量最高的乙酸乙酯部位（28.87mg/g）效果最佳，其對DPPH清除活性（IC50=0.026mg/mL）遠強于陽性對照BHA（IC50=0.996mg/mL），α-葡萄糖苷酶抑制活性（IC50=191.71 g/mL）高于陽性對照阿卡波糖（IC50= 1 044.32 g/mL）。各提取物體外抗氧化和降血糖活性與其總黃酮含量呈正相關性，說明黃酮類化合物為影響其活性的主要因素。

準噶爾山楂葉；總黃酮；抗氧化；抑制-葡萄糖苷酶活性

糖尿病（Diabetes mellitus）是一種以胰島素分泌絕對不足（I型）或相對不足（II型，胰島素抵抗）而引起的以高血糖為主，伴有眼、腎、心臟、血管、神經系統的慢性損害等并發癥為特征的內分泌代謝性疾病[1]。近30年來，我國糖尿病發病率劇增，由1980年的1.0%到2010年的11.6%，患病人數超過1.5億[2]。Yang等研究表明我國糖尿病早期表現出更嚴重的胰島β細胞功能障礙，治療的關鍵是維持胰島β細胞功能和控制餐后血糖濃度[3]。α-葡萄糖苷酶抑制劑可以競爭性抑制α-葡萄糖苷酶的活性，從而減緩淀粉和蔗糖等向葡萄糖的轉化，進而控制餐后血糖的水平[4]。此外，氧化應激與糖尿病及其并發癥存在密切相關，應用抗氧化治療可逆轉氧化應激對組織的損傷，從而阻止或延緩糖尿病及其并發癥的發生、發展[5]。因此，開發具有清除自由基和控制餐后血糖的功能保健食品對我國II型糖尿病的防治具有重要的意義。

山楂（Crataegus pinnatifida）為薔薇科山楂屬落葉喬木，其果與葉皆可入藥[6-7]，具有悠久的藥用和食用歷史。葉希韻等[8]研究表明，山楂葉黃酮對防治小鼠糖尿病及其并發癥有積極的作用。準噶爾山楂（Crataegus songorica）生于河谷或峽谷灌木叢中，分布于俄羅斯、伊朗等地，在中國僅分布于新疆伊犁地區[9]。目前，對準噶爾山楂葉提取物抑制α-葡萄糖苷酶活性的研究鮮有報道。本文采用體外模型對準噶爾山楂葉不同提取物進行抗氧化和降血糖活性初篩，以期發現基于抑制α-葡萄糖苷酶活性的降血糖活性成分，初步探索提取物總黃酮含量與活性之間的相關性，為準噶爾山楂資源的利用與開發提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

準噶爾山楂葉分別于7、8、9、10月采于新疆伊犁霍城縣大西溝，經伊犁師范學院資源與生態研究所趙玉副教授鑒定為薔薇科準噶爾山楂葉，洗凈，晾干后60℃烘干至恒重，粉碎過60目篩備用，樹葉標本存放于伊犁師范學院資源與生態研究所。

石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、無水乙醇、氯化鋁：購自國藥集團化學試劑有限公司；DPPH：長城生物化學工程有限公司；蘆丁標準品：購自中國食品藥品檢定研究院（批號100080-201408）；α-葡萄糖苷酶（Yeast，EC 3.2.1.20）、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷、阿卡波糖：購自阿拉丁試劑公司（上海）。

SpectraMax M2多功能讀板機：Molecular Devices，USA；UV-2550紫外可見分光光度計：日本島津分析儀器廠；XH-2008D智能溫控低溫超聲波催化合成儀：北京祥鵠科技發展有限公司；DD-5M型低速離心機：湘儀離心機有限公司；FA2104電子天平：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；BAO-150AG型電熱恒溫干燥箱：上海亞榮生化儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 準噶爾山楂葉提取物制備

[10]的方法，精密稱取6.000 0 g備用準噶爾山楂葉（采于7、8、9、10月），分別裝入可密閉的三頸燒瓶內，按料液比1∶30（g/mL）加入60%乙醇溶液，在300W功率下，保持70℃超聲提取30min，提取2次，合并提取液，4 000 r/min離心10min，取上清液減壓濃縮干燥后得7月提取物（JulE）1.021 5 g、8月提取物（Aug E）0.947 2 g、9月提取物（Sep E）1.154 6 g、10月提取物（OctE）0.830 4 g。

根據測定結果，選取總黃酮含量最高的山楂葉進行分級萃取。精密稱取6.000 0 g樣品按照上述方法超聲提取，合并離心后上清液減壓濃縮至無醇味，加水定容至合適體積，依次用等體積的環己烷、乙酸乙酯、正丁醇分別萃取3次，萃取余下的水溶液為水部分，回收溶劑后得環己烷部分（Cy E）0.073 6 g、乙酸乙酯部分（EA E）0.238 5 g、正丁醇部分（Bu E）0.322 1 g和水部分（W tE）0.232 7 g。

1.2.2 總黃酮含量測定

為避免含鄰二酚類化合物對總黃酮含量測定的干擾，參考文獻[11]的方法，采用AlCl3法分別測定準噶爾山楂葉不同提取物總黃酮含量。精密移取備用蘆丁標準溶液0.0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL，分別加入盛有5.0mL 60%乙醇溶液的25mL相同規格的容量瓶中，再加2.0mL 0.1mol/L氯化鋁溶液和1.0mL醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH=5.5），60%乙醇溶液定容至刻度，搖勻，放置15min，于417 nm處測定吸光值。以蘆丁標準溶液質量濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制標準曲線得y=27.462 x+0.000 6，R2=0.995 9，結果表明在濃度0.02mg/mL至0.06mg/mL范圍內兩變量呈現良好的線性關系。準確吸取1.0mL配制的提取液，分別按照上述方法測定吸光度，并根據公式（1）計算總黃酮含量。

式中：Y為總黃酮含量，mg/g；k待測液與測試液體積之比；c為標準曲線法計算所得濃度，mg/mL；V為測試液定容的體積，mL；m為稱取準噶爾山楂葉質量，g。

1.2.3 清除DPPH自由基試驗

參照文獻方法[12]并稍加修改：配制準噶爾山楂葉提取物、萃取液、BHA待測液，逐級稀釋使用。將各供試樣品溶液分別移取20μL于10mL比色管中，另取0.6mmol/L的DPPH溶液1.0mL加入各比色管中，用無水乙醇定容至10mL，搖勻，在避光條件下靜置30 min后，于517 nm波長處測定吸光值，考慮山楂葉提取物自身吸光值的影響，配制未加DPPH溶液的對照組扣除其吸光值，每組樣品進行3次平行試驗。DPPH·清除率按公式（2）計算：

式中：A0為DPPH溶液定容后的吸光度；A1為不同濃度的樣品溶液添加DPPH溶液定容后的吸光度；A2為不同濃度的樣品溶液定容后的吸光度。

1.2.4 還原能力測定

參照文獻方法[12]并稍加修改：分別量取系列濃度（0.05、0.1、0.15、0.2、0.25mg/mL）的各提取物、萃取液、BHA 2.5mL于10mL比色皿中，分別加入2.5mL磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH=6.6）和2.5 mL鐵氰化鉀（1%）。將混合物放置到50℃的水浴中保溫20min后，加2.5mL三氯乙酸，3 000 r/min離心10min，取2.5mL上清液分別加入2.0mL蒸餾水和0.5 mL氯化鐵溶液（0.1%），以乙醇溶液做空白試驗，測定混合物在700 nm處的吸光度，每組樣品進行3次平行試驗。

1.2.5 α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定

參照文獻[13]的方法稍作修改，96孔板中分別加入50μL不同濃度的溶于甲醇和0.1mol/L磷酸鹽緩沖液（pH=6.8，精確稱取8.66 g K2HPO4和6.85 g KH2PO4溶解于超純水中，并定容至1 L）的被測試樣品，50μL磷酸鹽緩沖液和40μL 0.25 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液，每個樣品設3個復孔，37℃恒溫孵育10 min后加入40μL 5mmol/L pNPG溶液，立即于405 nm波長下測定其OD值（S0min），反應5min后相同波長條件下測定其OD值（S5min），加入相同體積的甲醇磷酸鹽緩沖液作為空白對照，阿卡波糖為陽性對照。按照公式（3）計算抑制率：

式中：C0為加入緩沖液代替樣品的空白對照0 min時的OD值；C5空白對照5min時的OD值；S0為加入測試樣品0min時的OD值；S5為加入測試樣品5min時的OD值。

1.2.6 數據分析

采用Excel2003進行數據分析并計算抑制率、清除率，根據抑制率和濃度采用FORECAST函數計算IC50。

2 結果與分析

2.1 準噶爾山楂葉不同提取物總黃酮含量測定結果準噶爾山楂葉不同提取物總黃酮含量見圖1。

圖1 準噶爾山楂葉不同提取物總黃酮含量Fig.1 Total flavonoids of different extracts of Crataegus songorica leaves

藥理學研究表明，山楂葉對心腦血管和消化系統具有重要的藥用價值，其主要活性成分為黃酮類化合物。因此試驗對準噶爾山楂葉不同提取物中總黃酮含量進行測定。由圖1可知，7月到10月期間采摘準噶爾山楂葉所含總黃酮沒有顯著性差異，其中8月份采摘樣品總黃酮含量最高，為14.97mg/g。有文獻[14]報道光照能夠強烈的影響植物的初生代謝、植物細胞生長及次生代謝產物積累。推測原因新疆伊犁地區8月日照時間最長，紫外線輻射強度大，影響了準噶爾山楂正常的生理活動，促使其局部組織或器官合成較多的黃酮類化合物，以利于自身的保護。對8月采集樣品進行分級萃取，所得樣品中EAE總黃酮含量最高，為28.87mg/g，Bu E總黃酮含量次之，提示準噶爾山楂葉萃取物中富含中等極性黃酮類化合物。Cy E和WtE總黃酮含量較少，各萃取相總黃酮含量存在顯著性差異。

2.2 準噶爾山楂葉不同提取物清除DPPH自由基活性

準噶爾山楂葉不同提取物清除DPPH自由基活性見圖2。

在多種快速評估抗氧化活性的方法中，清除DPPH自由基模型與其它方法相比更為廣泛使用。由圖2可知，在測試質量濃度內，各提取物活性呈現出濃度依賴性，且清除DPPH自由基活性差異顯著。其活性順序為EA E>Bu E>Aug E>Jul E>Oct E>Sep E>BHA> Cy E>WtE。其中EA E（IC50=0.026mg/mL）和Bu E（IC50=0.084mg/mL）對DPPH自由基清除活性較強，遠高于陽性對照BHA（IC50=0.996mg/mL），而Cy E和WtE清除能力相對較弱。結合圖1可知，總黃酮含量較高的EA E和Bu E比其它提取物清除DPPH自由基的能力強，不同月份提取物的清除能力與其總黃酮含量存在一定的正相關性。

2.3 準噶爾山楂葉不同提取物還原能力

準噶爾山楂葉不同提取物還原能力見圖3。

大多數化合物的還原能力可以看作是其潛在抗氧化活性的重要指標。由圖3可知，在測定質量濃度范圍內，除Cy E和WtE外，其余各提取物還原能力均強于對照BHA。其中EA E和Bu E表現出較強的還原能力，顯著高于其它提取物。不同月份提取物表現出與BHA相近的還原能力，且還原能力隨著濃度的增大而不斷增大，量效關系較為明顯。

2.4 準噶爾山楂葉不同提取物對α-葡萄糖苷酶抑制活性

準噶爾山楂葉不同提取物對α-葡萄糖苷酶抑制活性見表1。

圖2 準噶爾山楂葉不同提取物清除DPPH自由基活性Fig.2 DPPH scavenging activity of different extracts of Crataegus songorica leaves

圖3 準噶爾山楂葉不同提取物還原能力Fig.3 Reducing power of different extracts of Crataegus songorica leaves

表1 準噶爾山楂葉不同提取物對α-葡萄糖苷酶抑制活性Table1 α-glucosidase inhibitory activity of different extracts of Crataegus songorica leaves

由表1可知，在同一濃度下，準噶爾山楂葉不同月份提取物對α-葡萄糖苷酶抑制活性順序為：Aug E> Sep E>Jul E>Oct E，其中Aug E（IC50=478.72μg/mL），活性高于陽性對照阿卡波糖（IC50=1 044.32μg/mL）。對8月份山楂葉分級萃取物進行活性測定，其中Cy E和WtE活性較弱，未能計算其IC50值。EA E（IC50= 191.71μg/mL）和Bu E（IC50=305.22μg/mL）對α-葡萄糖苷酶抑制活性遠高于陽性對照阿卡波糖，表明EA E和Bu E富集了抑制α-葡萄糖苷酶的有效成分。結合圖1可知，總黃酮含量較高的EA E、Bu E和Aug E表現出更好的α-葡萄糖苷酶抑制活性。

2.5 各提取物質量濃度對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響

準噶爾山楂葉不同提取物質量濃度對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響見圖4。

圖4 準噶爾山楂葉不同提取物質量濃度對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響Fig.4 Effects of concentration of different extracts from Crataegus songorica leaves on α-glucosidase inhibitory activity

由圖4可知，當供試質量濃度小于1 000μg/mL時，各提取物對α-葡萄糖苷酶抑制活性與濃度呈現明顯的量效關系，即抑制率隨著質量濃度升高而逐漸增大，其中活性較好為總黃酮含量較高的EA E、Bu E和 Aug E。在質量濃度為1 000μg/mL時，三者對α-葡萄糖苷酶抑制率分別為70.52%、96.70%、85.57%，遠高于阿卡波糖活性（47.85%），此后三者抑制率隨著濃度增大變化不顯著。其余各提取物在測試濃度范圍內表現出與阿卡波糖相近的α-葡萄糖苷酶抑制活性。

3 結論

大量的研究表明自由基與人類一百多種疾病的發生有關[15]。自由基具有很強的氧化能力，適量的自由基通過信息調控維持機體的氧化應激和氧化還原的平衡。糖尿病發生后，人體在高血糖刺激下，產生過量的自由基增加氧化應激，導致細胞的損傷和死亡[16]，促進糖尿病及其并發癥的發生、發展。本文對準噶爾山楂葉不同醇提物和萃取物的體外抗氧化活性和降血糖活性進行了比較，結果表明，總黃酮含量較高的EA E、Bu E和Aug E具有強氧化活性的同時也表現出較好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，而總黃酮含量較低的Cy E和WtE體外降血糖和抗氧化活性均較弱。說明準噶爾山楂葉的主要降血糖成分為黃酮類化合物，這與有關報道一致[17]。其中乙酸乙酯萃取物具有較好的開發天然抗糖尿病藥物的潛力，其具體活性成分追蹤分離和作用機制有待進一步研究。

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Antioxidant and Alpha-glucosidase Inhibitory Activity of Crataegus songorica Leaves

LIU Wei，REN Yan-li，RANG Feng-ju，HE Xiao-yan，OUYANG Yan*
（University and College Key Lab of Natural Product Chemistry and Application in Xinjiang，Yili Normal University，Yining 835000，Xinjiang，China）

Crataegus songorica leaves collected in different months were extracted by ethanol then partitioned by system solvents with different polarity.The total flavonoids in the ethanol extract，cyclohexane fraction，ethyl acetate fraction，n-butanol fraction and water fraction were measured and the antioxidant activity and in vitro hypoglycemia activity were assayed by scavenging activity of DPPH radicals，reducing power and anti-α-glucosidase activity.The results showed that different extracts from Crataegus songorica leaves all exhibited different degree of antioxidant activity and anti-α-glucosidase activity，among which ethyl acetate fraction showed strong activity.The ethyl acetate fraction had 28.87mg/g of total flavonoids and its IC50of DPPH assay was 0.026mg/mL while the IC50of anti-α-glucosidase activity was 191.71 g/mL，it was far higher than that of the positive control BHA（IC50=0.996mg/mL）and acarbose（IC50=1 044.32 g/mL）.The antioxidant and antiα-glucosidase activities of the extracts were positively correlated to their total flavonoids，it showed that flavonoids were main factors for the activities.

Crataegus songorica leaves；total flavonoids；anti-oxidantion；anti-α-glucosidase activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.03.005

2016-05-14

伊犁師范學院重點科研計劃項目（2015YSZD02）

劉偉（1985—），男（漢），實驗師，碩士，主要從事天然產物活性成分研究。

*通信作者：歐陽艷（1965—），女（漢），教授，博士，主要從事天然產物活性成分研究。