何首烏莖葉總黃酮的提取及其抗運(yùn)動(dòng)疲勞作用

錢小東，黃偉

（1.湖北第二師范學(xué)院體育學(xué)院，湖北武漢430205；2.湖北省腫瘤醫(yī)院婦瘤科，湖北武漢430079）

何首烏莖葉總黃酮的提取及其抗運(yùn)動(dòng)疲勞作用

錢小東1，黃偉2，*

（1.湖北第二師范學(xué)院體育學(xué)院，湖北武漢430205；2.湖北省腫瘤醫(yī)院婦瘤科，湖北武漢430079）

利用單因素和正交試驗(yàn)對(duì)超聲波乙醇浸提法提取何首烏莖葉總黃酮的工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)何首烏莖葉總黃酮的抗運(yùn)動(dòng)疲勞作用進(jìn)行研究。結(jié)果表明，超聲波乙醇浸提法提取何首烏莖葉總黃酮的最佳提取工藝為：超聲時(shí)間40min，乙醇濃度70%，料液比1∶40（g/mL），提取溫度80℃，在此工藝條件下何首烏莖葉總黃酮的得率可達(dá)2.49%。小鼠跑臺(tái)力竭實(shí)驗(yàn)和負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)表明何首烏莖葉總黃酮具有良好的抗運(yùn)動(dòng)疲勞能力。

何首烏莖葉；總黃酮；超聲波乙醇浸提；正交試驗(yàn)；抗運(yùn)動(dòng)疲勞

何首烏是一種傳統(tǒng)的中藥資源，具有抗氧化、降血脂、提高機(jī)體免疫力、抗衰老，改善記憶能力等多種功效，深受廣大消費(fèi)者喜歡[1-3]。然而，與何首烏的廣泛應(yīng)用不同，何首烏莖葉的深加工產(chǎn)品卻很少見，因此一定程度上造成了對(duì)何首烏莖葉的浪費(fèi)[4]。一些研究表明植物的莖葉中含有一定量的黃酮類物質(zhì)，且具有多種保健功能，如抗氧化、抗衰老、抗突變等，具有廣闊的應(yīng)用價(jià)值[5-7]。此外，研究發(fā)現(xiàn)天然提取的總黃酮會(huì)具有一定的抗運(yùn)動(dòng)疲勞的能力[8-10]，因此何首烏莖葉總黃酮是否也具有這樣的能力值得進(jìn)行進(jìn)一步的研究。在本研究以何首烏莖葉為研究對(duì)象，利用超聲波乙醇浸提法對(duì)何首烏莖葉中的總黃酮進(jìn)行提取，并利用正交試驗(yàn)對(duì)提取參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，在此基礎(chǔ)上對(duì)提取的總黃酮物質(zhì)進(jìn)行抗運(yùn)動(dòng)疲勞的研究。本研究不僅有利于提高何首烏莖葉總黃酮的得率，也能夠?yàn)橥卣购问诪跚o葉的開發(fā)利用和活性成分研究提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 樣品來(lái)源

何首烏莖葉：大小均一，且均完好無(wú)損，無(wú)腐敗變質(zhì)現(xiàn)象，采摘自湖北省孝昌縣大別山區(qū)。

1.2 材料與試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：北京索萊寶科技有限公司；95%乙醇：滄州鑫安化工；5%苯酚：上海居里生物試劑檢測(cè)中心；濃硫酸：無(wú)錫嘉宏化工貿(mào)易有限公司。上述試劑均為分析純。

小鼠：年齡8周，雄性，體重（20±2）g，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。

1.3 儀器與設(shè)備

AB104-N電子分析天平：梅特勒-托利多儀器（北京）有限公司；6050低溫真空干燥箱：重慶市松朗電子儀器有限公司；FW80高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：北京市泰和格潤(rùn)儀器有限公司；KQ-100KDB高功率數(shù)控超聲波清洗器：蘇州市超聲儀器有限公司；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)：普析通用儀器（北京）有限責(zé)任公司；小鼠恒溫游泳箱，安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司；小鼠實(shí)驗(yàn)跑臺(tái)，北京達(dá)美達(dá)科技有限公司；體育運(yùn)動(dòng)計(jì)時(shí)數(shù)字電子秒表，深圳萬(wàn)德豐科技有限公司。

2 方法

2.1 何首烏莖葉總黃酮含量的測(cè)定

2.1.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)林海楨等[11]的報(bào)道，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，在510nm下測(cè)定不同濃度蘆丁的吸光值，最后以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.1.2 何首烏莖葉總黃酮的制備及含量測(cè)定

利用低溫真空干燥箱對(duì)何首烏莖葉進(jìn)行干燥，采用萬(wàn)能粉碎機(jī)對(duì)干燥后的何首烏莖葉進(jìn)行粉碎，60目篩子過(guò)篩得到何首烏莖葉粉末備用。精密稱取10 g的何首烏莖葉粉末，加入不同濃度的乙醇，在常溫下浸泡20 h后進(jìn)行超聲提取，之后對(duì)提取液進(jìn)行抽濾。何首烏莖葉總黃酮的得率計(jì)算公式如下：

式中：C為對(duì)應(yīng)總黃酮的濃度，mg/mL；V為濾液體積，mL；W為得率，%；m為何首烏莖葉提取樣本質(zhì)量，g。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 超聲溫度對(duì)何首烏莖葉總黃酮得率的影響

在乙醇濃度為60%，超聲時(shí)間為30min，料液比為1∶30（g/mL）的條件下，選擇超聲溫度分別為60、70、80、90、100℃，分析提取溫度對(duì)何首烏莖葉總黃酮得率的影響。

2.2.2 乙醇濃度對(duì)何首烏莖葉總黃酮得率的影響

在超聲溫度為80℃，超聲時(shí)間為30min，料液比為1∶30（g/mL）的條件下，選擇乙醇濃度分別為50%、60%、70%、80%和90%，分析乙醇濃度對(duì)何首烏莖葉總黃酮得率的影響。

2.2.3 超聲時(shí)間對(duì)何首烏莖葉總黃酮得率的影響

在超聲溫度為80℃，乙醇濃度為60%，料液比為1∶30（g/mL）的條件下，選擇超聲時(shí)間分別為20、30、40、50、60min，分析超聲時(shí)間對(duì)何首烏莖葉總黃酮得率的影響。

2.2.4 料液比對(duì)何首烏莖葉總黃酮得率的影響

在超聲溫度為80℃，超聲時(shí)間為30min，乙醇濃度為60%的條件下，選擇料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL），分析料液比對(duì)何首烏莖葉總黃酮得率的影響。

2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

為了進(jìn)一步的優(yōu)化超聲波乙醇浸提法提取何首烏莖葉總黃酮的工藝，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。選用超聲溫度、乙醇濃度、提取時(shí)間和料液比4個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化組合，因素與水平表見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Table1 Factors and levels of orthogonal experiment

2.4 何首烏莖葉總黃酮抗運(yùn)動(dòng)疲勞作用

2.4.1 動(dòng)物分組及給藥

取40只小鼠，隨機(jī)分為4組，對(duì)照組（A）為空白對(duì)照組，灌胃生理鹽水；根據(jù)朱一聞等[12]的報(bào)道，設(shè)計(jì)低、中和高劑量的給藥組，具體為B為低劑量組，灌胃何首烏莖葉總黃酮5 g/kg/d；C為中劑量組，灌胃何首烏莖葉總黃酮10 g/kg/d；D為高劑量組，灌胃何首烏莖葉總黃酮15 g/kg/d；上述4組小鼠均灌胃30 d，期間小鼠自由飲水和進(jìn)食。

2.4.2 何首烏莖葉總黃酮對(duì)小鼠跑臺(tái)力竭時(shí)間的影響

灌胃第12 d開始，對(duì)4組小鼠需進(jìn)行3 d的跑臺(tái)適應(yīng)實(shí)驗(yàn)（30min/次/d），速度為20m/min。從第15 d開始對(duì)4組小鼠進(jìn)行一周的跑臺(tái)力竭實(shí)驗(yàn)，力竭速度為20m/min，當(dāng)小鼠聯(lián)連續(xù)從電網(wǎng)掉下，呼吸急促、視為無(wú)法完成跑臺(tái)實(shí)驗(yàn)，此時(shí)記錄小鼠力竭時(shí)間[13]。

2.4.3 何首烏莖葉總黃酮對(duì)小鼠負(fù)重游泳力竭時(shí)間的影響

1992年在天津手表廠基礎(chǔ)上，天津市組建成立“天津海鷗手表集團(tuán)公司”（簡(jiǎn)稱：海鷗表業(yè)）。進(jìn)入二十一世紀(jì)，為適應(yīng)市場(chǎng)需求的變化，海鷗表業(yè)集團(tuán)成立了國(guó)家級(jí)技術(shù)中心和國(guó)內(nèi)鐘表行業(yè)唯一的博士后工作站，先后設(shè)計(jì)、研制出“陀飛輪”、“雙陀飛輪”、“萬(wàn)年歷”、“三問表”、“陀飛輪女表”、“計(jì)時(shí)碼表”等一系列復(fù)雜機(jī)心手表（圖19）。

小鼠末次灌胃30min后，讓4組小鼠進(jìn)行負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)，負(fù)重量為體重的4%，將4組實(shí)驗(yàn)小鼠放于水溫為25℃，水深為30 cm的游泳箱進(jìn)行負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)，記錄4只小鼠力竭時(shí)間[12]。

2.5 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，并利用SPSS17.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，選擇Tukey’s檢驗(yàn)，當(dāng)P＜0.05時(shí)可視為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，差異顯著。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗(yàn)

3.1.1 超聲溫度對(duì)何首烏莖葉總黃酮得率的影響

在超聲溫度為60、70、80、90、100℃下分析超聲溫度對(duì)何首烏莖葉總黃酮得率的影響，結(jié)果如圖1。

圖1 超聲溫度對(duì)何首烏莖葉總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic extraction temperature on the extraction rate of FSLPMT

3.1.2 乙醇濃度對(duì)何首烏莖葉總黃酮得率的影響

在乙醇濃度分別為50%、60%、70%、80%和90%的水平下分析乙醇濃度對(duì)何首烏莖葉總黃酮得率的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 乙醇濃度對(duì)何首烏莖葉總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of FSLPM T

隨著乙醇濃度的增加，何首烏莖葉總黃酮的得率也隨之增加，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到80%時(shí)趨于穩(wěn)定，因此何首烏莖葉總黃酮提取的最佳乙醇濃度為80%。

3.1.3 超聲時(shí)間對(duì)何首烏莖葉總黃酮得率的影響

在超聲時(shí)間分別為20、30、40、50、60min的條件下研究超聲時(shí)間對(duì)何首烏莖葉總黃酮得率的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)何首烏莖葉總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic extraction time on the extraction rate of FSLPMT

隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，何首烏莖葉總黃酮的得率隨之增加，當(dāng)超聲時(shí)間為40min時(shí)，得率達(dá)到最大。但是當(dāng)大于40min后，何首烏莖葉總黃酮的得率會(huì)隨著超聲時(shí)間的增加而降低，這可能是由于超聲波產(chǎn)生的較強(qiáng)的機(jī)械振動(dòng)作用和空化作用，時(shí)間長(zhǎng)了會(huì)破壞提取液中的黃酮類物質(zhì)，因此何首烏莖葉總黃酮提取的最佳超聲時(shí)間為40min。

3.1.4 料液比對(duì)何首烏莖葉總黃酮得率的影響

在料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）的水平下分析料液比對(duì)何首烏莖葉總黃酮得率的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 料液比對(duì)何首烏莖葉總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of liquid material ratio on the extraction rate of FSLPMT

隨著料液比的增加，何首烏莖葉總黃酮的得率也隨之增加，當(dāng)料液比為1∶40（g/mL）時(shí)趨于恒定，因此何首烏莖葉總黃酮提取的最佳料液比為1∶40（g/mL）。

3.2 正交試驗(yàn)

為了得到超聲波乙醇浸提法提取何首烏莖葉總黃酮的最佳參數(shù)組合，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，并進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表2，表3所示。

由表2可知，4個(gè)因素對(duì)何首烏莖葉總黃酮得率的影響順序?yàn)椋阂掖紳舛龋˙）＞超聲溫度（D）＞超聲時(shí)間（A）＞料液比（C）；超聲波乙醇浸提法提取何首烏莖葉總黃酮的最佳因素水平組合為A2B2C3D2，即超聲時(shí)間40min，乙醇濃度70%，料液比1∶40（g/mL），提取溫度80℃。由表3方差分析可知，4個(gè)因素都對(duì)何首烏莖葉總黃酮得率有極顯著的影響（P＜0.01）。按照上述最優(yōu)方案進(jìn)行了3次平行試驗(yàn)，何首烏中總黃酮的得率分別為2.49%、2.45%、2.53%，3次試驗(yàn)的平均值為2.49%，其結(jié)果高于正交試驗(yàn)各組得率。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table2 Results of orthogonal experiment

表3 方差分析Table3 Variance analysis

3.3 何首烏莖葉總黃酮抗運(yùn)動(dòng)疲勞作用

3.3.1 何首烏莖葉總黃酮對(duì)小鼠跑臺(tái)力竭時(shí)間的影響

何首烏莖葉總黃酮對(duì)小鼠跑臺(tái)力竭時(shí)間的影響見表4。

表4 何首烏莖葉總黃酮對(duì)小鼠跑臺(tái)力竭時(shí)間的影響Table4 Effects on treadmill exhaustion time of mices of FSLPMT

由表4可知，與空白對(duì)照組（A組）小鼠相比，低（B組）、中（C組）和高（D組）劑量組小鼠跑臺(tái)實(shí)驗(yàn)力竭時(shí)間隨著給藥劑量的增加而得到顯著的延長(zhǎng)（P＜0.05）。這說(shuō)明何首烏莖葉總黃酮能夠增強(qiáng)小鼠的耐力，具有抗運(yùn)動(dòng)疲勞的作用。

3.3.2 何首烏莖葉總黃酮對(duì)小鼠負(fù)重游泳力竭時(shí)間的影響

小鼠負(fù)重游泳力竭實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。

圖5 何首烏莖葉總黃酮對(duì)小鼠游泳耐力的影響Fig.5 Effects on swimming endurance of mices of FSLPMT

與空白對(duì)照組（A組）小鼠相比，低（B組）、中（C組）和高（D組）小鼠均能夠顯著的延長(zhǎng)小鼠游泳的力竭時(shí)間（P＜0.05），并隨著給藥量的增加小鼠負(fù)重游泳的耐力也得到顯著增加（P＜0.05），這進(jìn)一步說(shuō)明何首烏莖葉總黃酮具有抗運(yùn)動(dòng)疲勞的作用。

4 結(jié)論

本研究探討了何首烏莖葉總黃酮的提取工藝，結(jié)果表明，何首烏莖葉總黃酮得率的影響順序?yàn)椋阂掖紳舛龋境暅囟龋境晻r(shí)間＞料液比，超聲波乙醇浸提法提取何首烏莖葉總黃酮的最佳工藝為：超聲時(shí)間40min，乙醇濃度70%，料液比1∶40（g/mL），提取溫度80℃，此條件下何首烏莖葉總黃酮的得率為2.49%，小鼠跑臺(tái)力竭實(shí)驗(yàn)和負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)表明何首烏莖葉總黃酮具有抗運(yùn)動(dòng)疲勞能力。本研究對(duì)何[lele8]首烏莖葉總黃酮的提取及深度開發(fā)具有指導(dǎo)意義。

[1]張綿松,劉新,孟秀梅,等.生何首烏體外抗氧化活性及抗菌活性的研究[J].食品科技,2012(8):228-231

[2]翟蓉,呂麗爽,金邦荃.何首烏多糖降血脂作用的研究[J].食品與機(jī)械,2010,26(5):87-90

[3]韓廣明,高曉蘭,牛嗣云,等.何首烏飲對(duì)衰老大鼠學(xué)習(xí)記憶及下丘腦GnRH SPβ-EP含量的影響[J].河北醫(yī)學(xué),2011,17(4):496-498[4]葉春,范家佑,張小明.何首烏嫩莖葉營(yíng)養(yǎng)成分分析及評(píng)價(jià)[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2004,30(1):43-44

[5]劉桂萍,崔博籍,孫久陽(yáng),等.微波輔助提取杜仲葉總黃酮工藝優(yōu)化[J].中國(guó)釀造,2015,34(5):127-130

[6]趙丹,蘇寧,楊麗,等.藍(lán)莓葉總黃酮的體外抗炎功效評(píng)價(jià)[J].食品科學(xué),2015,36(17):231-235

[7]劉智峰.酶法-超聲波輔助提取香椿葉中總黃酮及抗氧化活性研究[J].食品工業(yè)科技,2015(20):314-319

[8]洪雪娥,高蔭榆,羅麗萍,等.薯蔓黃酮的抗疲勞作用研究[J].食品科學(xué),2006,27(2):256-258

[9]宋新昕,李愛臣.麥冬中總黃酮提取及抗氧化性的研究[J].中國(guó)食品添加劑,2015(11):95-100

[10]鄧炳楠.大豆異黃酮抗疲勞作用及相關(guān)機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究[D].北京:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院,2015

[11]林海楨,施勝英,李舒婕,等.內(nèi)蒙紫草總黃酮提取工藝及其抗氧化活性研究[J].食品研究與開發(fā),2016,37(5):36-41

[12]朱一聞,方樹遠(yuǎn),徐天姿,等.黃秋葵多糖抗小鼠運(yùn)動(dòng)性疲勞及其作用機(jī)理的研究[J].浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2013(7):902-904

[13]鐘雨,閆明珠,張澤生,等.黃秋葵水提物抗運(yùn)動(dòng)疲勞作用研究[J].食品科技,2015,40(7):221-225

Extraction and Anti-exercise-fatigue Activity of Flavonoids from Stalks and Leaves of Polygonum multiflorum thunb

QIAN Xiao-dong1，HUANG Wei2，*
（1.Department of Physical Education，Hubei University of Education，Wuhan 430205，Hubei，China；2.Department of Female Tumor，Hubei Province Tumor Hospital，Wuhan 430079，Hubei，China）

The ultrasonic and ethanol immersion extraction process of flavonoids from stalks and leaves of Polygonum multiflorum thunb（FSLPMT）was optimized using the single factor experiment and orthogonal experiment.In addition，the anti-exercise-fatigue activity of FSLPMT was studied.The results showed that the optimum extraction condition of FSLPMT using ultrasonic and ethanol immersion extraction method was：ultrasonic extraction time 40min，volume fraction of ethanol 70%，liquid material ratio 1∶40（g/mL），and ultrasonic extraction temperature 80℃.Under the optimum conditions，the obtained rate of FSLPMT was 2.49%. The results of the treadmill test and weight-loaded swimming test showed that FSLPMT had a good resistance to movement fatigue.

stalks and leaves of Polygonum multiflorum thunb；flavonoids；ultrasonic ethanol extraction；orthogonal experiment；anti-exercise-fatigue

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.03.015

2016-09-13

錢小東（1983—），男（漢），講師，碩士，研究方向：體育人文社會(huì)學(xué)。

*通信作者：黃偉（1987—），女（漢），醫(yī)師，碩士，研究方向：婦科腫瘤。