上轉換發光免疫層析法快速檢測牛奶中雌二醇

姜會聰，任舒悅，王瑜，李巧鳳，白家磊，彭媛，寧保安，孫思明，高志賢，，*

（1.鄭州大學公共衛生學院，河南鄭州450001；2.軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所，天津市環境與食品安全風險監控技術重點實驗室，天津300050）

上轉換發光免疫層析法快速檢測牛奶中雌二醇

姜會聰1，任舒悅2，王瑜2，李巧鳳1，白家磊2，彭媛2，寧保安2，孫思明2，高志賢1，2，*

（1.鄭州大學公共衛生學院，河南鄭州450001；2.軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所，天津市環境與食品安全風險監控技術重點實驗室，天津300050）

建立定量快速檢測雌二醇（E2）的上轉換免疫層析技術。以上轉換發光材料（UCP）為新型標記物，采用戊二醛法偶聯單克隆抗體（mAb），制備UPT-mAb復合物，并以其作為探針，基于小分子競爭結合，建立免疫層析試紙條方法，并對試紙條性能進行評價。方法特異性強，穩定性好，靈敏度高，最低檢出限低至2.75 ng/mL，線性范圍為5 ng/mL～ 2 000 ng/mL，回收率88.88%～103.5%，變異系數CV＜10%。成功構建了上轉換免疫層析法用于檢測雌二醇，適用于現場快速檢測，具有良好的經濟價值和應用前景。

上轉換發光材料；免疫層析；雌二醇；間接競爭

雌二醇（Estrodiol，E2）是一種天然的雌激素，也是一種典型的內分泌干擾物，在自然界廣泛分布。雌二醇能夠促進動物生長發育，提高動物的產奶量，因此被廣泛用于肉雞、豬、奶牛等禽畜飼養[1-2]。然而含有雌二醇的動物性食物可以通過食物鏈進入人體內并進一步富集，不僅能引起兒童性早熟，也可能會增加女性患乳腺癌的風險[3-4]。因此建立雌二醇殘留的快速檢測技術對保障人群健康具有重要意義。

傳統的雌二醇檢測方法主要是借助HPLC或GCMS等大型分析儀器[5-6]，可以準確靈敏的檢測出樣品中的雌二醇，但這些方法分析時間長，操作復雜。因此亟需建立一種快速簡便的檢測方法。

上轉換發光材料（Up-Converting Phosphor，UCP）是一種由稀土元素摻雜的熒光納米材料，能夠將低能量的近紅外光轉化為高能量的可見光發射[7]。上轉換發光材料表現出卓越的光學性能，比如高亮度，低毒性，低自發熒光背景等，在檢測中可以不受背景熒光的干擾，具有高的靈敏度，近些年來，基于UCP的檢測技術飛速發展，上轉換發光技術（Up-converting phos phor technology，UPT）也應運而生[8]。免疫層析技術（Immunostrip assay，ICA）是一種建立在抗原與抗體特異性結合基礎上的檢測方法，該方法不僅快速，簡便，靈敏度高，而且耗時短，適合于現場快速檢測[9]。近年來基于上轉換發光的免疫層析技術也得到了快速的發展，洪文艷等[10]將上轉換材料與免疫層析技術相結合，用于檢測鼠疫耶爾森菌LcrV抗體，劉海英[11]利用熒光免疫層析法檢測牛奶中生物素的含量。本研究建立了雌二醇上轉換發光免疫層析方法，并基于上轉換發光免疫分析儀，用于奶制品中雌二醇殘留的快速檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原材料與試劑

氯化釔（YCl3·6H2O）、氯化鐿（YbCl3·6H2O）、氯化鉺（ErCl3·6H2O）、1-十八烯（ODE）和油酸（OA）：山東西亞化學工業有限公司；3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）、四乙氧基硅烷（TEOS）和牛血清白蛋白（BSA）：Sigma公司；雌二醇（E2）、雌酮（E1）、雌三醇（E3）、己烯雌酚（DES）、己烷雌酚（HEX）：北京百靈威科技有限公司；雌二醇單克隆抗體（E2-ab）和雌二醇包被原（E2-BSA）：天津市環境與食品安全風險監控技術重點實驗室自制；羊抗鼠抗體：北京索萊寶公司；玻璃纖維素膜、硝酸纖維素膜（NC膜）和PVC底板：北京熱景生物技術有限公司；牛奶：天津聯華超市；其它試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設備

JEM-100CXII透射電子顯微鏡：日本電子株式會社；FTS6000傅里葉紅外光譜儀：美國Bio-Rad公司；LGJ-10D型冷凍干燥機：北京四環科學儀器廠；HM3010單維往復劃膜儀：上海金標公司；ZQ2000微電腦自動斬切機：上海金標公司；UPT-3A便攜式上轉換發光免疫分析儀：北京熱景生物技術有限公司。

1.2 上轉換免疫層析方法的建立

1.2.1 上轉換顆粒的合成及修飾

取0.8mmol/LYCl3，0.18mmol/LYbCl3，0.02mmol/L ErCl3，加入盛有10mLOA和30mLODE的燒瓶中，加熱攪拌升溫至160℃，除去水和氧，保持30min后逐漸降溫至50℃，加入20mLNaF溶液，50℃攪拌30min后升溫至100℃并保持10min，然后在N2保護下快速升溫至310℃并保持1 h。待反應體系降至室溫，用環己烷洗滌沉淀三次，離心收集。

稱取50mg顆粒于100mL圓底燒瓶中，加入30mL乙醇，1.25mL氨水，10mL水和30μL TEOS，40℃加熱攪拌6 h后加入50μL APTES，40℃繼續反應6 h；用乙醇洗滌沉淀3次，離心收集。

1.2.2 上轉換顆粒標記抗體

10mg氨基化顆粒分散于5mL 0.01mol/LPBS中，加入1.5mL的戊二醛溶液，緩慢振蕩2 h，離心分離后重懸于2mL去離子水中并加入20μL濃度為2.5mg/mL單抗，緩慢振蕩2 h，加入BSA封閉后離心并棄上清，加入保存液和凍干液保存備用。

1.2.3 上轉換發光材料結合墊處理與制備

將標記抗體的上轉換顆粒溶液均勻滴涂在2 cm× 12.5 cm的玻璃纖維素膜上，冷凍干燥12 h，保存備用。

1.2.4 樣品墊處理與制備

200mg S17加入到10mL Tris-HCl，均勻滴涂在2 cm×12.5 cm的玻璃纖維素膜上，烘干并保存備用。

1.2.5 NC膜處理與制備

將包被原與羊抗鼠抗體分別于NC膜的適當位置用劃膜儀進行劃線，烘干保存備用。

1.2.6 試紙條組裝

在干燥環境中，將制備好的樣品墊，結合墊，NC膜，吸水墊，依次黏貼于PVC板上，用自動斬切機切成4mm長的試紙條，組裝上外殼，真空包裝并保存備用。

1.2.7 試紙條工作參數的優化

為優化試紙條的最佳工藝參數，選擇進樣墊寬度，結合墊寬度，包被原濃度和羊抗鼠抗體濃度作為試驗因素，采用四因素三水平正交試驗確定試紙條的最佳制作工藝參數，具體試驗設計見表1。

表1 上轉換試紙條正交試驗設計Table1 The orthogonal experimental design of UCP strip

1.3 上轉換免疫層析試紙方法的評價

1.3.1 線性范圍和最低檢出限

將雌二醇依次稀釋至不同濃度，在最優條件下組裝好的試紙條間隔15 s依次加入不同濃度的雌二醇溶液，15min后，使用UPT-3A便攜式上轉換發光免疫分析儀檢測，得到T/C值，每個測試重復測三組，按照公式（1）計算抑制率。

式中：T0和C0分別是空白樣品檢測線和質控線對應的相對熒光強度；T和C分別是不同濃度雌二醇小分子溶液對應的檢測線和質控線對應的相對熒光強度。

1.3.2 穩定性

取同一批試紙條和三批不同PVC板的試紙條分別測5個濃度（2 000、500、125、31.25、7.812 5 ng/mL），重復3次，計算批內和批間的抑制率平均值（X）和標準差（S），按照公式（2）計算出變異系數。

1.3.3 特異性

將雌二醇（E2）、雌酮標（E1）、雌三醇標（E3）己烯雌酚（DES）和己烷雌酚（HEX）分別稀釋至雌二醇抑制率為50%（IC50）時的濃度并檢測。

1.3.4 加標回收

取5mL從超市買回來的牛奶，10℃離心10min除去上層脂肪層，將得到的樣本用去離子水按照體積比1∶20稀釋，過濾，得到待測溶液[12]。用待測溶液將雌二醇依次稀釋至1 000、250 ng/mL和62.5 ng/mL，用試紙條檢測，重復3次，求加標回收率。

2 結果與分析

2.1 檢測原理

本方法設計原理是基于樣品墊中E2與包被原（E2-BSA）競爭結合雌二醇單克隆抗體。樣品中沒有E2時，偶聯有抗體的UCP顆粒（UCP-mAb）隨液體在NC膜上流動時被檢測線（T線）上的E2-BSA固定，T線相對于質控線（C線）會有很強的信號，即T/C越大。樣品中有E2時，E2先和UCP-mAb結合，隨液體流動到NC膜上的T線時，E2-BSA和E2競爭UCP-mAb，被競爭掉小分子的UCP-mAb在T線與E2-BSA結合，沒有被競爭掉的小分子與UCP-mAb結合物隨液體在NC膜上流動，并與C線上的二抗結合，小分子越多，C線的信號強度越大，T/C越小。

2.2 上轉換顆粒的表征

本試驗使用經典的溶劑熱法合成上轉換顆粒，所得產物的電鏡圖及紅外表征圖譜見圖1。

結果顯示，圖1（A）中溶劑熱法合成的上轉換顆粒大小均一，粒徑約為100 nm，圖1（B）中，上轉換顆粒修飾硅殼后，得到均勻的二氧化硅層，厚度約為7 nm，增加了在水溶液中分散性，有利于進一步檢測。

圖1 溶劑熱法合成的上轉換顆粒電鏡圖和紅外圖譜Fig.1 TEM images and infrared spectrums of UCNPs prepared by solvothermal method

圖1（C-b）中，同時包覆硅殼和修飾氨基的上轉換顆粒在1 091 cm-1處出現屬于Si-O鍵的對稱伸縮振動峰，在3 317 cm-1和1 635 cm-1處出現的特征吸收峰，分別屬于氨基（-NH2）的伸縮振動和彎曲振動峰。該試驗結果與文獻中一致[13]。圖1（C-c）中偶聯抗體后在1 651 cm-1和1 535 cm-1左右出現了分別屬于蛋白胺類的Ⅰ級和Ⅱ級特征吸收峰[14]。由此可見，上轉換顆粒硅烷化后成功修飾上氨基，同時成功偶聯抗體，可用于進一步檢測。

2.3 上轉換層析試紙條工作參數優化結果

本試驗經全面考慮，最后確定加樣墊寬度、結合墊寬度、包被原濃度和羊抗鼠濃度4個工作參數為本試驗的試驗因素，進行四因素正交試驗，各因素均取3個水平，對工作參數進行優化，以每一組3次平行試驗的半抑制率IC50的平均值IC50評價優化結果（當y=50時，表示50%的抗體被競爭結合時所對應的小分子濃度，記為半抑制率IC50），IC50越小，說明抗體對此競爭小分子的靈敏度越好。

通過比較A，B，C，D 4個因素中極值R的大小，得到具體分析數據如表2所示。

從表2中可得知A因素即加樣墊寬度為最重要因素，然后依次為D羊抗鼠濃度、C因素包被原濃度和B因素結合墊寬度，即A＞D＞C＞B。由于A因素：k2＞k3＞k1；B因素：k3＞k1＞k2；C因素：k1＞k3＞k2；D因素：k2＞k3＞k1，所以產品的最佳配方組合為A1B2C2D1，即進樣墊1.6 cm，結合墊0.9 cm，T線1.25mg/mL，C線0.8mg/mL。

表2 不同工藝參數的實驗結果Table2 The results of different processing parameters

2.4 線性范圍與最低檢出限

本試驗使用所制作試紙條檢測雌二醇小分子，如圖2所示。

圖2 雌二醇檢測標準曲線的繪制Fig.2 Standard curve for E2 detecting

所得S型曲線擬合度較好，得到標準曲線的線性方程為：Y=34.57X-20.89，R2=0.992 4，可知在5 ng/mL～ 2 000 ng/mL范圍內，雌二醇濃度的對數值和抑制率呈良好的線性關系，最低檢出限為2.75 ng/mL。

2.5 試紙條的穩定性評價

通過分別對同一批試紙條和三批不同批次的試紙條進行加樣檢測，測定結果見表3。

表3 批內和批間變異系數比較Table3 The coefficient of variation contrast within Intra-and inter-assay

由表3可知，批內和批間的變異系數均小于10%，說明不同批次試紙條之間和同一批試紙條內部的差異性不足以對檢測結果造成明顯的影響，由此可見該方法準確性好，精確度高。

2.6 特異性評價

試紙條的特異性直接關系到其進行定量檢測的能力，因此特異性對評價上轉換免疫層析方法具有十分重要的意義。本試驗選取4種雌二醇類似物分別稀釋至115.73 ng/mL，檢測并計算出抑制率。

圖3 不同種雌二醇類似物的抑制率Fig.3 The inhibition ratio for different compounds of E2

由圖3可知，相對于雌二醇，其它小分子的抑制率均明顯小于50%，由此可知本方法具有良好的專一性和選擇性。

2.7 對實際樣品的加標回收測試

用本方法制備的試紙條對市售的液態牛奶進行雌二醇含量加標檢測，測定結果見表4。

表4 本方法對牛奶樣品中雌二醇的加標回收率Table4 Recovery for the added E2from the milk samples obtained by the developed method

由表4可知，牛奶的加標回收率在88.88%～103.5%之間，說明本方法穩定，準確，靈敏，適合于牛奶實際樣品中雌二醇的檢測。

2.8 方法學評價

本方法與目前已經發表ELISA、膠體金等其它方法相比較，見表5。

表5 本方法與其它雌二醇檢測方法的比較Table5 The comparison between this method and other detection methods of E2

表5中的比較結果表明上轉換免疫層析方法同時兼具線性范圍寬和檢測限低的優勢，具有良好的應用前景。

3 結論

本研究研制的上轉換免疫層析試紙采用競爭結合的原理，以熒光穩定性和發光強度高的上轉換材料為載體，結合方便快捷的免疫層析方法，構建了一種可用于現場快速定量檢測牛奶中雌二醇的新技術。該檢測方法不僅避免了被檢物質背景光的干擾特異性強，穩定性好，同時具有靈敏度高和穩定性好的優點，最低檢出限低至2.75 ng/mL，線性范圍為5 ng/mL～ 2 000 ng/mL，變異系數CV＜10%，15min內即可以完成全部檢測，適合于現場檢測，與其它類似物相比，特異性很好，基本不受其它干擾物的影響。總之，本研究建立的上轉換免疫層析試紙方法具有高的靈敏度，準確度，可靠性和穩定性，同時檢測時間短，大大提高了檢測效率，非常適合于現場檢測，具有良好的經濟價值和應用前景。

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An Up-converting Phosphor Technology Based Immunostrip Assay for Rapid Detection of Estradiol in Milk

JIANG Hui-cong1，REN Shu-yue2，WANG Yu2，LI Qiao-feng1，BAI Jia-lei2，PENG Yuan2，NING Bao-an2，SUN Si-ming2，GAO Zhi-xian1，2，*
（1.College of Public Health，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001，Henan，China；2.Tianjin Key Laboratory of Risk Assessment and Control Technology for Environment and Food Safety，Institute of Health and Environmental Medicine，Military Medical Sciences，Tianjin 300050，China）

To develop an up-converting phosphor technology based immunostrip assay for quantitative detection of estradiol.A composition contained up-converting phosphor（UCP）as a novel lable and estradiol antibody（E2-mAb）with glutaraldehyde method.The estradiol was detected by the fluorescent immunostrip assay based on indirect competitive principle which had this composition asa probe.Detection performance including stability，specificity and sensitivity was evaluated.The method showed well stability，specificity and sensitivity with the detection limit of 2.75ng/mL，the linear range of 5 ng/mL to2000 ng/mL，the recovery of 88.88%to103.5%，and the coefficient of variation（CV）less than 10%.The established assay for E2detection can be successfully used to fast-field analysis and has good economic value and broad application prospect.

up-converting phosphor；immunostrip；estradiol；indirect competitive

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.03.026

2016-09-28

國家自然科學基金（21477162）；天津市科技支撐計劃項目（14ZCZDSF00021）；天津市應用基礎與前沿技術研究計劃（15JCYBJC51200）

姜會聰（1990—），女（漢），在讀碩士，從事營養與食品衛生學研究工作。

*通信作者