SPE-HPLC測定黃瓜、番茄中敵菌靈和異菌脲殘留量

徐秋生，劉俊，賀慧琳，厲晨皓

（平湖市食品藥品檢測中心，浙江平湖314200）

SPE-HPLC測定黃瓜、番茄中敵菌靈和異菌脲殘留量

徐秋生，劉俊，賀慧琳，厲晨皓

（平湖市食品藥品檢測中心，浙江平湖314200）

建立采用固相萃取-高效液相色譜法同時測定黃瓜、番茄中敵菌靈和異菌脲農藥殘留量的分析方法。樣品用乙腈均質法提取鹽析后脫水，經SPE固相萃取凈化，濃縮儀濃縮后進液相色譜分離與檢測，外標法定量。對樣品進行添加回收率試驗，添加濃度分別為0.1、0.5、1.0mg/kg，敵菌靈和異菌脲2種農藥的回收率在82.5%～102.8%之間，標準偏差（RSD）在2.95%～8.68%之間，最低檢出限為0.02mg/kg。該方法滿足黃瓜、番茄中敵菌靈和異菌脲農藥殘留量的檢測要求。

固相萃??；高效液相色譜；黃瓜；番茄；敵菌靈；異菌脲

敵菌靈（又稱防霉靈），是由三聚氰酰氯與鄰氯苯胺在脫酸劑存在下作用而得，化學名稱2，4-二氯-6-（鄰氯代胺基）均三氮苯，是一種殺菌譜較廣的雜環類內吸性殺菌劑，常用于防治蔬菜灰霉病、菌核病、斑枯病、黑斑病、霜霉病、茭白胡麻葉斑病、瓜類炭疽病、黃瓜黑星病和番茄斑枯病等，具有低毒、內吸性、殺菌譜廣等特點，廣泛應用于糧食蔬菜等農作物[1]。異菌脲（又稱撲海因），化學名稱3-（3，5-二氯苯基）-1-異丙基氨基甲酰基乙內酰脲，是二甲酰亞胺類高效廣譜、觸殺型殺菌劑，對葡萄孢屬、核盤菌屬、小核菌屬、鏈孢霉屬均有較好抑菌活性，主要用于蔬菜灰霉病、番茄早疫病、蘋果斑點落葉病和輪紋病的防治[2]。敵菌靈和異菌脲的結構式如圖1、圖2：

圖1 敵菌靈結構式Fig.1 Structural formula of anilazine

圖2 異菌脲結構式Fig.2 Structural formula of iprodione

農藥在農業生產過程中無可避免的會被使用，這對人畜都有一定的毒副作用，對環境和生物鏈都有極大的破壞性，而水果、蔬菜上的農藥殘留問題也是由來已久的，已經對人體健康和生命安全造成了嚴重的威脅。目前農藥殘留限量標準，CAC、日本、歐盟和美國均有現行標準，規定了在水果、蔬菜和糧食中的最大殘留限量值（MRL），并對其殘留量進行監測。我國在2014年發布的最新版《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》[3]規定了387種農藥在284種（類）食品中3650項限量指標，其中黃瓜、番茄中敵菌靈的最大殘留限量值（MRL）均為10mg/kg，異菌脲的最大殘留限量值（MRL）分別為2mg/kg和5mg/kg。

目前國內對于敵菌靈和異菌脲農藥殘留量的檢測主要有氣相色譜法、液相色譜法和氣質聯用法等[4-8]，前處理方法主要有液液萃取、固相萃取和基質分散固相萃取等。在比較和分析了上述幾種檢測敵菌靈和異菌脲農藥殘留量的檢測方法參考文獻后，本文采用了固相萃取-高效液相色譜法同時對黃瓜、番茄中敵菌靈和異菌脲農藥殘留量進行了研究，對不同的凈化條件進行了比較，通過反復實驗進行條件篩選，以提高方法的準確度和精密度，最終建立了一種簡便可靠、可操作性強、準確度高的檢測方法，可用于同時測定黃瓜、番茄中敵菌靈和異菌脲農藥殘留量。

1 材料與方法

1.1 儀器和設備

UltiMate 3000高效液相色譜儀（美國，Thermo Fisher公司）；TurboVapLV型全自動定量濃縮儀（瑞典，Biotage公司）；T25高速均質機（德國，IKA公司）；MS204S、PL602-L電子天平（瑞士，梅特勒-托利多公司）；LD4-2A離心機（北京醫用離心機廠）；Milli-Q Advatantage A10超純水機（法國，Merck Millipore公司）；KQ3200超聲波清洗器（昆山市超聲波儀器有限公司）；K600多功能食品粉碎機（德國，BRAUN公司）。

1.2 試劑和材料

敵菌靈、異菌脲農藥標準品（純度≥98.0%）：德國Dr.Ehrenstorfer；甲醇、乙腈、丙酮、正己烷（色譜純）：德國Merck；氯化鈉（分析純）：國藥集團；Cleanert Florisil柱（1000mg/6mL）：天津Agela；有機微孔濾膜（0.22μm）：天津Agela；超純水：實驗室（平湖市食品藥品檢測中心）自制。

1.3 樣品處理

準確稱取粉碎均勻的試樣25 g（精確至0.01 g）于250mL廣口瓶中，加入50.0mL乙腈，均質機高速均質2min，全部倒入100mL聚丙烯（PP）塑料離心管中，4 000 r/min離心5min，取上清液倒入預先稱取5 g～7g氯化鈉的100mL聚丙烯（PP）塑料離心管中，蓋上塞子，劇烈振蕩1min，靜置30min，使乙腈相和水相充分分層。從離心管中吸取10.0mL乙腈溶液至15mL玻璃樣品管中，置于全自動定量濃縮儀80℃水浴氮吹蒸發近干，加入2.0mL正己烷渦旋混勻待凈化。依次用5.0mL正己烷+丙酮（90+10）淋洗液和5.0mL正己烷預淋洗Florisil（1 000mg/6mL）小柱，當正己烷液面層到達柱吸附層表面時，立即移入待凈化樣液，棄去上樣流出液，用5.0mL正己烷+丙酮（90+10）淋洗液清洗樣品管后淋洗小柱，并重復一次，用15mL玻璃樣品管接收洗脫液。將盛有洗脫液樣品管置于全自動定量濃縮儀上，水浴50℃氮吹蒸發近干，加入2.0mL甲醇渦旋混勻，過0.22μm有機微孔濾膜，上液相色譜測定。

1.4 色譜條件

色譜柱：AgilentZORBAXEclipseXDB-C18（250mm× 4.6mm，5μm）；流動相：A為乙腈，B為水梯度洗脫，梯度條件見表1；柱溫：30℃；流速：1.0mL/min；檢測器：二極管陣列（DAD）；紫外檢測波長：218 nm；進樣量：20μL。

表1 流動相梯度表Table1 Mobile phase gradient table

1.5 標準曲線的繪制

分別準確稱取敵菌靈和異菌脲農藥標準品，用甲醇定容作為標準貯備液。吸取敵菌靈和異菌脲農藥標準貯備液適量，用甲醇稀釋至濃度為0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0mg/L的系列標準工作溶液，上機測定，以標準工作溶液濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得線性回歸方程。

2 結果與討論

2.1 檢測波長的選擇

取敵菌靈和異菌脲農藥混合標準溶液，上機分析，在190 nm～400 nm范圍內經二極管陣列（DAD）檢測器掃描，發現敵菌靈在波長203 nm和262 nm處均有較強吸收，異菌脲在波長209 nm處吸收最大，波長高于250 nm幾乎無吸收。由于在低波長處檢測溶劑和雜質干擾較強，參考異菌脲的文獻報道和標準方法[9-10]，綜合考慮敵菌靈和異菌脲的特征波長，本方法統一采用218 nm為檢測波長，在該波長下敵菌靈和異菌脲2種農藥均有較好的吸收，并與樣品雜質分離完全，不干擾樣品中敵菌靈和異菌脲農藥的測定。

2.2 淋洗液及用量的選擇

取敵菌靈和異菌脲農藥混合標準溶液適量于15 mL玻璃樣品管中，置于全自動定量濃縮儀50℃水浴氮吹蒸發近干，加入2.0mL正己烷渦旋混合均勻，過預先活化好的Florisil柱（1 000mg/6mL），在重力作用下自然過柱，棄去正己烷流出液，當正己烷液面層到達柱吸附層表面時，分別用正己烷+丙酮（90+10）、正己烷+丙酮（85+15）和正己烷+丙酮（80+20）3種淋洗體系下各15mL淋洗液進行洗脫，分3管進行收集，每管收集5mL，50℃水浴氮吹蒸發近干，用2.0mL甲醇定容，進液相色譜分析后繪制3種淋洗體系下的淋洗柱形圖，詳見圖3。

圖3 不同淋洗條件下淋洗柱形圖Fig.3 Elution column chart of different elution conditions

從圖3中可以看出，10mL正己烷+丙酮（90+10）淋洗液可以把2種農藥基本洗脫下來，5mL正己烷+丙酮（85+15）和正己烷+丙酮（80+20）淋洗液已完全把2種農藥洗脫下來，但是相對正己烷+丙酮（90+10）淋洗液，后兩種淋洗體系淋洗液的極性較強，容易洗脫出更多的色素和干擾雜質，所以本方法最終選擇正己烷+丙酮（90+10）作為淋洗液，淋洗液體積10mL。

2.3 洗脫程序的優化

在流速為1.0mL/min條件下，分別選擇流動相為乙腈+水（80+20）、乙腈+水（70+30）和乙腈+水（60+40）進行等度洗脫，取敵菌靈和異菌脲農藥混合標準溶液上機分析。從色譜圖中可以看出在乙腈+水（80+20）等度條件下，目標峰敵菌靈與溶劑峰有重疊，在乙腈+水（70+30）和乙腈+水（60+40）等度條件下，敵菌靈和異菌脲2種農藥能完全分離，出峰時間分別在6min和9min以內，但目標峰敵菌靈附近有干擾雜質峰，影響最終檢測結果。本方法選擇了梯度洗脫程序，目標峰與雜質峰完全分離，敵菌靈和異菌脲農藥標準溶液色譜圖見4，出峰時間為敵菌靈（8.97min），異菌脲為（11.63min），分離度大于1.5。

圖4 敵菌靈和異菌脲標準溶液色譜圖Fig.4 Chromatogram of anilazine and iprodione standard solution

2.4 線性方程與檢出限

在濃度為0.1mg/L～10.0mg/L范圍內，敵菌靈和異菌脲2種農藥標準溶液濃度與峰面積呈線性相關，線性關系良好，相關系數均大于0.999。線性方程分別為：Y=0.971 3X-0.001 4（r2=0.999 8）和Y=1.989 9X+0.131 5（r2=0.999 1），詳見圖5。

圖5 敵菌靈和異菌脲標準工作曲線圖Fig.5 The calibration curve of anilazine and iprodione

以3倍信噪比（S/N=3）為最低檢出限，敵菌靈和異菌脲的檢出限均為0.02mg/kg。

2.5 添加回收率與精密度

分別稱取黃瓜和番茄空白基質樣品25 g（精確至0.01 g），添加不同水平的敵菌靈和異菌脲農藥標準溶液，按上述樣品前處理方法進行樣品提取與凈化，液相色譜條件上機測定，每個添加濃度重復測定5次，計算添加回收率和相對標準偏差（RSD），結果見表2。

由表2可知，敵菌靈和異菌脲2種農藥的添加回收率在82.5%～102.8%之間，RSD在2.95%～8.68%之間，表明該方法具有良好的精密度和準確度，符合農藥殘留分析要求。

表2 回收率與精密度試驗（n=5）Table2 Recovery rate and precision test（n=5）

黃瓜空白樣品色譜圖和加標樣品色譜見圖6、圖7，番茄空白樣品色譜圖和加標樣品色譜見圖8、圖9。

圖6 黃瓜空白樣品色譜圖Fig.6 Chromatogram of cucumber blank sample

圖7 黃瓜加標樣品色譜圖Fig.7 Chromatogram of cucumber spiked sample

圖8 番茄空白樣品色譜圖Fig.8 Chromatogram of tomato blank sample

圖9 番茄加標樣品色譜圖Fig.9 Chromatogram of tomato spiked sample

從圖6、圖7、圖8、圖9中可以看出，在上述色譜條件下，色譜峰分離較好，無雜質干擾，能夠滿足日常快速檢測黃瓜、番茄中敵菌靈和異菌脲農藥殘留量。

3 結論

建立了采用固相萃取-高效液相色譜法同時測定黃瓜、番茄中敵菌靈和異菌脲農藥殘留量的方法，并優化了試驗條件。本方法敵菌靈和異菌脲2種農藥的添加回收率在82.5%～102.8%之間，RSD在2.95%～8.68%之間，精密度和準確度都較高，操作簡單快速、方法準確可靠，使用本方法完全可以滿足黃瓜、番茄中敵菌靈和異菌脲農藥殘留量的日常檢測需求。

[1]劉寧,李健,劉濤.食品中敵菌靈殘留分析研究進展[J].食品研究與開發,2007,28(11):155-157

[2]解永剛,吳小文,花日茂,等.平菇及其培養料中異菌脲的殘留分析方法及消解動態研究[J].安徽農業大學學報,2011,38(6): 970-973

[3]中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會,中華人民共和國農業部.GB 2763-2014食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量[S].北京:中國標準出版社,2015:1-245

[4]趙子丹,牛艷,姜瑞,等.黃瓜及土壤中異菌脲殘留量的氣相色譜分析[J].湖北農業科學,2015,54(10):2483-2485

[5]李健,劉寧,陳平,等.食品中敵菌靈殘留量的HPLC測定方法研究[J].食品科學,2007,28(1):278-281

[6]吳春紅,聶繼云,李靜,等.基質分散固相萃取-高效液相色譜法測定水果中的異菌脲殘留量[J].食品科學,2009,30(14):188-190

[7]羅祎,李立,袁宗輝,等.糧谷中敵菌靈的GC-MS檢測方法研究[J].食品科學,2008,29(12):544-546

[8]胡珅,楊長志,魏冬旭,等.氣相色譜-質譜法測定植物源食品中異菌脲殘留量[J].檢驗檢疫學刊,2013,23(4):57-60

[9]郭藤,李娜,張洋,等.固相萃取-高效液相色譜法測定果蔬中異菌脲殘留量[J].分析試驗室,2014,33(7):860-863

[10]中華人民共和國農業部.NY/T 1277-2007蔬菜中異菌脲殘留量的測定高效液相色譜法[S].北京:中國農業出版社,2007:1-4

Determination of Anilazine and Iprodione Residues in Cucumber and Tomato by Solid Phase Extraction-high Performance Liquid Chromatography

XU Qiu-sheng，LIU Jun，HE Hui-lin，LI Chen-hao
（Pinghu Food and Drug Inspection Center，Pinghu 314200，Zhejiang，China）

To establish a solid phase extraction-high performance liquid chromatography（HPLC）method for simultaneous determination anilazine and iprodione pesticides residue analysis method in cucumber and tomato，the samples were extracted by acetonitrile homogenizing dehydration method，purified by solid phase extraction（SPE），while the concentrated liquid was separated and detected by liquid chromatography and quantified by external standard method.The added recovery experiments were also carried out in which the added concentration was 0.1，0.5，1.0mg/kg respectively，2 kinds of pesticides anilazine and iprodione rate of recovery was in the range of 82.5%to102.8%，the standard deviation（RSD）was in the range of 2.95% to 8.68%，the minimum detection limit of 0.02mg/kg.This method can meet the requirements of the determination for anilazine and iprodione pesticides residue in cucumber and tomato.

solid phase extraction；high performance liquid chromatography；cucumber；tomato；anilazine；iprodione

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.03.034

2016-05-20

徐秋生（1979—），男（漢），工程師，大學本科，研究方向：食品、農產品儀器分析與測試。