桑葚的提取及其自由基清除活性研究

劉茜，唐潔

（1.梧州學(xué)院化學(xué)工程與資源再利用學(xué)院，廣西梧州543002；2.桂林師范高等專科學(xué)校化學(xué)與工程技術(shù)系，廣西桂林541001）

桑葚的提取及其自由基清除活性研究

劉茜1，唐潔2，*

（1.梧州學(xué)院化學(xué)工程與資源再利用學(xué)院，廣西梧州543002；2.桂林師范高等專科學(xué)校化學(xué)與工程技術(shù)系，廣西桂林541001）

在超聲波輔助下，分別以無(wú)水乙醇、丙酮、蒸餾水為提取溶劑，對(duì)桑葚果實(shí)進(jìn)行提取，濃縮后分別得無(wú)水乙醇提取物AE，丙酮提取物EE，蒸餾水提取物WE，通過(guò)測(cè)定提取物對(duì)DPPH·、ABTS+·、·OH的清除作用評(píng)價(jià)桑葚的抗氧化活性。提取物AE、EE、WE對(duì)DPPH·的IC50分別為0.173、0.18、0.19mg/m L；對(duì)ABTS+·的IC50分別為0.044、0.052、0.06mg/mL；對(duì)·OH的IC50分別為0.67、0.83、1.02mg/mL。提取物清除DPPH·、ABTS+·、·OH的IC50值均遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于10mg/mL，表明桑葚提取物具有良好的自由基清除活性。試驗(yàn)表明溶劑對(duì)提取物清除自由基的活性有一定影響。

桑葚；DPPH·；ABTS+·；·OH；自由基清除活性

自由基指獨(dú)立存在的帶有未成對(duì)電子的基團(tuán)，是人體進(jìn)行生命活動(dòng)時(shí)所產(chǎn)生的一種活性分子，其在機(jī)體的新陳代謝中發(fā)揮重要的機(jī)能調(diào)節(jié)平衡作用[1-2]。自由基與癌癥、心血管疾病、機(jī)能器官老化等存在密切的聯(lián)系[1-3]，若體內(nèi)產(chǎn)生或存在過(guò)多的自由基，會(huì)引起蛋白質(zhì)、核酸（DNA）變性，從而導(dǎo)致細(xì)胞和組織器官損傷，加速機(jī)體的衰老進(jìn)程并誘發(fā)各種疾病[1-3]。及時(shí)補(bǔ)充自由基清除劑或抗氧化劑可抑制或減少自由基的產(chǎn)生和堆積，起到防御、抵抗疾病和延緩衰老的作用[1-3]。在提倡綠色、安全的保健品的當(dāng)今社會(huì)，高效、無(wú)毒的自由基清除劑的研發(fā)無(wú)疑更符合人民大眾的要求[4]，而從可食用的水果或中草藥中提取是其中的有效途徑之一。

桑葚為桑科植物桑的果穗，又名桑果。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為，桑葚性寒、味甘，具有滋陰、補(bǔ)血、明目、烏發(fā)養(yǎng)顏、治療失眠和神經(jīng)衰弱、抗疲勞、防治便秘等功效，長(zhǎng)期食用桑葚可以延年益壽[5-7]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，桑葚具有增強(qiáng)免疫功能、促進(jìn)造血細(xì)胞的生長(zhǎng)、防止人體動(dòng)脈硬化等功效，還具有抗誘變、抗病毒、抗氧化和延續(xù)衰老等作用[8-10]，同時(shí)，桑葚中富含多酚類，尤其是花色苷類成分及維生素類等，這為桑葚作為天然無(wú)毒自由基清除劑或抗氧化劑開發(fā)利用提供了理論參考。為了綜合考察提取溶劑對(duì)桑葚提取物的自由基清除活性的影響，本文以水、乙醇、丙酮等不同溶劑對(duì)桑葚進(jìn)行提取，并對(duì)提取物的自由基清除能力進(jìn)行測(cè)試，旨在為進(jìn)一步研究桑葚有效成分的自由基清除活性和抗氧化活性奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

桑葚，采摘于桂林師范高等專科學(xué)校植物園。

本試驗(yàn)所用的水均為二次蒸餾水，DPPH·和ABTS+·購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，其他試劑均為分析純。

JBT/FCT型釜罐式超聲波提取設(shè)備：山東濟(jì)寧金百特電子有限公司；AR-1140/C型電子分析天平：美國(guó)Ohaus公司；KQ5200-B型超聲波清洗機(jī)：鄭州南北儀器設(shè)備有限公司；RE501型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：常州諾基儀器有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式真空泵：江蘇金壇市華歐實(shí)驗(yàn)儀器廠；TU-1901雙光束紫外可見分光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 桑葚果實(shí)提取物的制備

稱取3份50.0 g新鮮的桑葚果實(shí)，打漿后分別加入無(wú)水乙醇、丙酮、蒸餾水200mL，常溫下于超聲波輔助提取40min，過(guò)濾提取溶液，減壓濃縮濾液，分別得紅色膏狀提取物AE、EE和WE。

1.3 桑葚提取物對(duì)DPPH·自由基清除活性測(cè)試

桑葚提取物DPPH·自由基清除活性的測(cè)定參考文獻(xiàn)[11]，配制系列質(zhì)量濃度的桑葚提取物溶液，將提取物溶液與DPPH·溶液混合反應(yīng)30min后立刻測(cè)其在波長(zhǎng)為517 nm下的吸光度，并制DPPH·自由基清除率對(duì)提取物濃度溶液濃度曲線式，在此基礎(chǔ)上，計(jì)算出提取物清除DPPH·50%的質(zhì)量濃度（IC50）。

1.4 桑葚提取物對(duì)ABTS+·自由基清除活性測(cè)試

桑葚提取物ABTS+·自由基清除活性的測(cè)定參考文獻(xiàn)[12]，配置ABTS+·標(biāo)準(zhǔn)液（50mL，2mmol/L，pH 7.4磷酸緩沖溶液定容），將此溶液與K2S2O8水溶液（200mL，70mmol/L）充分混合后在暗處放置15h～16h，測(cè)定前用蒸餾水將混合液的吸光度稀釋到0.700± 0.030左右（734 nm）作為ABTS+·儲(chǔ)備溶液，用于與提取物溶液反應(yīng)。取此液1.9mL和提取物溶液0.1mL在室溫下混合3min，在波長(zhǎng)為734 nm下測(cè)定其吸光度，并制ABTS+·清除率對(duì)提取物濃度溶液濃度曲線式，并計(jì)算出提取物清除ABTS+·50%的質(zhì)量濃度（IC50）。

1.5 桑葚提取物對(duì)·OH自由基清除活性測(cè)試

羥自由基（·OH）是目前所知活性氧中對(duì)生物體毒性最強(qiáng)、危害最大的一種自由基。桑葚提取物對(duì)·OH自由基清除作用的測(cè)定參考文獻(xiàn)[13]，配制系列質(zhì)量濃度的桑葚提取物溶液與利用Fenton試劑產(chǎn)生的·OH自由基作用，清除率根據(jù)Fenton反應(yīng)的方法建立測(cè)試的反應(yīng)體系，依據(jù)下式進(jìn)行計(jì)算：

式中：Sc為清除率；A0為空白對(duì)照液吸光度；AX為加入樣品液后的吸光度；Ax0樣品本身的吸光度。分別測(cè)試各溶液在波長(zhǎng)為510 nm下的吸光度，并制·OH清除率對(duì)提取物濃度溶液濃度曲線式，計(jì)算出提取物清除·OH50%的質(zhì)量濃度（IC50）。

2 結(jié)果與討論

抗氧化劑對(duì)DPPH·、ABTS+·和·OH的清除能力，是衡量其抗氧化能力的重要指標(biāo)，而清除自由基的半抑制劑量IC50，常用于評(píng)估抗氧化劑清除自由基的活性。IC50值越小，自由基清除活性越大，當(dāng)IC50小于10mg/mL時(shí)，則說(shuō)明抗氧化劑具有良好的自由基清除活性[14]。同時(shí)，化合物的IC50與標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑BHT（2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚）的IC50的大小做對(duì)比，也可說(shuō)明該抗氧化劑的活性和實(shí)際應(yīng)用前景。此外，探討溶劑效應(yīng)對(duì)抗氧化劑的自由基清除活性的影響，對(duì)準(zhǔn)確評(píng)估抗氧化劑的抗氧化活性以及合理利用抗氧化劑具有重要的指導(dǎo)意義，故我們對(duì)不同提取溶劑中桑葚果實(shí)提取物清除自由基的活性也進(jìn)行了比較。

2.1 桑葚提取物對(duì)DPPH·自由基的清除作用結(jié)果

DPPH·是一種穩(wěn)定的自由基，其在517 nm處的最大吸收波長(zhǎng)的吸光度會(huì)隨著自由基清除劑的加入而呈線性的下降，為此其常作為評(píng)價(jià)活性化物質(zhì)抗氧化能力的指標(biāo)。不同提取溶溶劑得到的提取物對(duì)DPPH·的清除效果可見圖1。

圖1 桑葚提取物對(duì)DPPH·自由基的清除作用Fig.1 The scavenging activities of mulberry extracts on DHHP·

從圖1可知，桑葚提取物EE、AE和WE的對(duì)DPPH·的IC50分別為0.17、0.18、0.19mg/mL，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于標(biāo)準(zhǔn)值10mg/mL，也遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于標(biāo)準(zhǔn)的抗氧化劑BHT的IC50值14.50mg/mL，說(shuō)明3個(gè)提取物均具有良好的清除DPPH·活性，清除活性順序?yàn)镋E>AE>WE。試驗(yàn)表明，3種溶劑提取得到的提取物清除DPPH·的IC50相差不大，說(shuō)明溶劑對(duì)提取物清除DPPH·的活性影響較小。

2.2 桑葚提取物對(duì)ABTS+·由基清除活性測(cè)試結(jié)果

物質(zhì)對(duì)ABTS+·的清除活性也是測(cè)量其抗氧化活性的一個(gè)重要指標(biāo)。桑葚提取物AE，EE和WE對(duì)ABTS+·也表現(xiàn)出良好的清除活性，各提取物對(duì)ABTS+·的清除效果見圖2。

圖2 桑葚提取物對(duì)ABTS+·自由基的清除作用Fig.2 The scavenging activities of mulberry extracts on ABTS+·

從圖2可知：桑葚提取物AE，EE和WE對(duì)ABTS+·也表現(xiàn)出良好的清除活性，其IC50值均遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于標(biāo)準(zhǔn)值10mg/mL和BHT的81.43mg/mL，分別為0.052、0.044、0.060mg/mL，清除活性順序?yàn)镋E>AE> WE。從試驗(yàn)結(jié)果可知，提取溶劑對(duì)提取物清除ABTS+·的活性有一定的影響。

2.3 桑葚提取物對(duì)·OH自由基清除活性測(cè)試結(jié)果

在對(duì)·OH自由基的清除活性測(cè)試中，我們也發(fā)現(xiàn)桑葚提取物具有良好的清除活性，不同提取溶溶劑得到的提取物對(duì)·OH的清除效果可見圖3。

圖3 桑葚提取物對(duì)·OH自由基的清除作用Fig.3 The scavenging activities of mulberry extracts on·OH

從圖3可知，3種提取物對(duì)·OH的清除活性的IC50值分別為0.67、0.83、1.02mg/mL，均低于標(biāo)準(zhǔn)值10mg/mL。實(shí)驗(yàn)表明，提取物對(duì)·OH的清除活性受提取溶劑影響較大，以乙醇為提取溶劑時(shí)，提取物對(duì)·OH清除活性最優(yōu)，丙酮次之，水提物的活性較差。

3 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明桑葚提取物對(duì)DPPH·、ABTS+·、·OH具有良好的清除活性。同時(shí)，提取溶劑對(duì)提取物清除自由基的活性有著重要的影響，本研究中，以乙醇為溶劑得到的桑葚提取物（EE）對(duì)DPPH·、ABTS+·、·OH表現(xiàn)出最好的清除活性。以上研究將為進(jìn)一步開展桑葚有效成分的抗氧化活性研究提供重要的指導(dǎo)意義。

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Extraction and Free Radical Scavenging Activities of Mulberries

LIU Qian1，TANG Jie2，*
（1.School of Chemical Engineering and Resource Recovery，Wuzhou University，Wuzhou 543002，Guangxi，China；2.Department of Chemistry&Pharmaceutical Science，Guilin Normal College，Guilin 541001，Guangxi，China）

Under ultrasound，mulberries were extracted with ethanol，acetone and water solvents to offer ethanol extract（AE），acetone extract（EE）and water extract（WE），respectively.Their free radical scavenging activities were respectively evaluated against DPPH，ABTS+and hydroxyl radicals.The IC50values of WE，EE and AE against DPPH·and ABTS+·were found to be 0.173，0.18，0.19mg/mL and 0.044，0.052，0.06mg/mL，respectively，while that of WE，EE and AE against OH-·free radical were 0.67，0.83，1.02mg/mL.The results showed thatall IC50of AE，EE and WE were much lower than the standard value 10mg/mL in these three assays，suggesting all these extracts displayed good radical scavenging activities.In addition，the extract solvents had important effect on their radical scavenging activities.

mulberry fruit；DPPH·；ABTS+·；·OH；free radical scavenging activities

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.03.040

2016-10-24

廣西高校中青年教師基礎(chǔ)能力提升項(xiàng)目（KY2016YB441）；梧州學(xué)院重點(diǎn)科研項(xiàng)目（2014B011）

劉茜（1975—），女（漢），講師，碩士，研究方向：天然產(chǎn)物的提取和活性研究。

*通信作者