曲安奈德藥物涂層可降解支架在兔膽管損傷動物模型的研究

宋 楠，夏醫君，王 烯，賈廣鵬，王 石*,謝忠士

(1.內蒙古醫科大學,呼和浩特010010;2.內蒙古自治區人民醫院 肝膽胰脾外科，呼和浩特010010;3.吉林大學中日聯誼醫院 胃腸結直腸外科，吉林 長春130033)

曲安奈德藥物涂層可降解支架在兔膽管損傷動物模型的研究

宋 楠1，夏醫君2，王 烯2，賈廣鵬2，王 石2*,謝忠士3*

(1.內蒙古醫科大學,呼和浩特010010;2.內蒙古自治區人民醫院 肝膽胰脾外科，呼和浩特010010;3.吉林大學中日聯誼醫院 胃腸結直腸外科，吉林 長春130033)

目的 觀察膽管內放置曲安奈德可降解膽道支架后膽管ɑ平滑肌肌動蛋白(ɑ-SMA)及轉化因子β1(TGF- β1)在兔膽管損傷動物模型修復期間的表達情況，研究應用曲安奈德藥物覆膜的可降解膽道支架在兔膽管損傷動物模型中抑制膽管炎性狹窄的機制。方法 通過兔膽管損傷動物模型將應用曲安奈德藥物涂層的可降解膽道支架和無曲安奈德涂層可降解膽道支架分別放置兔肝外膽管60只，平均隨機分成6組，選取放置膽道支架后第30天、60天、90天分別處死1組兔動物模型，取材兔損傷修復模型的膽管并且應用免疫組織化學的方法分別檢測ɑ-SMA和 TGF-β1蛋白的表達水平。結果 曲安奈德可降解膽道支架組兔膽管SMA-ɑ和 TGF-β1與無曲安奈德涂層可降解膽道支架組相比表達減弱，曲安奈德可降解膽道支架組兔膽管狹窄,發生比無曲安奈德涂層可降解膽道支架組低。曲安奈德可降解膽道支架組第30天與第90天二組有差異性統計學意義(P<0.05),無曲安奈德涂層可降解膽道支架組第60天與第90天組二組有差異性統計學意義(P<0.05)。結論 曲安奈德藥物覆膜可降解支架在兔膽管損傷動物模型修復期間膽管組織中ɑ-SMA和 TGF-β1兩種蛋白表達量降低，提示曲安奈德藥物覆膜可降解支架在抑制兔膽管損傷動物模型的炎性狹窄起到一定作用。

曲安奈德;可降解膽道支架;膽道 ɑ平滑肌肌動蛋白(ɑ-SMA);轉化因子β1(TGF-β1)

(ChinJLabDiagn,2017,21:0285)

膽管損傷的發生多見于醫源性損傷及外傷性膽管損傷，前者多見于各種開放性腹腔手術或腹腔的介入治療以及腹腔內膿腫或囊腫穿刺治療或病理診斷，上述操作過程中均有出現膽道損傷的可能，據統計腹部手術造成膽道損傷多發生于開放膽囊切除術，也有一部分發生于膽總管探查手術、針對肝臟實施的肝切除手術、胃的良惡性腫瘤實施胃大部切除術，胰腺的手術以及十二指腸的手術中也有發生膽道損傷的可能；肝臟腫瘤行肝動脈栓塞手術、肝移植手術可以并發膽管缺血性損傷，肝臟射頻消融可以導致膽道熱損傷等[1]。損傷后導致膽道狹窄目前是肝膽外科面臨的疑難問題，臨床表現為術后膽管瘢痕愈合和膽管狹窄，發生原因主要與膽管生物學特點有著密切關系。膽管系統分為肝內膽管和肝外膽管，膽管是由彈性纖維組成的管腔，在管腔內有膽汁及細菌的貯存，當發生損傷或感染后，可以刺激巨噬細胞游動聚集，多發生于膽管損傷愈合處，巨噬細胞可以合成大量的轉化因子β1(TGF-β1)，轉化因子β1作為媒介可以進一步促使粘膜下的纖維細胞發生轉化，從而出現大量具有活躍功能的成纖維細胞，成纖維細胞可以造成愈合處出現過的膠原合成，膠原作為瘢痕形成的主要成分在管腔內不規則聚集，肉眼表現為在膽管內的瘢痕形成。轉化因子β1(TGF-β1)作為刺激作為刺激因子能夠對成纖維細胞造成持續性影響，導致成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化明顯增多(MFB)。而在肌成纖維細胞(MFB)形成過程中，ɑ-SMA作為一種表達產物呈現明顯增多的表達，如果ɑ-SMA其作為MFB分化產物明顯增多，也提示肌成纖維細胞(MFB)生成過多。過多增多的肌成纖維細胞(MFB)進一步會導致膽管內瘢痕愈合。曲安奈德是臨床常用的糖皮質激素類藥物之一，其作用機制是抑制球蛋白、膠原酶抑制劑的生成，球蛋白、膠原酶抑制劑的減少導致膠原降解增加，膠原作為瘢痕形成的重要組成成分，可以明顯減少成纖維細胞的生成，進一步炎癥反應明顯降低，纖維細胞的彈性蛋白作為最產物合成量顯著降低。纖維細胞的彈性蛋白可以抑制成纖維細胞的凋亡和增殖，還可以明顯降低成纖維細胞的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原mRNA的產生，從而可以達到抑制瘢痕的形成和增生[2]。本實驗通過制作曲安奈德涂層多聚乳酸生物可降解膽道支架，并將其應用于兔膽管損傷動物模型，通過觀察ɑ-SMA和TGF-β1兩種蛋白在曲安奈德涂層多聚乳酸生物可降解膽道支架膽管損傷動物模型和無曲安奈德涂層多聚乳酸生物可降解膽道支架膽管損傷動物模型表達的情況，評價曲安奈德涂層多聚乳酸生物可降解膽道支架對醫源性膽管損傷后瘢痕形成情況，進一步探討其在損傷后炎性狹窄膽道中形成的作用機制，最終為臨床預防膽管損傷后治療過程中預防膽道狹窄提供更好的治療方法。

1 材料和方法

1.1 制備含有曲安奈德涂層的可降解多聚乳酸生物膽道支架

多聚乳酸生物為主要組成成分可降解膽道支架制作由長春生物應化所高分子材料系完成，聚乙醇酸-聚羥基乙酸( PLLGA)聚合是主要的材料。含有曲安奈德涂層的可降解膽道支架組成成分為曲安奈德粉末、聚乙醇酸-聚羥基乙酸PLLGA，將上述成分磨碎制作成細小顆粒形狀，按200 mg曲安奈德粉末，800 mg的聚乙醇酸-聚羥基乙酸PLLGA比例與曲安奈德粉末溶于共同溶劑20 ml的THF里面。最后將已經滅菌處理的事先制備的聚乙醇酸-聚羥基乙酸可降解膽道支架浸泡于剛剛制備的含有曲安奈德藥物涂層液體中，片刻后拿出，在30℃/0.1Mpa條件下的真空烘干箱內烘干達到衡定重量。無曲安奈德藥物涂層可降解膽道支架作為實驗的對照組，涂層材料配方為800 mg 的聚乙醇酸-聚羥基乙酸PLLGA比例與曲安奈德粉末溶于共同溶劑20 ml的THF里面，按照制作曲安奈德藥物涂層可降解膽道支架制作方法進行操作，最終制成無曲安奈德藥物涂層可降解膽道支架備用。

1.2 實驗動物及手術方式

雌雄各半的60只健康新西蘭白兔購置于內蒙古農業大學，體重(2±0.5 kg)。將60只健康新西蘭白兔隨機分成2組，分為曲安奈德支架組(實驗組)和裸支架組(對照組)，每組30只，分別于第30天、60天、90天分別處死曲安奈德支架組(實驗組)和裸支架組(對照組)各10只。麻醉應用腹腔注射氯胺酮的方法。待實驗動物被完全麻醉后，仰臥并固定四肢于動物手術臺，實驗動物腹部備皮，碘酒常規消毒后術區鋪無菌手術巾單。手術切口采用上腹正中切口，游離后完全暴露第一肝門部區域，顯示十二指腸韌帶。顯露十二指腸，并于十二指腸球部上方1.5 cm處將膽總管解剖出來，橫行切開膽總管前壁直徑的1/3-1/2，制作膽管損傷動物模型，勿超過膽總管的兩側緣。預先制備的含有曲安奈德涂層的可降解支架和無曲安奈德涂層的可降解支架放置于實驗動物模型的膽總管內，應用5-0可吸收縫線做間斷全層吻合，每針的距離為2-4 mm，每針距離邊緣距離為2-4 mm。

1.3 標本采集和相關指標檢查

曲安奈德涂層的可降解支架(實驗組)和無曲安奈德涂層的可降解支架組(對照組)分別于術后第30天、第60天、第90天分別處死各10只新西蘭白兔，采用上腹正中切口進入腹腔。入腹后肉眼觀察腹腔內術后粘連程度以及經過實驗縫合膽管的生長情況。用剪刀剪開膽管縫合口處觀察大體標本，收集縫合口及縫合口上、下各0.5 cm膽管組織，10%福爾馬林溶液常規固定，HE染色并針對ɑ-SMA、TGF-β1兩種蛋白應用免疫組織化學染色的方法進一步觀察二者的表達情況。ɑ-SMA一抗液試劑盒購置長春標新科技生物技術有限公司，操作步驟嚴格按照試劑盒說明進行操作。TGF-β1一抗液試劑盒購置Biovision公司，操作步驟嚴格按照試劑盒說明進行操作，通用型免疫組織化學二步法檢測試劑盒購置于長春標新科技生物技術有限公司，操作步驟嚴格按照試劑盒說明進行操作。

1.4 結果判定

2 結果

2.1 實驗動物大體組織形態學觀察

所有實驗組和對照組實驗動物均順利實施，術中麻醉效果佳，所有實驗組和對照組均無術中實驗動物的意外死亡。曲安奈德涂層的可降解支架組(實驗組)和無曲安奈德涂層的可降解支架組(對照組)動物術后全部恢復良好，無意外死亡，均未出現膽道梗阻及膽瘺發生。肉眼觀察術后30天曲安奈德涂層的可降解支架組(實驗組)和無曲安奈德涂層的可降解支架組(對照組)實驗動物可見膽管輕度水腫，膽道支架完整，并且位于膽管損傷縫合處無移動，損傷膽管良好愈合；肉眼觀察曲安奈德涂層的可降解支架組(實驗組)和無曲安奈德涂層的可降解支架組(對照組)實驗動物，術后60天可見預先留置的可降解膽道支架完全降解，實驗組吻合口未見狹窄，對照組膽管壁明顯增厚，吻合口可見狹窄，損傷處的近端膽管擴張；肉眼觀察曲安奈德涂層的可降解支架組(實驗組)和無曲安奈德涂層的可降解支架組(對照組)實驗動物，術后60天實驗組膽管無明顯擴張以及膽道狹窄的出現，對照組膽管壁增厚，吻合口明顯狹窄、損傷處的近端膽管擴張較為明顯。

2.2 兩組實驗動物ɑ-SMA表達情況 見表1。

表1 兩組實驗動物ɑ-SMA表達情況

表1結果提示，曲安奈德涂層的可降解支架組(實驗組)術后第30天、第60天、第90天蛋白ɑ-SMA陽性表達及面積評分低于無曲安奈德涂層的可降解支架組(對照組)，進一步發現術后第60天和第90天兩組的比較有統計學差異意義(P<0.05)。曲安奈德涂層的可降解支架組(實驗組)術后第90天與術后第30和第60天蛋白ɑ-SMA 陽性表達及面積評分結果的比較有統計學差異意義(P<0.05)。

2.3 兩組實驗動物TGF- β1表達情況 見表2。

表2 兩組實驗動物TGF- β1表達情況

表2結果提示，曲安奈德涂層的可降解支架組(實驗組)術后第30天、第60天、第90天TGF- β1陽性表達結果及面積評分的結果均低于無曲安奈德涂層的可降解支架組(對照組)，其中術后第60天和第90天兩組的比較有統計學差異意義(P<0.05)。曲安奈德涂層的可降解支架組(實驗組)術后第60天和第90天與術后第30天TGF- β1蛋白表達的 陽性結果及面積評分分布的的比較有統計學差異意義(P<0.05)。

3 討論

膽道損傷后膽管發生纖維化狹窄是肝膽外科術后出現的并發癥，也是肝膽外科醫生的棘手問題。組織修復過程中傷口收縮是正常和必然出現的情況。假如肉芽組織出現過多的增殖和過度的收縮，那么可以組織修復過程中傷口收縮會導致出現攣縮的瘢痕，進一步可以出現一定程度的功能障礙。隨著近年人們對肌成纖維細胞(MFB)與瘢痕攣縮二者關系進一步加深，可以明確肌成纖維細胞(MFB)可以導致瘢痕攣縮的發生[4]。

近年來，瘢痕組織內注射曲安奈德注射液，糖皮質激素類藥物之一即醋酸曲安奈德，可以用于治療瘢痕疙瘩，并起到很好的效果。在瘢痕組織內注射曲安奈德，不但能抑制膠原酶，而且還能抑制球蛋白抑制劑的分泌，而二者減少后可以導致膠原降解量的增加，膠原量減少的結果是導致成纖維細胞的增殖和膠原合成量減少，由于成纖維細胞的增殖和膠原合成量減少會抑制傷口的炎癥反應的發生，成纖維細胞分泌以及合成的彈性蛋白降低[5]。最終起到抑制成纖維細胞的凋亡和增殖的作用，纖維細胞的彈性蛋白可以抑制成纖維細胞的凋亡和增殖，還可以明顯降低成纖維細胞的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原mRNA的產生，從而可以達到抑制瘢痕的形成和增生，這就是曲安奈德治療瘢痕的作用機制，作為治療瘢痕的藥物曲安奈德，在報道中多用于皮膚的瘢痕治療，未見膽管損傷修復過程中用于對抗膽管纖維化狹窄的報道。

巨噬細胞可以合成大量的轉化因子β1(TGF- β1)幾年來很多實驗性研究表明，其在瘢痕增殖和修復過程中起著重要的角色作用，不但在器官損傷修復過程中，而且還在炎癥愈合過程中，以及組織發生纖維化的過程中的信號轉導均扮演著重要的角色[6]。由此可見在愈合組織的修復過程中的各個階段TGF- β1都是不可缺少的重要蛋白，進一步為受傷組織及器官修復提供必備的轉導信號及物質基礎，假如TGF- β1作為信號蛋白受到抑制、過度表達以及阻斷發生后，進一步就會出現不良的組織愈合或以至于瘢痕形成。有文獻報道，膽管損傷發生并行修復術后第3個月至第6個月之間，也就是常常稱為晚期的傷口愈合階段，檢測發生狹窄的膽管組織，免疫組化學提示該組織中TGF- β1蛋白的表達量明顯增高。這給筆者一個提示，如果能夠人為的減少膽汁對炎癥修復過程中刺激作用，就會降低修復過程中發生炎癥反應的數量和程度，那么也能起到抑制TGF- β1過度表達的情況，這樣就會為減少膽道損傷修復術后膽道瘢痕的過度增傷，同時也為預防膽管的言行狹窄提供理論基礎。我們的實驗基于上述的理論基礎，想應用含有曲安奈德涂層的多聚乳酸支架，這種生物支架不僅是可以完全降解的支架，還是以二氧化碳和水為最終降解產物的支架，這兩種產物絕對不可能對機體造成生物毒性，也明顯抑制局部炎癥反應的發生。作為膽管損傷后常規應用的“T”形硅膠引流管，不但可以對抗損傷修復后膽管的攣縮瘢痕的外界力，還能支撐吻合口避免狹窄，起到一定的支撐作用，幫助修復的吻合口愈合。我們應用的曲安奈德藥物涂層可降解支架具備所有“T”形硅膠引流管功效，而且它的優勢也很明顯，曲安奈德藥物涂層可以減少膽管修復組織與膽汁的接觸；曲安奈德藥物涂層的藥物在分解過程中釋放較為緩慢，最終可降解的支架完全降解后，緩慢緩釋的藥物效果也可以顯現出來，常規應用的“T” 形硅膠引流管術后一定時間內需拔除，拔除過程中可能會出現并發癥的發生，而可降解膽道支架避免了拔管的過程，有些病例應用金屬支架出現不良反應也得到避免。通過我們的研究表明，曲安奈德涂層的可降解支架組(實驗組)術后第30天、第60天、第90天TGF- β1陽性表達結果及面積評分的結果均低無曲安奈德涂層的可降解支架組(對照組)，其中術后第60天和第90天兩組的比較有統計學差異意義(P<0.05)。曲安奈德涂層的可降解支架組(實驗組)術后第60天和第90天與術后第30天TGF- β1蛋白表達的 陽性結果及面積評分分布的的比較有統計學差異意義(P<0.05)。提示作為曲安奈德藥物載體的可降解膽道支架的緩慢釋放有可能的機制是通過抑制過度表達TGF- β1蛋白量并且抑制TGF- β1蛋白的生物活性，最終可以起到抑制損傷膽管愈合過程中炎性纖維化和炎性狹窄的發生。

目前MFB的持續性增殖多發生于瘢痕的增生和炎性組織的纖維化持，我們也認為膽管損傷修復手術術后發生瘢痕性攣縮以及炎性狹窄的機制之一。成纖維細胞作為MFB的前體，而MFB作為產物使其在分化過程中會出現ɑ-SMA蛋白的表達，表達的ɑ-SMA蛋白在MFB分化過程中是標志性的產物，反過來提示如果ɑ-SMA蛋白的表達也代表MFB增殖明顯[7]。給我們的提示，如果應用免疫組織化學方法檢測膽管損傷修復組織中ɑ-SMA蛋白的表達量，也有著觀測MFB的在瘢痕愈合中的生物學作用和愈合周期。通過我們的研究表明，曲安奈德涂層的可降解支架組(實驗組)術后第30天、第60天、第90天蛋白ɑ-SMA陽性表達及面積評分高于曲安奈德涂層的可降解支架組(實驗組)，進一步發現術后第60天和第90天兩組的比較有統計學差異意義(P<0.05)。曲安奈德涂層的可降解支架組(實驗組)術后第90天與術后第30和第60天蛋白ɑ-SMA 陽性表達及面積評分結果的比較有統計學差異意義(P<0.05)，提示曲安奈德涂層的可降解支架可以起到成纖維細胞向MFB轉化的抑制作用。現今多項研究表明，曲安奈德作為糖皮質激素藥物，對瘢痕組織中ɑ-SMA蛋白表達控制的作用機制還不是很清楚，預測有可能與瘢痕組織中TGF- β1蛋白表達有一定的關系。ɑ-SMA蛋白在TGF- β1蛋白的影響下可以對肌成纖維細胞的增殖起到一定作用[7]，曲安奈德作為可降解的涂層，能夠進一步阻斷TGF- β1蛋白信號系統，起到ɑ-SMA蛋白量明顯減少的作用，ɑ-SMA可以抑制成纖維細胞轉化為MFB 的數量，由于數量減少進一步可以抑制MFB功能。轉化因子TGF- β1具備自分泌能力，通過這樣的方式可以促進TGF- β1mRNA 的產生以及蛋白的表達量和分泌量均增加明顯。炎性組織愈合過程中TGF- β1還可以加快成纖維細胞向MFB轉化的進程，由于MFB的增多，也會反過來刺激TGF- β1蛋白與膠原蛋白的生成量，這樣的正型作用機制可將TGF- β1蛋白的生成效應明顯擴大，損傷愈合的膽管發生纖維化增厚也就不可避免了，如果能通過干預TGF- β1蛋白的數量和生物學活性，之前的正性作用被抑制，為膽管損傷愈合過程中抑制纖維化及炎性狹窄的發生提供一定的條件。

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Effect of Triamcinolone-eluting biodegradable stent in leporine bile duct after injury

SONGNan1,XIAYi-jun2，WANGXi2,etal.

(1.InnerMongoliaMedicalUniversity,InnerMongoliaAutonomousRegion,Hohhot010010,China;2.DepartmentofHapatopancreatobiliarySurgery,People’sHospitalofInnerMongoliaAutonomousRegion,InnerMongoliaAutonomousRegion,Hohhot010010,China;3.DepartmentofColorectal&AnalSurgery，China-JapanUnionHospitalofJilinUniversity，Changchun130033，China)

Objective To investigate the effect of a biodegradable triamcinolone-eluting biliary polylactide stent on the expression -smooth muscle actin(ɑ-SMA)and transforming growth factor-bata1( TGF-β1) in leporine bile duct after injury.Methods The triamcinolone-eluting biliary polylactide stents were prepared by immersion method.A leporine bile duct injury model was established.Triamcinolone-eluting biliary polylactide stents were surgically inserted in the bile duce of 30 leporines in experimental group,while biodegradable without triamcinolone stent were placed in 30 leporines of control group.Animals were sacrificed 30,60,90 days after operation.The wound healing of common bile duct was observed.The expression of ɑ-SMA and TGF-β1was detected with immunohistochemical methon.Results The ɑ-SMA and TGF-β1were expressed lower than those in control group(P<0.05).In experimental group,the ɑ-SMA and TGF-β1were expressed lower than those in control group on 30 days and 90 days(P<0.05).In control group,the ɑ-SMA and TGF-β1were expressed higher than those in experimental group on 60 days and 90 days(P<0.05).Conclusion Local delivery of triamcinolone via a biodegradable stent can decrease the expression of ɑ-SMA and TGF-β1in healing process of injuried leporine bile duct,which may be potentially relieve the biliary stricture.

Triamcinolone Eluting stents Billiary tract ɑ-SMA TGF-β1

內蒙古自治區自然科學基金(編號：2013MS11124)，內蒙古自治區人民醫院博士科研啟動資金(編號：BS201503)

1007-4287(2017)02-0285-05

R657.4

A

宋楠，內蒙古醫科大學碩士研究生(在讀);王石，內蒙古自治區人民醫院主任醫師，碩士研究生導師，肝膽胰脾外科，擅長肝、膽、胰、脾疾病的診斷及微創治療;謝忠士，吉林大學中日聯誼醫院胃腸結直腸外科，副主任醫師，碩士研究生導師，擅長胃腸、結直腸疾病診斷及微創治療。

2016-10-20)

*通訊作者