替加環(huán)素對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜影響的研究

呂月賢，金玉芬，于 庭

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130041)

*通訊作者

替加環(huán)素對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜影響的研究

呂月賢，金玉芬，于 庭*

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130041)

細(xì)菌生物膜(bacterial biofilm,BF)是細(xì)菌在生長(zhǎng)過程中為適應(yīng)生存環(huán)境而吸附于惰性或活性材料表面形成的一種與浮游細(xì)胞(planktoniccell)相對(duì)應(yīng)的生長(zhǎng)方式，當(dāng)細(xì)菌受到各種壓力時(shí),如極端的營(yíng)養(yǎng)缺乏或過剩、抗生素和抗菌劑、氧化、低 pH值等,大量細(xì)菌為了對(duì)抗不利的環(huán)境,通過自身合成的水合多聚物粘附在固體表面,并在胞外聚合物中生長(zhǎng)繁殖而形成的細(xì)菌群落[1，2]。 多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌(Multiple drug resistant Acinetobacter Bauman,MDR-Ab)是一種條件致病菌，普遍存在于自然界和人體，是醫(yī)院感染最常見的機(jī)會(huì)致病菌之一，近年來在臨床分離的致病菌中鮑曼不動(dòng)桿菌逐年增多。目前臨床上對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥性關(guān)注逐年增加,除了高水平的抗菌素耐藥性， 最近的一些研究表明，某些MDR鮑曼不動(dòng)桿菌菌株可形成大量生物膜，且這種細(xì)菌一旦形成生物膜,就難以清除,導(dǎo)致嚴(yán)重的臨床問題以及宿主免疫系統(tǒng)缺失[3-5]。本實(shí)驗(yàn)主要研究亞抑菌濃度替加環(huán)素對(duì)MDR-Ab菌生物膜的破壞作用，從而為耐藥菌引起的感染性疾病提供了臨床治療的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 替加環(huán)素,批號(hào):#B1527011,購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；結(jié)晶紫，批號(hào)：20141202，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司； 0.9%生理鹽水，批號(hào)：H13023200,購(gòu)自石家莊四藥有限公司；胰蛋白胨大豆肉湯(TSB),批號(hào)：1361046，購(gòu)自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 儀器 24孔和96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，上海阿拉丁生物科技有限公司；細(xì)菌生物膜載體(直徑14 mm細(xì)胞爬片)，上海阿拉丁生物科技有限公司；多功能酶標(biāo)儀,Termo Scientific； 電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；共聚焦倒置顯微鏡，OLYMPUS。

1.1.3 菌株 收集自吉林大學(xué)第二醫(yī)院2015年4-12月份臨床微生物室送檢的80份標(biāo)本(其中同一患者感染部位的相同菌株剔除掉),經(jīng)法國(guó)梅里埃VIKET2全自動(dòng)微生物分析儀進(jìn)行菌種鑒定和藥敏檢測(cè)鑒定為MDR-Ab菌。

1.2 方法

1.2.1 藥敏試驗(yàn) 聯(lián)合采用VIKET2全自動(dòng)微生物分析儀和紙片擴(kuò)散法對(duì)菌株進(jìn)行藥敏鑒定，結(jié)果按美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI)抗菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)指南判別，鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)頭孢菌素類(如頭孢他啶或頭孢吡肟)、碳青霉烯類(如亞胺培南)、β-內(nèi)酰胺酶抑制劑(如頭孢哌酮/舒巴坦)、氟喹諾酮類(如環(huán)丙沙星)和氨基糖苷類(如阿米卡星)中的3類或3類以上抗菌藥物耐藥即判別為MDR-Ab菌。

1.2.2 目標(biāo)菌的復(fù)蘇 將保存在EP管中的目標(biāo)菌于-20℃冰箱中取出，加入1 ml TSB肉湯培養(yǎng)基，振蕩混勻，將目標(biāo)菌接種至血平板和麥康凱培養(yǎng)皿中，于35±2℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.2.3 測(cè)定替加環(huán)素的最低抑菌濃度(MIC) 采用微量肉湯稀釋法測(cè)定替加環(huán)素對(duì)MDR-Ab菌株的MIC 將復(fù)蘇后傳第一代的目標(biāo)菌稀釋至106CFU/mL,于96孔板15個(gè)孔中均加入100 μl MH肉湯,第一個(gè)孔中加入100 μl 1024 μg/mL替加環(huán)素，參照美國(guó) 2012CLSI所制定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行微量肉湯稀釋法倍比稀釋，再在每孔中加入100 μl上述稀釋濃度的目標(biāo)菌稀釋液,每株菌設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，并設(shè)置空白對(duì)照組 (MH肉湯培養(yǎng)基 100 μl)作為對(duì)照。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 20 h,記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以在小孔內(nèi)完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低濃度為 MIC。

1.2.4 結(jié)晶紫半定量法測(cè)定目標(biāo)菌株生物膜形成水平 目標(biāo)菌株生物膜的制備 挑取單個(gè)菌落的目標(biāo)菌4-5個(gè)接種至TSB肉湯中，35±2℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h取出，調(diào)整菌液濃度為5×105CFU/mL.無菌 24孔板中加入上述濃度的菌液 600 μl，每株菌3個(gè)復(fù)孔，并設(shè)置陰性對(duì)照孔,35±2℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液,3 d后在玻片表面形成成熟生物膜。

結(jié)晶紫半定量染色法測(cè)定生物膜 玻片經(jīng)0.9% NaCl 漂洗，用 0.1%的結(jié)晶紫染色20 min后，用自來水沖洗去除多余的染液，再加入400 μl 95%乙醇洗脫下生物膜上的結(jié)晶紫，最后從洗脫液中取出 200 μl至96孔板中，于多功能酶標(biāo)儀570 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定每株細(xì)菌染色后的OD值,每株菌所測(cè)OD值得均值為A，陰性對(duì)照組所測(cè)OD值均值為Ac，比較樣本A與Ac。根據(jù)OD值，將菌株生物膜形成能力分為4類：A≤Ac為陰性(-)；Ac4Ac為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

1.2.5 替加環(huán)素對(duì)目標(biāo)菌生物膜的影響 替加環(huán)素破壞成熟生物膜 將0 mg/L(陰性對(duì)照組),0.5 mg/L,1 mg/L,2 mg/L四個(gè)不同濃度的替加環(huán)素作用于已形成成熟生物膜的鮑曼不動(dòng)桿菌分為a,b，c，d四組，按照1.2.4所述，先于24孔板中形成成熟的生物膜，再在已成膜的孔中加入上述不同濃度的替加環(huán)素,35±2℃恒溫培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)48 h、96 h后，分別取出,酶標(biāo)儀半定量測(cè)定生物膜OD值,并記錄數(shù)據(jù)。

1.2.6 生物膜形態(tài)的觀察 觀察不同亞抑菌濃度的替加環(huán)素對(duì)已經(jīng)形成成熟生物膜破壞情況 按上述所述方法在24孔板中形成成熟的生物膜,再在有膜的孔中分別加入600 μl上述不同亞抑菌濃度的替加環(huán)素,35±2℃恒溫培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)48 h、96 h后，分別取出，共聚焦倒置光學(xué)顯微鏡下觀察鮑曼不動(dòng)桿菌的破膜情況。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù),采用單因素的方差分析，分析四組不同條件下所測(cè)OD值之間是否具有顯著性差異，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌耐藥表型測(cè)定結(jié)果

80株鮑曼不動(dòng)桿菌均為多重耐藥菌,其中有18株菌對(duì)復(fù)方新諾明、左氧氟沙星敏感,9株菌僅對(duì)復(fù)方新諾明敏感，其余對(duì)5類抗菌藥物全耐藥。

2.2 MIC測(cè)定值

替加環(huán)素對(duì)80株鮑曼不動(dòng)桿菌的MIC的檢測(cè)數(shù)據(jù)的范圍為0.5-4.0 mg/L，對(duì)多次測(cè)量所得的MIC測(cè)量值取平均值為2 mg/L。

2.3 生物膜半定量測(cè)定結(jié)果

80株菌中78株有形成生物膜能力(97.5%)，生物膜形成能力弱陽(yáng)性的菌株有8株(10%)，陽(yáng)性菌株48株(60%),強(qiáng)陽(yáng)性的菌株22株(27.5%),見表1。

2.4 替加環(huán)素對(duì)成熟生物膜的影響

a,b，c，d 4組不同條件下作用于鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜48 h和96 h所測(cè)OD值，見表2,3。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯示，各組之間兩兩進(jìn)行比較,結(jié)果顯示無論作用48 h還是96 h,b,c,d與a組之間比較均有顯著性差異(P48 h分別為0.000,0.000,0.006,P96 h均為0.000)，表明亞抑菌濃度下的替加環(huán)素具有破壞成熟生物膜的能力，而在b，c，d三組之間進(jìn)行比較時(shí)發(fā)現(xiàn)c,d兩組之間沒有顯著性差異(P48 h=0.094,P96 h=0.063)，b,c之間存在差異(P48 h=0.422,P96 h=0.378)，b,d之間存在顯著性差異(P48 h=0.001,P96 h=0.000)。即2 mg/L和1mg/L濃度的替加環(huán)素破壞生物膜的能力沒有差異，但均與0.5 mg/L濃度的替加環(huán)素破壞生物膜的能力有差異,且比其破壞能力強(qiáng),統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表4。

2.5 生物膜形態(tài)學(xué)觀察

用0.1%結(jié)晶紫染色，在共聚焦倒置顯微鏡下觀察不同亞抑菌濃度的替加環(huán)素對(duì)所形成的成熟的生物膜的破壞情況。結(jié)果顯示，總體趨勢(shì)為成膜細(xì)菌密度隨著替加環(huán)素濃度升高而降低，2 mg/L的替加環(huán)素所形成的細(xì)菌生物膜非常稀薄，細(xì)菌散在存在，而陰性對(duì)照組中所形成的細(xì)菌生物膜比較濃密，如圖1所示。

表2 亞抑菌濃度替加環(huán)素作用于成熟生物膜48 h的影響(OD值,±s)

表3 亞抑菌濃度替加環(huán)素作用于成熟生物膜48 h的 影響(OD值,

表4 單因素方差分析4組數(shù)據(jù)兩兩比較

注：均值差的顯著性水平為 0.05。

注：a、b、c、d依次為陰性對(duì)照、2 mg/L、1 mg/L、0.5 mg/L替加環(huán)素作用于成熟生物膜

圖1 替加環(huán)素對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌成熟生物膜的影響

3 討論

實(shí)驗(yàn)室的研究結(jié)果顯示，生物膜細(xì)菌對(duì)抗生素和殺菌消毒劑的抵抗力比浮游的非生物膜細(xì)菌強(qiáng)100-1000倍，因此細(xì)菌耐藥問題是目前人類面臨的最大生存危機(jī)[6]。 研究發(fā)現(xiàn),小劑量十四、十五環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類藥物如紅霉素、克拉霉素、羅紅霉素、阿奇霉素等，還有磷霉素均可破壞鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜結(jié)構(gòu)，敏感抗生素和小劑量大環(huán)內(nèi)酯類藥物聯(lián)用對(duì)于破壞鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜的結(jié)果效更理想[7]。乙醇、氯化鈉和大豆油、氯化十六烷吡啶結(jié)合，能破壞鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜。一些物理方法如電流、高頻脈沖、超聲震蕩法可以破壞成熟的鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜來提高抗生素對(duì)細(xì)菌的敏感性[8]。但目前國(guó)內(nèi)對(duì)于替加環(huán)素作用于生物膜的研究較少。

鮑曼不動(dòng)桿菌引起的院內(nèi)獲得性感染已成為患者高發(fā)病率和高病死率的主要原因之一，尤其是ICU和免疫力低下的患者[9]。目前鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥性逐年增加，且容易形成生物膜。本研究中的80株MDR-Ab中具有生物膜形成能力的菌株占97.5%，其中生物膜形成陽(yáng)性菌株占57.5%，強(qiáng)陽(yáng)性菌株占30%，這也間接說明了細(xì)菌多重耐藥的原因之一可能跟生物膜的形成有關(guān)。有學(xué)者認(rèn)為耐藥菌株多形成生物膜的原因可能是細(xì)菌對(duì)抗菌藥物壓力的選擇，同樣它也可以在生物膜的環(huán)境下獲得對(duì)多種抗菌藥物的耐藥性較高的定植能力與其對(duì)抗菌藥物的耐藥性有助于細(xì)菌本身的生存,但也有生物膜生成與細(xì)菌耐藥性呈負(fù)相關(guān)的報(bào)道[10，11]。目前對(duì)這一結(jié)論也只是推斷，尚無定論.另外細(xì)菌所形成生物膜除屏障作用外，它可以誘導(dǎo)機(jī)體補(bǔ)體的轉(zhuǎn)化，抑制中性粒細(xì)胞趨化，抵抗吞噬細(xì)胞吞噬,使得生物膜中的鮑曼不動(dòng)桿菌得以在藻酸鹽的庇護(hù)下生長(zhǎng)而不被清除，增強(qiáng)其抵御人體免疫防線的能力,當(dāng)機(jī)體的免疫力低下時(shí)，極易發(fā)生感染[12，13]。

以生物膜方式生存的細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性逐漸增強(qiáng)，針對(duì)生物膜的研究以試圖解決細(xì)菌耐藥性的問題已刻不容緩[14]。磷霉素具有破壞耐藥菌(包括鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌等)的生物被膜的功能和作用[15]。近年來單味中藥、中藥復(fù)方制劑、中藥有效成分單體及其衍生物都取得了一定成果，金銀花、五味消毒散、雙黃連、五倍子醇提取液、人參單體等有破壞生物膜的作用[16-18]。本實(shí)驗(yàn)則選用替加環(huán)素來破壞鮑曼不動(dòng)桿菌所形成的生物膜，通過酶標(biāo)儀所測(cè)得的生物膜的OD值和共聚焦倒置顯微鏡高倍鏡下觀察生物膜的形態(tài)兩種方式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)替加環(huán)素能夠破壞MDR-Ab所形成生物膜，且在亞抑菌濃度范圍內(nèi)破壞生物膜的能力呈現(xiàn)的趨勢(shì)為濃度越大,破壞作用越強(qiáng)，但二者之間并不呈絕對(duì)相關(guān)性。因?yàn)樵诒緦?shí)驗(yàn)中2 mg/L和1 mg/L濃度的替加環(huán)素組之間破壞生物膜的能力在統(tǒng)計(jì)學(xué)上并沒有顯示出顯著性差異(P48 h=0.094,P96 h=0.063),但兩者均與0.5 mg/L濃度的替加環(huán)素組在破壞生物膜能力上顯示有差異(P48 h=0.001,0.422,P96 h=0.000,0.378),且2 mg/L與0.5 mg/L濃度的替加環(huán)素破壞生物膜能力的差異性更顯著(P48 h=0.001,P96 h=0.000)，因此根據(jù)上述數(shù)據(jù)得出推論生物膜的破壞能力與替加環(huán)素的濃度呈正相關(guān)的趨勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)又進(jìn)行了替加環(huán)素作用前后生物膜形態(tài)變化的比較。通過鏡下觀察48 h和96 h破膜后的形態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)不加替加環(huán)素的陰性對(duì)照組形成的生物膜濃密，細(xì)菌密度大且聚集存在,最大濃度2 mg/L的替加環(huán)素作用組所形成的生物膜最稀薄，細(xì)菌散在分布,與上述所測(cè)得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)相吻合。綜上所述，替加環(huán)素具有破壞成熟生物膜的能力，且與亞抑菌濃度范圍內(nèi)的替加環(huán)素的濃度大小大致呈正相關(guān)性。近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，生物膜是鮑曼不動(dòng)桿菌的重要毒力因子，能黏附在各種醫(yī)療器械表面而致病[19,20]。在臨床上盡量不使用體內(nèi)留置性醫(yī)療裝置，例如導(dǎo)尿管、動(dòng)靜脈內(nèi)留針、各部位的引流管、氣管內(nèi)插管、接觸性眼鏡、人造血管、人造心瓣膜以及其他人造器官等。對(duì)于必須使用的病人應(yīng)盡量縮短使用時(shí)間或經(jīng)常更換，或者使用經(jīng)特殊理化方法制成的由抗細(xì)菌粘附生物材料構(gòu)成的導(dǎo)管，或使用含有抗菌物質(zhì)制成的導(dǎo)管[21]。Singh等發(fā)現(xiàn)乳鐵蛋白通過結(jié)合鐵離子使細(xì)菌進(jìn)入一種移動(dòng)狀態(tài)，在移動(dòng)時(shí)不易形成微菌落從而抑制BF發(fā)育，但BF一旦成熟，其作用也就不明顯了[22]。可見對(duì)形成生物膜的鮑曼不動(dòng)桿菌感染預(yù)防和治療是一項(xiàng)綜合且艱巨的任務(wù),對(duì)于生物膜在細(xì)菌耐藥中的作用以及生物膜所形成的機(jī)制仍需探索，本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)闡述了多重耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌可以形成生物膜及替加環(huán)素在亞抑菌濃度下可以破壞生物膜，為臨床上對(duì)抗細(xì)菌耐藥性提供理論依據(jù)。

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