人CD133基因及蛋白分子生物學(xué)研究進展

唐楠，雷德強，趙洪洋

·綜述·

人CD133基因及蛋白分子生物學(xué)研究進展

唐楠，雷德強，趙洪洋

Prominin-1是五次跨膜糖蛋白家族兩大成員之一。Prominin-1于1997年從小鼠神經(jīng)上皮干細胞中分離，因為它只位于細胞膜上突出的位置故名priminin，為“突出”之意。同年，細胞表面抗原AC133基于AC133單克隆抗體的使用被發(fā)現(xiàn)，且是人類發(fā)現(xiàn)的首個五次跨膜蛋白，而且人AC133實際上是小鼠Prominin-1的人同源蛋白，同源性達60%。該蛋白在2000年第七屆國際白細胞分化抗原工作組會議(mDAW)上被正式命名為CD133，AC133僅作為表位的名稱來使用。

1 CD133蛋白及其分布

CD133蛋白是人類發(fā)現(xiàn)的首個五次跨膜蛋白，分子量約為96.8kD，是一個由大約850個氨基酸組成的單肽鏈，起于胞外的N端，含五個跨膜結(jié)構(gòu)域，兩個巨大的胞外環(huán)，兩端較小的胞內(nèi)環(huán)，終于胞內(nèi)的C端。并且在兩個胞外環(huán)上各發(fā)現(xiàn)了4個潛在的糖基化位點。AC133單克隆抗體可能識別的就是某個被糖基化的表位，而且被糖基化后蛋白分子的分子量會增加20kD左右。故進行western blot時最后被AC133識別的CD133的條帶的分子量為120kD左右，即AC133抗原是一個相對分子量為120kD的糖基化蛋白。

CD133表達于多種組織的干細胞及前體細胞，如造血干細胞，神經(jīng)干細胞等；近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)在人類多種腫瘤中存在CD133+腫瘤干細胞，如膠質(zhì)瘤、室管膜瘤、前列腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、肝細胞癌、喉癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌及骨肉瘤等。

2 CD133基因及其表達的調(diào)節(jié)

人CD133基因位于4號染色體短臂1區(qū)5帶3亞帶2次亞帶(4p15.32)(NCBI gene 8842)，包含至少37個外顯子，超過150kb長度，并由5個啟動子控制其轉(zhuǎn)錄，屬于復(fù)雜性轉(zhuǎn)錄單位，即從一個基因轉(zhuǎn)錄時會產(chǎn)生幾種不同的成熟mRNA 。

CD133基因表達的調(diào)節(jié)主要位于轉(zhuǎn)錄起始處的調(diào)控，比如啟動子甲基化及組織特異性的啟動子活化，和轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控，主要指不同組織中存在不同的CD133mRNA剪接變體。在翻譯水平的調(diào)控目前研究尚不多。

2.1 CD133的轉(zhuǎn)錄前調(diào)控 CD133的轉(zhuǎn)錄起始由5個啟動子控制并受甲基化和組蛋白去乙?；{(diào)節(jié)。CD133基因5端有5個串聯(lián)的啟動子(P1、P2、P3、P4和P5)，在這些啟動子中都缺乏TATA盒并且其中3個(P1、P2和P3)位于CpG島中。而且，在體外實驗中P1和P2的甲基化可導(dǎo)致其失活。對其5端UTR的分析顯示這些它們的表達呈現(xiàn)組織特異性。例如：肝、腎、胰腺、胎盤、結(jié)腸可以同時檢測到表達外顯子1A和外顯子1B的mRNA；在腦、卵巢、嬰兒肝和小腸中只能檢測到表達外顯子1B的mRNA；而表達外顯子1D的mRNA僅能在睪丸中檢測到。由不同啟動子啟動的轉(zhuǎn)錄具有不同的轉(zhuǎn)錄起始點，而公用第二外顯子。

關(guān)于啟動子甲基化在調(diào)節(jié)CD133基因表達中的作用頗有爭議，在不同組織和細胞系中結(jié)果不盡相同。You等在一些結(jié)直腸癌的細胞系中證明了CpG島中啟動子的過度甲基化會導(dǎo)致CD133轉(zhuǎn)錄水平的抑制，而去甲基化可恢復(fù)大部分細胞系中CD133的表達，子宮內(nèi)膜癌的原代培養(yǎng)實驗中也有類似結(jié)果。而Davide[1]等人認為DNA甲基化對于CD133表達的調(diào)節(jié)作用僅限于細胞系，在良性和惡性的前列腺的原代培養(yǎng)中CD133的調(diào)節(jié)并不依賴于DNA甲基化而依賴于染色質(zhì)凝聚的動力學(xué)控制。近來又有實驗證據(jù)表明在卵巢癌細胞中CD133的表達是同時受甲基化調(diào)節(jié)和組蛋白去乙?；揎椪{(diào)節(jié)。

2.2 CD133的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控 繼1997年發(fā)現(xiàn)AC133分子(現(xiàn)稱為CD133)以來，2002又發(fā)現(xiàn)了AC133-2。與AC133-1一樣，CD133-2也可以被AC133的單克隆抗體識別，不同的是剪接方式，AC133-2的mRNA比AC133-1的mRNA少了外顯子3，少了27個核苷酸，因此編碼的蛋白僅有856個氨基酸，與AC133-1相比胞外的N端少了9個氨基酸。它們在人體不同組織中的分布不同，在人不同生長發(fā)育階段分布也不同。迄今為止被發(fā)現(xiàn)的CD133基因的剪接變體共有7種，為減少混淆統(tǒng)一認識，2007年Fargeas CA將它們以s為前綴冠名，根據(jù)成熟mRNA中外顯子3、9、19、25、26a/b、27和28的存在于否分別命名為s1、s2、s7、s9、s10、s11和s12[2]。不同的剪接方式最終影響的是開放性閱讀框，進而影響蛋白的氨基酸序列。不同的剪接變體之間除了外顯子3的存在與否，與其關(guān)聯(lián)的是胞外N端9個氨基酸的存在與否，其他的外顯子25、26、27、28的存在與否均影響的是胞內(nèi)的C端，進而可能影響的是與不同的胞內(nèi)蛋白相互作用。雖然關(guān)于CD133分子胞內(nèi)作用的信息和研究并不多但是仍然有一些有趣的發(fā)現(xiàn)。其他物種的CD133s3、s4、s5的C端末尾幾個氨基酸可能是Ⅱ類PDZ結(jié)合域配體，人類中存在的CD133s9的C端可能與Ⅲ類PDZ結(jié)合域配體相關(guān)，CD133s1、s2、s7、s8和s11的C端可能與Ⅰ類PDZ結(jié)合域配體有關(guān)[2]。

關(guān)于CD133分子的糖基化還有很多問題需要研究。確實在不同的發(fā)育階段以及不同的組織會有未被糖基化的CD133分子表達，但是糖基化的的調(diào)節(jié)尚不明了，但是有實驗證明胞外環(huán)的N-糖基化有助于AC133表位的表達和識別。目前已開發(fā)出針對兩種不同的糖基化表位AC133和AC141的單克隆抗體，并廣泛應(yīng)用于CD133表達的檢測。

2.3 其他調(diào)節(jié) 另外在肝癌細胞中CD133的表達還可能接受轉(zhuǎn)化生長因子β(Transforming Growth Factor β，TGF-β)的調(diào)節(jié)，TGF-β通過抑制DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶1(DNAmethyltransferase 1，DNMT1)和DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶3β(DNAmethyltransferase 3-β，DNMT3-β)表達來使CpG島上的P1去甲基化從而上調(diào)CD133的表達，這個過程是Smads途徑依賴的，即TGF-β受體被TGF-β激活后，Smad2和Smad3被磷酸化并結(jié)合成異源性二聚體，繼而轉(zhuǎn)位至細胞核內(nèi)調(diào)節(jié)下游基因轉(zhuǎn)錄[3]。

Fukamachi等[4]最近的實驗數(shù)據(jù)表明，在胃腫瘤細胞系中SOX17的表達與CD133的表達相關(guān)，而前者是維持自我更新能力和干細胞特性的重要轉(zhuǎn)錄因子，增強表達S0X17能導(dǎo)致CD133表達的增強，而用用RNA干擾技術(shù)減少SOX17的表達，發(fā)現(xiàn)CD133的表達隨SOX17表達的減少而減少，證明SOX17可能是控制CD133表達的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。

Campo等[5]發(fā)現(xiàn)在表達AC133表位的膠質(zhì)瘤細胞系中，氧分壓水平可能影響AC133表位的表達甚至CD133基因的轉(zhuǎn)錄翻譯。在缺氧參與的CD133表達調(diào)節(jié)中，缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia induced factor α，HIF-α)及SOX2起調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄作用[6]。

另外，Notch信號、Ras/ MEK/ERK信號通路和mTOR信號被阻斷時CD133表達下調(diào)及上調(diào)，證明可能CD133可能也是notch、Ras/ MEK/ERK、mTOR信號的下游基因[7]。

3 CD133相關(guān)生物學(xué)功能及其展望

盡管CD133被廣泛認為是各種組織干細胞及腫瘤干細胞的細胞膜表面標(biāo)記物并被用于干細胞的分離，盡管它的具體生物學(xué)功能并不清楚，但是若其功能缺失將導(dǎo)致視網(wǎng)膜變性和骨骼肌萎縮。輸入從血液中分離的CD133+細胞可以治療肌萎縮，而且CD133+的骨髓干細胞移植有望改善移植效果，且提高梗死心肌的功能[7]。鑒于CD133有以下特點：總是位于細胞突起處，與膜小體和膽固醇膜蛋白有關(guān)，一些不同剪接變體具有不同的胞內(nèi)C端等，基于目前對CD133結(jié)構(gòu)的分布及其他相關(guān)的研究推測CD133可能具有以下功能。

3.1 調(diào)節(jié)細胞增殖及分化[8-9]實驗表明在多種組織及細胞系中CD133+的細胞具有更強的致瘤性和轉(zhuǎn)移能力，提示在這些組織及細胞系中CD133可能是一個很有用的干細胞標(biāo)記物。CD133之所以能維持干細胞自我更新及增殖能力，可能是通過調(diào)節(jié)某些信號通路如p38MAPK及P13k/Akt途徑、NOTCH信號影響下游基因的表達，從而抑制細胞的分化。因CD133剪接變體分布存在組織特異性，以及在發(fā)育的不同階段同一器官可能轉(zhuǎn)錄出兩種不同的CD133mRNA，提示CD133可能在細胞的分化中起重大作用。

3.2 參與神經(jīng)髓鞘形成[10]雖然對于人的CD133與髓鞘形成的關(guān)系目前尚無報道但在對小鼠CD133分布研究中發(fā)現(xiàn)，CD133僅位于神經(jīng)系統(tǒng)中的髓鞘，而且在髓鞘缺失的小鼠中CD133的表達大大降低以至低于檢測下限。因為髓鞘富含脂質(zhì)，尤其是膽固醇、鞘糖脂、半乳糖腦苷脂以及半乳糖硫酸腦苷脂，CD133可能為膠質(zhì)細胞的質(zhì)膜生長提供脂質(zhì)機構(gòu)，尤其是膜膽固醇，而后者是CD133的交互作用分子。或者CD133可能是作為一類新的粘附分子，用它兩個巨大的胞外糖基化環(huán)通過嗜同或是嗜異的交互作用在髓鞘緊縮或軸突形成中起重要作用。

3.3 參與糖、鐵代謝調(diào)節(jié)和細胞骨架改變[11]一篇2007年的論文表明不僅高糖培養(yǎng)能上調(diào)CD133的表達并降低其磷酸化程度，而且超量的表達CD133能夠促進細胞攝入葡萄糖，在MDCK細胞(Madin-Darby Canine Kidney Cells,MDCK細胞)中表達CD133能夠明顯改變其形態(tài)學(xué)和促進其遷移能力。尚有報道CD133參與攝入轉(zhuǎn)鐵蛋白以及鐵代謝。

3.4 參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[2]雖然關(guān)于CD133胞內(nèi)作用分子目前尚無研究，但是不同的剪接變體之間胞內(nèi)C端的差異著實可能與胞內(nèi)信號有關(guān)，例如s3、s4和s5變體C端末位的4個氨基酸，HFTL符合PDZ第二類結(jié)構(gòu)域配體的結(jié)構(gòu)特點，盡管這幾種變體在人類中并不存在；s9變體在人體中存在，其C端末尾4個氨基酸為SVQC符合第三類PDZ結(jié)構(gòu)域配體的特點，而s1、s2、s7和s11在人體中均存在，它們C端的末4位氨基酸符合第二類PDZ結(jié)構(gòu)域配體的結(jié)構(gòu)特點，雖然CD133也就是Prominin-1在胞內(nèi)蛋白相互作用上尚無重大發(fā)現(xiàn)，但是與它同是五次跨膜蛋白家族的另一成員Prominin-2被證實能與一類新發(fā)現(xiàn)的谷氨酸受體交互蛋白結(jié)合，而后者具有PDZ結(jié)合域。但CD133是否與含有PDZ結(jié)合域的蛋白相互作用還有待進一步證實。

3.5 參與腫瘤細胞抗藥性調(diào)節(jié)[12]過表達CD133的C6膠質(zhì)瘤細胞能夠抵抗化療藥誘導(dǎo)的細胞凋亡，并且上調(diào)ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白的表達，而后者常通過主動轉(zhuǎn)運方式參與腫瘤細胞耐藥機制。CD133可能通過PI3K-Akt-NF-κB信號通路調(diào)節(jié)多重耐藥基因(multidrug resistant gene 1 ，MDR1)的表達，并誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤對化療藥物的抵抗；CD133靶向治療可增強膠質(zhì)瘤的化療療效[13-14]。

4 與CD133相關(guān)的臨床應(yīng)用

CD133在其在膠質(zhì)瘤的高表達常提示膠質(zhì)瘤的不良預(yù)后，尤其對于高級別膠質(zhì)瘤更是如此，P2啟動子低甲基化導(dǎo)致CD133超表達可能與膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)相關(guān)[15-18]。CD133靶向治療可增強膠質(zhì)瘤的化療療效，靶向CD133的相關(guān)信號通路如EGFR通路、細胞自噬通路可改善相關(guān)腫瘤的治療效果[19-20]。

5 展 望

盡管人們對于CD133功能有以上猜測，但實際上對其功能的研究尚待進一步探討。例如根據(jù)目前的研究發(fā)現(xiàn)CD133+的細胞較CD133-的細胞具有更強的增殖及自我更新能力，以及可能通過p38MAPK及P13k/Akt途徑調(diào)節(jié)在NB細胞系及原代膠質(zhì)瘤細胞中調(diào)節(jié)細胞分化。但CD133促進細胞增殖、調(diào)節(jié)細胞分化以及腫瘤細胞抗藥性的機制目前尚不清楚，CD133的配體也尚未找到，而且CD133基因上游調(diào)控通路及下游作用通路還不太明確，啟動子活化以及mRNA剪接的機制也不明了，以及對于CD133蛋白合成后被轉(zhuǎn)運至細胞突出部位的機制了解也很少，CD133為何呈現(xiàn)組織特異性表達，故關(guān)于CD133還有很多問題待探討。本文就CD133蛋白的結(jié)構(gòu)、表達調(diào)控，生物功能及臨床相關(guān)應(yīng)用進行了綜述，若上述問題得到明確解答，干細胞移植，神經(jīng)及其他組織再生，腫瘤的基因治療和化學(xué)治療將會獲得重大突破。

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(收稿2017-01-04 修回2017-03-12)

國家自然科學(xué)基金(81301051)

430022 武漢，華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)外科

雷德強

10.3969/j.issn.1672-7770.2017.04.021

R730.2

A

1672-7770(2017)04-0318-03