骨髓間充質干細胞來源外泌體與血液病診斷

杜 雪，郝夢哲，王 昶，夏 薇*

（1.北華大學醫學檢驗學院，吉林 吉林 132013；2.吉林市中心醫院，吉林 吉林 132001）

骨髓間充質干細胞來源外泌體與血液病診斷

杜 雪1，郝夢哲1，王 昶2，夏 薇1*

（1.北華大學醫學檢驗學院，吉林 吉林 132013；2.吉林市中心醫院，吉林 吉林 132001）

骨髓間充質干細胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC）外泌體是由BMSC分泌的囊泡物質，含多種生物活性物質，參與多種信息傳遞和調控，在血液病的發生發展中起重要作用。對其深入研究，可對血液病的診斷、監測和治療提供實驗依據。本文對BMSC來源外泌體檢測及外泌體與血液病診斷進行綜述。

間充質干細胞；血液病；外泌體；診斷

血液病在臨床診斷上常檢查血常規、骨髓細胞分析及骨髓病理活檢等方法，而疑難血液病的骨髓細胞分布情況常給檢驗者帶來診斷困難，多部位多次骨髓穿刺又會給患者帶來極大痛苦。MSC源外泌體通過囊泡內外的信號分子在微環境中相鄰細胞間進行信息交流，可以控制疾病進展，促進組織修復和免疫調節，在臨床明確診斷和及時治療方面有更深刻的研究意義。

1 外泌體

外泌體是多種細胞釋放的內含多種生物活性物質的磷脂雙層膜球形顆粒。在生理或病理條件下，MSC可分泌大小一致的外泌體，直徑約40～100 nm的膜囊泡體。外泌體由細胞內陷成細胞內小體，在內吞體轉運復合體及相關蛋白的調控下形成多囊泡體，在蛋白受體調節后經胞吐將多囊泡體分泌至胞外，參與細胞間的信息交流。目前外泌體分辨出近萬種蛋白質ezrin、Tsg101、alix、Flotillin、Hsp70和多種Rab蛋白等，還含有大量核酸RNA，miR-711、miR-92a、miR-10a、miR-15a、miR-146a等。含核酸豐富的外泌體主要傳遞遺傳信息，而核酸含量低的外泌體則會引起免疫反應。外泌體中miRNA和蛋白質的種類及數量可作為判定疾病的重要指標。

外泌體源性miRNA是一類長度為18～25 nt的小分子非編碼RNA，其生物學性質穩定，作用于轉錄后水平的表達，將RNAs及其翻譯產生的蛋白輸送到靶細胞，調控細胞增殖與凋亡。外泌體中的tRNA片段（30～55nt）是抑制蛋白質翻譯的潛在調制器，對MSC外泌體及干細胞相關的分類有一定作用，有助于了解BMSC如何影響鄰近或遠距細胞及其治療后果[1]。

2 外泌體的檢測

2.1 分離純化

外泌體最常用提取方法是離心法，蔗糖密度梯度超速離心法得到富含外泌體的沉積物，經純化后的外泌體純度較高[2]。用免疫磁珠法模擬體內抗原抗體結合反應，將球型磁珠包被單克隆抗體與外泌體結合，此方法操作簡單但是非體內環境會影響外泌體的生物活性與完整性。胡國文等發現了一種提取細胞外泌體的新方法：培養BMSC細胞，收集上清低速離心去除殘余細胞及細胞碎片，采用旋轉超濾技術提取外泌體不但結構完整且含量較高[3]。

2.2 鑒定分析

外泌體的鑒定分析常用方法包括電子顯微鏡、流式細胞儀和Western blot。應用可視化的電子顯微鏡觀察所獲外泌體一般為30～100 nm球狀或扁平狀，由于外泌體的體積小，流式細胞儀檢測之前需要先把外泌體與抗體包被磁珠連接。根據外泌體來源細胞不同可選擇耦合的磁珠也不同，目前常使用的抗MHC II類或抗CD63分析涂層珠。用Western blot檢測外泌體蛋白表達量，表面標記物（如CD9、CD63、CD81），細胞骨架相關蛋白（如ezrin）和參與多囊生物合成的蛋白質（如Tsg101 and alix），其他蛋白有Flotillin、Hsp70和多種Rab蛋白等。動態光散射（DLS）是常用技術之一，用來估計顆粒的大小和蛋白質復合物的分子量，我們采用此方法評估外泌體的大小尺寸，分析其的尺寸分布強度圖[4]。用PCR及測序的方法對外泌體遺傳物質進行分析。

3 MSC來源外泌體與血液病診斷

3.1 慢性粒細胞白血病

慢性粒細胞白血病（chronic myeloid leukemia，CML）特異性CTL可誘導CML細胞株K562產生外泌體。MSC主要通過旁分泌作用將外泌體miRNA、mRNA和蛋白質運送到各相關通路參與信息傳遞和調控[5]。林晉對K562的外泌體功能進行研究，通過其調控基因miR-711干擾黏附分子CD44與CXCL-12表達，從而使造血干細胞的黏附能力下降。K562細胞釋放miR-92a到細胞外環境轉染cy3標記的pre-mir-92a，而cy3-mir-92a標記的信號CD63是K562細胞表達miR-92a 的標志物[6]。細胞表面受體CXCR4和CXCL12的相互作用介導白血病細胞趨化、遷移到微觀領域內的骨髓，從而促進白血病細胞存活和增殖[7]。

3.2 骨髓增生異常綜合征

骨髓增生異常綜合征（Myelodysplastic syndrome，MDS）患者BMSC釋放的外泌體被納入造血祖細胞（HPC），通過微泡修改CD34+細胞特性，經miRNA修飾和CD34+細胞基因表達以及微泡導入之后的CD34+細胞克隆形成能力和存活率會提高。RT-PCR檢測miR-10a和miR-15a在患者MSC外泌體中表達明顯，被轉移到CD34+細胞，改變TP53基因的表達。同時，TP53表達增強表明至少在某些情況下，MDS紅系祖細胞的凋亡從TP53旁路途徑介導微泡提供的微環境中可以被調解[8]。

3.3 多發性骨髓瘤

正常BMSC外泌體抑制多發性骨髓瘤（Multiple myeloma，MM）細胞的生長而MM BMSC衍生的外泌體促進MM腫瘤生長。MM患者BMSC釋放外泌體轉移到MM細胞進行細胞通信調節腫瘤生長，其腫瘤抑制基因miR-15a比正常人MSC源性外泌體含量少，具有更高含量的致癌蛋白、細胞因子和粘附分子[9]。這些外泌體中膜相關性Hsp70通過激活STAT3和STAT1通路直接誘導髓源性抑制細胞活化支持MM進展，增加抗凋亡蛋白Bcl-xL和Mcl-1表達[10]。MM細胞與MSC之間存在正反饋循環，MSC過表達miR-146a及多種細胞因子和趨化因子包括CXCL1，IL6、IL-8、IP-10、MCP-1的分泌導致細胞存活和遷移增強MM進展[11]。

4 展 望

研究表明BMSC外泌體對疾病具有抑制和促進的雙重作用，患者BMSC產生的外泌體可以高效運輸到靶組織，作為載體導入治療藥物既無倫理學限制又不會引起宿主的免疫反應[12]，因此BMSC外泌體的研究也可望用于疾病的治療。研究外泌體中各種活性物質的作用機制和信息傳遞通路，遏制血液病的惡化和侵襲；對BMSC外泌體特異性生物標志研究，為惡性血液病靶向治療提供新方法等都將給血液病的診斷治療帶來新的思路。

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本文編輯：趙小龍

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ISSN.2095-8242.2017.22.4352.02

吉林省科技廳重點科技攻關項目（20140204016YY）；吉林市科技局重大醫療衛生專項（2015334009）

夏薇