丹參多酚酸鹽微生物限度檢查方法的建立

張媛媛+張玥莉

摘 要 目的： 探索消除丹參多酚酸鹽抑菌活性的適宜方法，并建立丹參多酚酸鹽微生物限度檢查方法。 方法： 參照2015年版《中國藥典》四部微生物限度相關規定，分別采用薄膜濾過法、中和法、稀釋法去除或滅活丹參多酚酸鹽中的抗菌活性。 結果：采用薄膜過濾法，用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗濾膜可將抑菌成分去除，該方法可為含中藥抑菌成分藥物微生物限度檢查方法的建立提供參考依據。

關鍵詞 丹參多酚酸鹽 微生物限度 薄膜過濾法

中圖分類號：R927.11； R286 文獻標識碼：A 文章編號：1006-1533（2017）03-0072-03

Establishment of a method for microbial limit test of salvianolate

ZHANG Yuanyuan1*， ZHANG Yueli2（1. Shanghai Lvgushengmingyuan Pharmaceutical Co. Ltd.； 2. Shanghai Green Valley Pharmaceutical Co. Ltd.， Shanghai 201707， China）

ABSTRACT Objective： To establish a method for microbial limit test and the elimination of the antimicrobial activity in the raw materials of salvianolate. Methods： A method for removing or eliminating the antibacterial activity in the raw materials of salvianolate was tested based on the membrane filtration， neutralization and dilution methods recorded in the related regulations of Chinese Pharmacopoeia （2015 edition， Volume Ⅳ）. Results： The antibacterial active component could be removed by washing the membrane for filtration with pH 7.0 sterile sodium chloride-peptone buffer， which can provide a reference for microbial limit tests of traditional Chinese medicine containing antimicrobial active components.

KEy WORDS salvianolate； microbial limit test； membrane filtration

丹參多酚酸鹽是以丹參為原料，經提取、分離、純化等工序制備出的原料藥，其主要成分為丹酚酸B。研究表明，丹酚酸B具有抗腦及心肌缺血、調節血脂代謝等作用，對冠心病、冠心病穩定型心絞痛等疾病療效顯著[1-4]。丹參多酚酸鹽作為一種植物多酚物質，具有廣譜的殺菌作用[5-7]，故用常規方法進行微生物限度檢查時會影響微生物的生長，從而影響檢查結果。藥品中微生物污染的控制是藥品質量控制的重要指標，2015版《中國藥典》四部中提到，當供試品有抑菌活性時，應采用適宜的方法進行處理，以消除供試品的抑菌活性，并通過實驗驗證抗菌活性的去除是否徹底，再依法檢查[8]。目前常用的方法有培養基稀釋法、薄膜過濾法、靜置法、中和劑法等，其中，薄膜過濾法是液體類制劑和抑菌作用較強的水溶性藥品如抗生素類及各種滴眼、鼻、耳制劑及藥酒等進行微生物限度試驗的首選方法。但藥典對其檢查的具體操作并未明確敘述[9-11]。本研究主要探索消除丹參多酚酸鹽抑菌活性的適宜方法，并建立丹參多酚酸鹽微生物限度的檢查方法。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

胰酪大豆胨瓊脂培養基（TSA）、胰酪大豆胨液體培養基（TSB）、沙氏葡萄糖瓊脂培養基（SDA）、沙氏葡萄糖液體培養基（SDB）及pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（上海中科昆蟲生物技術開發有限公司，批號分別為151130、151223、150821、150210及151225）；氯化鈉（上海潤捷化學試劑有限公司，批號為20150502）；金黃色葡萄球菌、銅綠假單孢菌、枯草芽孢桿菌、白色假絲酵母、黑曲霉。（中國食品藥品檢定研究院，批號：CMCC（B）26003-5a28-1、CMCC（B）10104-2a20-1、CMCC（B）63501-2a21-1、CMCC（F）98001-2a14、CMCC（F）98003-201507），丹參多酚酸鹽（上海綠谷生命園醫藥有限公司，批號：150601、150602、150603）。

1.2 實驗儀器

YP1002N電子天平（上海精密科學儀器有限公司），HH-6數顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司），PHS-3C酸度計（上海佑科儀器儀表有限公司），BSC1000ⅡA2生物安全柜（蘇州安泰空氣技術有限公司），Talboys渦旋混合器（Henry Troernner，LLc），YX490D電動吸引器（上海醫療器械公司醫用吸引器廠），spx-250BSH-Ⅱ生化培養箱和MJ-160BS-Ⅱ霉菌培養箱（上海新苗醫療器械有限公司），XK97-A菌落計數器（杭州齊威儀器有限公司），YXQ-LS-50SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌液的制備

取經培養的銅綠假單孢菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌TSB新鮮培養物及白色假絲酵母SDB新鮮培養物按照2015版中國藥典四部有關內容培養備用。

1.3.2 供試液的制備

取丹參多酚酸鹽供試品10 g，加pH 7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml，混勻，制得供試液A。另取丹參多酚酸鹽供試品10 g，加含3%（v/v）聚山梨酯80的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液分散均勻，調節pH至7.02，然后加稀釋液至100 ml，混勻，制得供試液B。

1.3.3 抗菌活性的去除或滅活方法

1）稀釋法 ①試驗組：取制備好的供試液A，加入試驗菌液，混勻，使含菌量不大于100 cfu/ml，取1 ml菌液，等量分注于5個無菌平皿，立即傾注20 ml相應瓊脂培養基，搖勻，凝固后于規定溫度下倒置培養48～72 h，計數。②供試品對照組：取制備好的供試液，用稀釋液代替菌液同試驗組操作。③菌液對照組：取稀釋液替代供試液，按試驗組操作加入試驗菌并進行回收試驗。④陰性對照組：以稀釋液代替供試液同試驗組操作，但稀釋液中不加入菌液。

2）中和劑法 增加稀釋劑對照組：取含3%（v/v）聚山梨酯80的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代供試液，按試驗組操作加入試驗菌并進行回收試驗。其余同稀釋法。

3）薄膜過濾法 試驗組：取供試液A 9.9 ml，加入0.1 ml含菌量不大于100 cfu的菌液，混勻后，注入濾膜經潤洗的開放式濾器中，加入100 ml pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，混勻，全量通過孔徑0.45 μm混合纖維素膜后，再加入pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液300 ml沖洗，取出濾膜，菌面朝上貼于培養基上。需氧菌用TSA培養基，在30～35 ℃下培養48～72 h。霉菌和酵母菌用SDB培養基，在20～25 ℃下培養48～72 h，計數。各對照組同上。

1.3.4 計算公式

試驗組比值=（試驗組菌落數-供試品對照組菌落數）/菌液對照組菌落數。

稀釋劑對照組比值=（稀釋劑對照組菌落數-供試品對照組菌落數）/菌液對照組菌落數。

試驗組比值和稀釋劑對照組比值都應在0.5～2.0范圍內。

2 結果

1）稀釋法 銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌的回收率分別為0.6和0.5，剛剛達到要求；金黃色葡萄球菌比值（回收率）為0，不符合要求（表1），因此并未繼續進行白色假絲酵母和黑曲霉的測定。這些結果表明，稀釋法并不能有效去除丹參多酚酸鹽中的抑菌活性成分。

2）中和劑法 金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌的回收率均不能達到要求（表2），可能選擇的中和劑種類不正確，無法中和丹參多酚酸鹽中的抑菌活性成分。

3）薄膜過濾法 三次驗證試驗，試驗菌的回收率均能達到藥典要求，且試驗組與菌液對照組的菌落形態一致，所以在試驗沖洗量下，薄膜過濾法可以有效去除藥品中抑菌活性成分對檢測的干擾（表3、4），因此可用該法測定丹參多酚酸鹽中的需氧菌、霉菌和酵母菌數。

3 討論

微生物限度檢查中多種干擾因素會影響計數結果，如培養基、培養條件、加菌量等，都需要格外注意，以最大限度地減少對實驗結果準確性的干擾[12-13]。通過本次試驗，成功摸索出了含有抑菌活性成分的丹參多酚酸鹽的微生物限度檢測方法—薄膜過濾法，同時為含有抑菌活性藥品微生物限度檢測方法的建立提供參考依據。薄膜過濾法可以把外界影響和操作者的主觀因素減少到最低，因此該方法更為科學、客觀、公正，能夠全面反映樣品的染菌情況[14-15]。但是該方法操作較為繁瑣，而本試驗中采用中和劑法又未能獲得如期結果，其原因可能是沒有找到合適的中和劑，所以，在以后的試驗中可繼續探尋是否有更合適的、能有效中和丹參多酚酸鹽中的抑菌活性成分的中和劑。

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