不同方法檢測霉菌毒素的比較研究

董艾青， 劉少文， 柏 凡， 陳 宇， 郭春華， 柏 雪*

（1.西南民族大學生物科學與技術學院，四川成都 610041；2.農業部飼料質量監督檢驗檢測試中心（成都），四川成都 610041）

不同方法檢測霉菌毒素的比較研究

董艾青1， 劉少文1， 柏 凡2， 陳 宇1， 郭春華1， 柏 雪1*

（1.西南民族大學生物科學與技術學院，四川成都 610041；2.農業部飼料質量監督檢驗檢測試中心（成都），四川成都 610041）

本研究通過比較三種不同方法對霉菌毒素檢測結果的差異，旨在為檢測霉菌毒素提供科學依據。本實驗采用酶聯免疫（ELISA）試劑盒、超高效液相色譜（UHPLC）和液相質譜質譜聯用（HPLC-MS/MS）三種檢測方法，對仔豬配合飼料中黃曲霉毒素B1（AFB1）、玉米赤霉烯酮（ZEA）、嘔吐毒素（DON）含量進行檢測。ELISA法檢測AFB1、ZEA和DON時，超標率與UHPLC法和HPLC-MS/MS法接近；但ELISA法檢測AFB1結果為限量值為80%以上時，采用UHPLC法的檢測結果顯著高于HPLC-MS/MS法（P＜0.05），其他所有樣品的AFB1、ZEA和DON兩種儀器檢測方法差異不顯著（P＞0.05）。ELISA可作為霉菌毒素檢測的快速初篩法；對ELISA結果進行確認時，低含量AFB1樣品更宜采用HPLC-MS/MS法，其余樣品采用UHPLC法檢測更經濟；對DON和ZEA的ELISA結果確認時，也可采用UHPLC法。

ELISA試劑盒；UHPLC；HPLC-MS/MS；仔豬配合飼料；霉菌毒素

霉菌毒素對飼料和糧食的污染問題已成為不可忽視的重大難題。Akande（2006）報告顯示，全世界每年受霉菌毒素污染的作物約占總量的25%。Sulyok（2006）調查結果顯示，受污染的作物中霉菌毒素就有300～400種。我國飼料與糧食中霉菌毒素的污染也不容小覷。程傳民（2014）的研究數據表明，我國小麥嘔吐毒素（DON）檢出率達94.8%；龔阿瓊（2015）的研究結果顯示，飼料原料中AFB1的檢出率為95.5%，最低的玉米赤霉烯酮（ZEA）檢出率也接近90%；季海霞（2015）對飼料原料檢測顯示，AFB1檢出率超過90%，ZEA、DON接近全檢出，玉米副產物中ZEA檢出率高達1518.18μg/kg，DON檢出率更是高達4402.69 μg/kg，超標率分別為12.25%和51.09%，污染較為嚴重。2006—2012調查結果顯示，3種霉菌毒素的檢出率均有下降趨勢，超標率卻沒有明顯下降，AFB1超標率反而有上升趨勢 （周闖等，2014；敖志剛等，2008）。

目前飼料中霉菌毒素的檢測方法比較多，可以分為快速篩選法和基準方法?？焖俸Y選方法以熒光光度計法、ELISA法較為常用?；鶞史椒òㄒ合嗌V法、氣相色譜法、氣相色譜-質譜聯用法、薄層色譜法、近紅外光譜法和熒光檢測法等。ELISA試劑盒法是目前運用最多的霉菌毒素檢測方法，此法具有操作簡便、成本低、檢測快速等優點，但是特異性較差，有假陽性等情況出現。UHPLC應用也較普遍，是目前國際上使用最廣泛的霉菌毒素檢測方法，但是使用繁瑣、成本較高，不適用于現場快速和大量的樣品篩選。HPLC-MS/ MS能夠對飼料及食品中霉菌毒素、獸藥殘留、非法添加物等進行痕量和超痕量分析，且基本沒有假陽性現象出現，是檢測的理想方法，但儀器和耗材昂貴，對檢驗人員技術要求也較高。

基于檢測方法在畜牧飼料行業中的重要性，本實驗利用不同的檢測方法對仔豬配合飼料中霉菌毒素進行檢測比較，分別評價不同方法對不同霉菌毒素的檢測效果，為尋找一套簡便、快速、準確的霉菌毒素檢測方法提供科學依據，以確保檢測結果更加準確。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 嚴格按照 GB/T 14699.1-2005《飼料采樣》標準，從四川、重慶等地的飼料廠采集具有代表性的仔豬配合飼料33份。

1.2 儀器與試劑 主要試劑：ELISA試劑盒（Romer Labs Gmbh公司）；多功能凈化柱（MycospinTM400）；乙腈，色譜級（≥99.9%）；甲醇，色譜級（≥99.9%）；正己烷、乙酸、三氟乙酸、霉菌毒素標準液，均購自國家標準物質中心，保存條件為2～8℃；吐溫；超純水（UP級）。

主要儀器：超高效液相色譜儀 （型號：ACQUITY UPLCM-Class，ACQUITYWATERS公司，美國）；液相質譜質譜聯用儀 （型號：1290/6460，Agilent公司，美國）；DNM-9602酶標分析儀；優普超純水制造系統（型號：ULUP?-I-5/10/20T，優普超純科技公司，中國）；XH-B型旋渦混合器；DH-250型電熱恒溫培養箱；臺式高速冷凍離心機；HS-501振蕩器；電子天平；隔膜真空泵（型號：GM-0.33A）；氮吹儀。

1.3 檢測指標及方法 利用ELISA法、UHPLC法和HPLC-MS/MS法對配合飼料中AFB1、ZEA 和DON含量進行測定。ELISA法參照操作說明書進行；UHPLC法檢測：AFB1檢測參考 GB/T 30955-2014標準，ZEA參考GB/T 28716-2012標準，DON參考GB/T 30956-2014標準；HPLC-MS/ MS法：AFB1、ZEA具體參考標準 NY/T 2071-2011，DON參考標準SN/T 3136-2011。

1.4 液相色譜條件 色譜柱：C18柱，柱長為100 mm，內徑2.1 mm，粒度2.4μm或類似色譜柱；柱溫：35℃；進樣量：5μL；流速：0.3 mL/min；流動相、梯度洗脫條件見表1。

表1 液相色譜儀的梯度洗脫條件參數

1.5 質譜條件 離子源：電噴霧離子源；檢測方式：多反應監測；掃描方式：正負離子同時進行的掃描模式；毛細管電壓：正模式（4000 V）；負模式（3500 V）；干燥氣流速：13 L/min；干燥氣溫度：350℃；霧化氣壓力：40 psi。

1.6 限量標準 國家限量標準：AFB1根據GB 13078-2001飼料衛生標準 （AFB1≤10μg/kg），ZEA參考 GB 13078.2-2006飼料衛生標準（ZEA≤100μg/kg），DON參考GB 13078.3-2007飼料中嘔吐毒素的國家標準（DON≤1000μg/kg）。當霉菌毒素含量大于或等于80%限量時，該樣品認定為高含量樣品；當霉菌毒素含量低于50%限量時，該樣品認定為低含量樣品；含量位于兩者之間的樣品為中含量樣品。

1.7 數據處理 實驗數據采用SPSS 18.0進行二樣本配對T檢驗。其中P＜0.01表示差異極顯著，P＜0.05表示差異顯著。結果用“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 不同檢測方法間AFB1的檢測結果比較 由表2可看出，ELISA法檢測出飼料樣品中AFB1超標率為18.18%，高于UHPLC法和HPLC-MS/MS法（15.15%和12.12%），最大值也高于另外2種方法的檢測結果。AFB1低含量的樣品三種檢測方法之間差異不顯著（P＞0.05），但對于中含量和限量值80%以上的樣品，ELISA法檢測結果均顯著或極顯著高于其他兩種檢測方法（P＜0.01）。從整體來看，ELISA法檢測樣品的總體平均值極顯著高于UHPLC法（P＜0.01），但與HPLC-MS/MS法之間差異不顯著（P＞0.05）。

表2 不同檢測方法下仔豬飼料中AFB1的結果μg/kg

兩種檢測方法僅在檢測ELISA結果為限量值 80%以上的樣品時，UHPLC法顯著高于HPLC-MS/MS法（P＜0.05），其余情況兩種方法檢測結果差異不顯著 （P＞0.05），但絕對數值HPLC-MS/MS法高于UHPLC法，特別是低含量樣品，HPLC-MS/MS法結果為UHPLC法的6倍。

2.2 不同檢測方法間ZEA檢測結果的比較 由表3可看出，UHPLC法與HPLC-MS/MS法檢測超標樣品超標率均為39.39%，低于ELISA法（42.42%），最高值也同樣低于ELISA法。

表3 不同檢測方法下仔豬飼料中ZEA的結果μg/kg

ELISA法檢測ZEA低含量和中含量的樣品時，其結果接近UHPLC和HPLC-MS/MS法的兩倍，但由于標準差較大，三種方法檢測結果差異不顯著（P＞0.05）；檢測高含量樣品時，ELISA法顯著高于UHPLC法和HPLC-MS/MS測定方法（P＜ 0.05）。但無論樣品中ZEA含量多少，兩種檢測方法之間差異不顯著（P＞0.05）。

2.3 不同檢測方法間DON檢測結果的比較由表4可看出，ELISA法檢測DON的超標率低于UHPLC法和HPLC-MS/MS法，分別為33.33%、36.36%和36.36%，且最高值僅為兩種方法的50%左右。

表4 不同檢測方法下仔豬飼料中DON的結果μg/kg

從總體平均值來看，三種方法檢測仔豬配合飼料中DON含量時差異不顯著 （P＞0.05）。但ELISA法檢測值為低含量的樣品，其ELISA法檢出結果顯著高于UHPLC法和HPLC-MS/ MS法（P＜0.05）；中含量樣品檢出結果顯著高于HPLC-MS/MS法 （P＜0.05），檢測限量值80%以上的樣品結果顯著低于HPLC-MS/MS法（P＜0.05），兩種方法在檢測DON時差異不顯著（P＞0.05）。

3 討論

在實際生產中，采用UHPLC儀器檢測霉菌毒素成本太高，ELISA試劑盒法又受溫度、試劑盒品牌、酶標儀靈敏度等條件影響，假陽性率較高，可重復性差。這兩類方法各有其優缺點，尋找一種相互彌補、穩定快捷又價格低廉的檢測模式是檢測部門和飼料廠的共同目標。

本研究發現ELISA法測定AFB1、ZEA的平均值均顯著高于UHPLC法，這和柳潔等（2005）在檢測糧油食品中AFB1含量時的結果一致。ELISA法檢測低含量的AFB1樣品時，三種方法檢測結果一致，陳建偉（2012）研究也認為HPLC法和 ELISA法測定玉米中 AFB1含量在0.2～200μg/mL時，兩種方法相當。樣品中毒素的濃度是影響檢測結果的重要因素之一。當樣品中AFB1含量較高時，ELISA法檢測結果顯著高于其他方法，這可能與ELISA法檢測原理有關。范素芳等（2011）認為檢測玉米等糧食中AFB1的含量時，HPLC法的精密度和靈敏度都弱于HPLC-MS/MS法。本研究也發現兩種儀器檢測方法在檢測低含量和中含量樣品時，UHPLC法檢測結果低于HPLC-MS/MS法。而當樣品含量較高時，UHPLC法檢測結果高于HPLC-MS/MS法。楊水艷等（2015）認為，在使用HPLC-MS/MS法測定AFB1時，當樣品中AFB1含量較高時，會降低其回收率，這也可能是導致上述結果的原因之一。

當ELISA法檢測ZEA樣品時，其結果均顯著高于其他兩種測定方法，ELISA法檢測DON值為低含量和中含量的樣品時，ELISA法檢出結果也顯著高于UHPLC法和HPLC-MS/MS法，這與佘容（2015）和賈衛昌（2015）等人的研究結果一致。ELISA法檢測高含量DON的樣品時，檢測結果卻顯著低于其他兩種方法，這與佘容等（2015）研究結果相反，原因可能與選擇的試劑盒差異有關，試劑盒檢測結果出現的假陽性也可能是原因之一 。陳玲（2006）和古莉（2015）等人對造成ELISA試劑盒假陽性和不穩定的因素進行了研究，大致歸納為以下幾點：（1）飼料樣品溶解液的pH值。為防止仔豬腹瀉與促消化，一般添加的酸含量較高，而極端的酸堿環境可影響酶的化學結構，當溶解液pH低于5.0時，酶結構會發生不可逆性變化，導致后續酶聯反應受影響，出現假陽性。（2）飼料中的微量元素含量過高時，能夠破壞酶的化學結構，同樣影響底物的顏色反應，出現假陽性。（3）飼料中的脂肪可能包裹抗體，影響抗原-抗體的特異性結合，反應的終止時間受干擾，出現假陽性。但值得注意的是，試劑盒檢測值并不一定都比上機檢測值高。說明試劑盒在檢測霉菌毒素含量時，穩定性不及色譜法和質譜法。

4 結論

本研究結果表明，三種檢測方法對DON的檢測結果差異不顯著，出于成本與快速檢測結果考慮，DON更適合使用ELISA試劑盒檢測。在檢測AFB1和 ZEA時，ELISA試劑盒結果顯著高于UHPLC法與HPLC-MS/MS法，ELISA試劑盒進行AFB1和ZEA檢測時只適合用作初篩。在采用儀器對AFB1進行確認時，低含量樣品更宜采用HPLC-MS/MS法；其他含量的樣品出于成本考慮可選擇UHPLC法。對DON和ZEA結果確認時，也可選擇較經濟的UHPLC法。

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The study was conducted to investigate the difference of three differentmethods to detect concentrations of mycotoxins，aims to give references aboutmycotoxins detection.A total of 33 piglet dietswere selected to detectmycotoxins aflatoxins B1（AFB1），zearalenone（ZEA）and deoxynivalenol（DON）concentrationswith differentmethods including ELISA，ultra performance liquid chromatography（UHPLC）and liquid chromatographmass spectrometermass spectrometer（HPLCMS/MS）.The over standard rate of ELISA method on detection of AFB1，ZEA and DON was same with UHPLC and HPLCMS/MSmethods，and the ELISA could be the preliminary screeningmethod.When the concentration of AFB1in piglet feed was 80%higher than limited value with themethod of ELISA，the UHPLC detected AFB1concentration was higher than that of HPLC-MS/MS（P＜0.05）.While there were no significant difference in UHPLC and HPLC-MS/MS on concentrations of AFB1，ZEA and DON on other samples（P＞0.05）.Itwas indicated that ELISA could be the preliminary screening method to detect themycotoxins concentrations.HPLC-MS/MS could be used to verify the results of ELISA method with lower AFB1concentration，while others were verified by UHPLC method.UHPLC could be used to verify the results of ELISA on concentration of DON and ZEA.

ELISA kits；UHPLC；HPLC-MS/MS；piglet feed；mycotoxins

S816.17

A

1004-3314（2017）04-0027-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20170407

西南民族大學研究生創新科研項目（CX2015SZ087）

*通訊作者