酶調節劑對煙草氮代謝及其化學成分的影響

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（1.河南農業大學，國家煙草栽培生理生化研究基地，煙草行業煙草栽培重點實驗室，鄭州 450002；2.河南省煙草公司平頂山市公司，河南 平頂山 467002；3.云南省煙草公司大理州公司，云南 大理 671000）

酶調節劑對煙草氮代謝及其化學成分的影響

李亞飛1，常棟2，孫軍偉3，楊惠娟1，王景1，史宏志1*

（1.河南農業大學，國家煙草栽培生理生化研究基地，煙草行業煙草栽培重點實驗室，鄭州 450002；2.河南省煙草公司平頂山市公司，河南 平頂山 467002；3.云南省煙草公司大理州公司，云南 大理 671000）

為調控旺長期煙株氮代謝活動，解決大理地區煙葉成熟度差的問題，分別在旺長期和成熟期研究了不同酶調節劑對煙葉氮代謝關鍵酶活性及煙葉化學成分的影響。結果顯示，在旺長期噴施鉬酸銨7 d后，中部葉和上部葉NR活性分別提高了6.56%和17.57%，GS活性分別提高了22.17%和15.24%，蛋白質含量升高了6.00%和5.02%，氮代謝明顯增強；在成熟期對生長過旺煙株噴施鎢酸鈉和草丁膦4 d后，煙葉氮代謝活動減弱，上部葉NR活性分別下降了8.55%和18.55%，GS活性分別下降了5.33%和11.58%%，煙葉總氮、煙堿和蛋白質含量均下降，糖堿比增大，對解決煙葉成熟度差和提高煙葉可用性有利。就調控煙葉氮代謝效果和烤后煙葉化學成分協調性而言，以旺長期噴施鉬酸銨和成熟期噴施草丁膦最佳。

煙草；酶調節劑；氮代謝；化學成分

硝酸還原酶（NR）是氮素還原利用限速酶，谷氨酰胺合成酶是氮素同化利用關鍵酶，它們活性大小對煙草氮代謝均有重要影響[1]。鉬是硝酸還原酶的重要組成成分，對煙株氮代謝具有重要作用[2-3]。張繼利等[4]通過研究發現，噴施鉬肥有利于提高中上等煙比例和增加煙葉產質量。鎢與鉬屬于同族元素，存在競爭關系，對NR活性具有抑制作用[5]。楊榮等[5]研究發現，1.0 mmol/L鎢酸鈉抑制油菜根系NR活性效果最佳，會引起氮素吸收速率下降。草丁膦（PPT），又名草銨膦，在生產中可作為一種非選擇性觸殺除草劑[6]，作用原理是其能夠使谷氨酰胺合成酶（GS）空間構型發生變化[7]，抑制其活性而降低氮代謝活動[8-10]。許東亞[11]通過研究不同草丁膦濃度對煙草成熟期氮代謝和煙葉質量的影響，得出以10 mg/L效果最佳，但未涉及其作用過程。

云南大理是煙葉生產的重要產區，普遍存在土壤黏性相對較重[12]，氮素供應滯后，且大田中后期氣溫偏低，易出現成熟度差，煙葉總氮、煙堿含量高和刺激性過強等問題[13-16]。煙農片面追求產量，在煙田大量施用化肥，導致此類現象加劇。本試驗通過在旺長期對正常生長煙株和在成熟期對生長過旺煙株分別噴施酶調節劑，研究對煙株氮代謝關鍵酶活性的影響過程以及對煙葉主要化學成分的影響，旨在解釋不同酶調節劑對煙葉氮代謝活動和煙葉成熟落黃的調控作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設計

試驗于2014年5—9月在云南省大理州彌渡縣紅花大金元基地進行。供試品種：紅花大金元。

旺長期試驗在團棵后10 d（移栽后40 d）進行，對正常生長煙株噴施不同化學試劑，按照隨機區組設計，共設置4個處理，分別為①0.5%鉬酸銨，質量分數；②0.4%鎢酸鈉，質量分數；③有效成分：10 mg/L草丁膦，體積分數；④對照CK，噴施清水。酶調節劑使用以均勻噴灑整株葉片和無滴水為準，75 L/666.7 m2。每個處理200株，3次重復，每小區兩側各 1行為保護行。試驗田土壤類型為水稻土，無前作，試驗前2年內無施用鉬肥和草丁膦，土壤養分堿解氮211.31 mg/kg，速效磷33.81 mg/kg，速效鉀125.39 mg/kg，有機質39.56 g/kg，pH 6.34。氮代謝酶活性測定時間：在噴施當天、噴后2、7和14 d分別取各處理上部葉（倒4葉位，有效葉數18片/株）和中部葉（倒9葉位，有效葉數18片/株）新鮮樣品，用于煙葉NR活性、GS活性和蛋白質含量測定。

成熟期試驗在打頂后10 d進行。試驗田選擇在煙株長勢整齊，中上部葉葉色濃綠，整株葉片未表現出成熟落黃跡象，且已在中心花開放時進行打頂的地塊進行。試驗處理和酶調節劑使用方法同上，每個處理200株，3次重復。氮代謝酶活性測定時間：在噴施當天，噴后4 d和10 d取各處理倒4葉位（有效葉數18片/株）新鮮樣品，用于煙葉NR活性、GS活性和蛋白質含量測定。

鉬酸銨和鎢酸鈉均為化學分析純藥品；草丁膦，濃度200 mg/L，由德國拜爾作物科技公司生產，噴施時與0.5‰ SilWet-77表面活性劑配施。

1.2 測定項目與方法

1.2.1 煙葉氮代謝NR、GS活性 煙葉NR活性采用活體法測定[17]。煙葉GS活性采用D O′ Neal[18]等方法測定。

1.2.2 煙葉蛋白質含量 煙葉蛋白質含量采用考馬斯亮藍法[17]測定。

1.2.3 煙葉化學成分測定 每個處理按照國標（GB2635—92）選取烤后煙葉C3F和B2F 1 kg，在烘箱45 ℃下烘干，磨碎后過60目篩子備用。總氮、總糖、還原糖、煙堿按照YC/T159～162—2002煙草及煙草制品化學成分連續流動法測定。所用儀器為德國BRAN+LUEBBE公司制造的AA3型流動分析儀。標準煙樣由中國農業科學院煙草研究所提供。

1.2.4 數據分析 采用Excel和Origin 9.0軟件制作圖表，SPSS 20.0軟件進行方差分析。

2 結 果

2.1 不同處理對煙葉NR活性的影響

噴施鉬酸銨后，煙葉硝酸還原酶活性持續升高，而噴施鎢酸鈉和草丁膦，煙葉硝酸還原酶活性均下降（圖1、2）。在旺長期，噴施當天上部葉和中部葉硝酸還原酶活性分別為101.22和120.68 μg/(g·h)，噴施鉬酸銨 2、7和 14 d后，上部葉分別升高了3.20%、17.57%和19.30%，中部葉分別升高了8.25%、6.56%和4.95%；噴施鎢酸鈉和草丁膦2、7和14 d后，上部葉分別下降了18.11%、12.15%，39.29%、30.01%和 33.58%、31.79%，中部葉分別下降了12.83%、9.98%，30.28%、19.01%和31.18%、23.33%。在成熟期噴施鉬酸銨4和10 d后，上部葉硝酸還原酶活性分別升高了8.79%和23.07%，而噴施鎢酸鈉和草丁膦4和10 d后，上部葉硝酸還原酶活性分別下降了8.55%、18.53%和15.56%、18.03%。

圖1 不同處理對煙葉NR活性的影響（a上部葉，b中部葉，旺長期噴施）Fig. 1 Effects of different treatments on nitrogen reductase activities in tobacco(a: upper leaves, b: middle leaves, spraying in fast growing period)

圖2 不同處理對煙葉NR活性的影響（上部葉，成熟期噴施）Fig. 2 Effects of different treatments on nitrogen reductase activities of upper leaves(spraying in mature period)

2.2 不同處理對煙葉GS活性的影響

噴施鉬酸銨后，葉片谷氨酰胺合成酶活性升高，而噴施鎢酸鈉和草丁膦后則出現下降變化，與硝酸還原酶活性變化規律一致（圖3、4）。在旺長期噴施當天，上部葉和中部葉谷氨酰胺合成酶活性分別為0.173和0.170 μmol/(mg·h)；噴施鉬酸銨2、7和14 d后，上部葉和中部葉分別升高了6.26%、15.24%、12.51%和14.10%、22.17%、20.48 %；而噴施鎢酸鈉和草丁膦 2、7和 14 d后，上部葉分別下降了6.39 %、22.90%，17.68 %、32.31%和20.24%、37.67%，中部葉分別下降了6.58%、13.76%，17.49%、27.88%和25.67%、33.59%。在成熟期噴施當天，上部葉谷氨酰胺合成酶活性為0.106 μmol/(mg·h)；噴施鉬酸銨4和10 d后，葉片谷氨酰胺合成酶活性分別升高了19.28%和32.79%；噴施鎢酸鈉和草丁膦4和10 d后，葉片谷氨酰胺合成酶活性分別下降了5.33%、18.29%和18.79%、27.51%，以草丁膦處理抑制作用最佳。

圖3 不同處理對煙葉GS活性的影響（a上部葉，b中部葉，旺長期噴施）Fig. 3 Effects of different treatments on glutamine synthetase activities in tobacco(a: upper leaves, b: middle leaves, spraying in fast growing period)

圖4 不同處理對煙葉GS活性的影響（上部葉，成熟期噴施）Fig. 4 Effects of different treatments on glutamine synthetase activities of upper leaves (spraying in mature period)

2.3 不同處理對煙葉蛋白質含量的影響

在旺長期噴施當天，上部葉和中部葉蛋白質含量分別為209.31和188.53 mg/g；噴施鉬酸銨后，葉片蛋白質含量升高（圖5），而噴施鎢酸鈉和草丁膦2、7和14 d后，上部葉蛋白質含量分別下降了2.43%、5.03%，7.25%、10.50%和9.39%、11.44%，中部葉分別下降了8.04%、8.98%，13.20%、16.34%和15.82%、17.61%。在成熟期噴施當天，上部葉蛋白質含量為145.07 mg/g；噴施鉬酸銨后，葉片蛋白質含量有升高趨勢（圖6）；噴施抑制劑鎢酸鈉和草丁膦4和10 d時，葉片蛋白質含量分別下降了5.51%、9.99%和10.74%、23.22%，以草丁膦處理抑制效果最佳。

2.4 不同處理煙葉物理特性比較

在成熟期，噴施鉬酸銨、鎢酸鈉和草丁膦后，煙葉長度增加，長寬比增大，單葉重、葉質重和含梗率下降，但處理間差異多未達到顯著或極顯著水平（表1）。其中，不同處理間中部葉單葉重以鎢酸鈉和草丁膦處理最低，鉬酸銨處理次之，對照最高，差異達到顯著性水平；不同處理間上部葉葉質重以草丁膦處理最低，達到顯著性差異，鉬酸銨和鎢酸鈉處理次之，對照處理最高。

圖5 不同處理對煙葉蛋白質含量的影響（a:上部葉，b:中部葉，旺長期噴施）Fig. 5 Effects of different treatments on protein content in tobacco (a: upper leaves, b: middle leaves, spraying in fast growing period)

圖6 不同處理對煙葉蛋白質含量的影響（上部葉，成熟期噴施）Fig. 6 Effects of different treatments on protein content of upper leaves ( spraying in mature period)

表1 不同處理煙葉物理特性比較（成熟期噴施）Table 1 Comparison of physical properties of tobacco leaves of different treatments（spraying in mature period）

2.5 不同處理煙葉主要化學成分比較

由表2可知，不同處理煙葉含氮化合物含量存在不同，部分指標達到顯著或極顯著性差異。噴施鉬酸銨后，煙葉總氮、煙堿和蛋白質含量有升高趨勢，上部葉煙堿和蛋白質含量超出優質煙葉要求（煙堿1.5%～3.5%，蛋白質8%～10%）[19]；噴施鎢酸鈉和草丁膦后，煙葉總氮、煙堿和蛋白質均下降，含氮化合物含量以草丁膦處理最為適宜。

表2 不同處理煙葉含氮化合物含量比較Table 2 Comparison of different treatments on the nitriccompounds

由表3可知，不同處理煙葉碳水化合物含量存在不同，部分處理間差異達到顯著或極顯著水平。噴施鉬酸銨后，上部葉煙葉總糖和還原糖含量增加，兩糖比和糖堿比增大，但中部葉總糖和還原糖含量減少，糖堿比減小；噴施鎢酸鈉后，煙葉總糖和還原糖含量均下降，但兩糖比增大；噴施草丁膦后，煙葉總糖和還原糖含量升高，糖堿比增大，化學成分協調性增強。

表3 不同處理煙葉碳水化合物含量比較Table 3 Comparison of different treatments on carbohydrate content in tobacco

3 討 論

在旺長期，煙株干物質積累量占總量的 64%左右[19]，氮代謝旺盛有助于為優質煙葉形成提供豐富的物質基礎。在旺長期噴施鉬酸銨，煙葉NR和GS活性提高，煙葉蛋白質含量增加，推測是由于噴施鉬肥提高了NR活性，硝酸鹽還原產物增多，能夠為 GS/GOGAT循環反應提供豐富的反應底物，進而促進GS酶活性，蛋白質含量升高，氮代謝增強，這對促進煙葉生長發育和干物質積累有利。

本試驗中，鎢酸鈉對煙葉NR活性具有抑制作用，這與在水稻[20]、小白菜[21]、油菜[5]和枳[22]等作物研究結果一致。在成熟期噴施鎢酸鈉，煙葉煙堿、蛋白質、總糖和還原糖均呈現下降，且糖堿比增大，對提高煙葉可用性有利。推測一方面是由于對成熟期生長過旺煙株噴施鎢酸鈉后，煙葉氮代謝減弱；另一方面鎢酸鈉又有抑制脫落酸形成的作用[23]，可能引起煙葉物質消耗和降解轉化階段延長所致，這有待進一步研究確定。

在生產中，草丁膦常作為除草劑使用，具有高效，殘留少，對環境影響小的特點[24]。本試驗草丁膦使用量10 mg/L（0.01 kg/hm2）遠低于生產上作為除草劑的用量（防除一年生雜草除草劑用量 0.40 kg/hm2，防除多年生雜草用量1.00～2.00 kg/hm2[12]），但對煙葉安全性評價有待研究。在噴施草丁膦后，煙葉NR和GS活性下降，推測是由于GS活性受到抑制后，引起NH4+積累[9]，再通過反饋調節降低NR活性；噴施草丁膦后，煙葉總氮、煙堿和蛋白質含量有所降低，總糖和還原糖含量升高，糖堿比增大，煙葉化學成分協調性增強，對提高煙葉品質有利。

4 結 論

旺長期噴施鉬酸銨能夠明顯提高煙葉 NR和GS活性，增強煙葉氮代謝，有利于優質煙葉形成；成熟期噴施草丁膦能夠抑制NR和GS活性，煙葉總氮、煙堿和蛋白質含量下降，含碳化合物升高，對促進煙葉及時成熟落黃和改善其可用性有利。因此，在旺長期噴施鉬酸銨和成熟期噴施草丁膦有利于解決成熟期煙葉成熟度差問題。

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Effect of Enzyme Modulators on Nitrogen Metabolism and Chemical Components in Tobacco

LI Yafei1, CHANG Dong2, SUN Junwei3, YANG Huijuan1, WANG Jing1, SHI Hongzhi1*
(1. National Tobacco Cultivation and Physiology and Biochemistry Research Center/Key Laboratory for Tobacco Cultivation of Tobacco Industry, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China; 2. Pingdingshan Branch of Henan Province Tobacco Company, Pingdingshan, Henan 467002, China; 3. Dali Branch of Yunnan Provincial Tobacco Company, Dali, Yunnan 671000, China)

The field experiments of spraying different enzyme modulators were carried out to enhance nitrogen metabolism during the fast growth stage with the purpose of solving the tobacco maturity problem in Dali area. To this end, activities of the key enzymes in nitrogen metabolism and chemical components of flue-cured tobacco were measured. The results showed that spraying ammonium molybdate could increase nitrogen metabolism and the basic materials in the formation of high quality tobacco. Seven days after spraying ammonium molybdate at the rapid growth stage, nitrate reductase (NR) activity, glutamine synthetase(GS) activity and protein content increased by 6.56%, 22.17%, 6.00% and 17.57%, 15.24%, 5.02% in middle and upper leaves, respectively. After spraying sodium tungstate and glufosinate at the maturity stage, nitrogen metabolism had been weakened with nitrate reductase (NR) activity and glutamine synthetase (GS) activity decreased by 8.55%, 18.55% and 5.33%, 11.58% in middle and upper leaves, respectively. Total nitrogen content, nicotine content, protein content decreased, while reducing sugar/nicotine ratio increased. The methods of spraying ammonium molybdate during the fast growth stage and spraying glufosinate during the mature period were effective in regulating nitrogen metabolism and chemical components of tobacco.

tobacco; enzyme modulators; nitrogen metabolism; chemical components

S572.01

1007-5119（2017）01-0029-06

10.13496/j.issn.1007-5119.2017.01.005

云南省煙草公司科技項目“提升紅大煙葉品質的深化技術研究及應用”（2013YN28）；煙草栽培重點實驗室項目“煙草氮素高效吸收利用及氮代謝動態調控技術研究”（YCZP201601）

李亞飛（1985-），在讀博士研究生，主要從事煙草栽培生理生化研究。E-mail：scitech14@163.com。*通信作者，E-mail：shihongzhi88@163.com

2016-06-27

2017-01-17