紅景天對老年癡呆大鼠認知功能的治療作用

劉 娜，王金華，王華龍，邱會卿，王彥永,2*，王銘維,2

(1.河北醫科大學第一醫院神經內一科，河北 石家莊 050031；2.河北省腦老化與認知神經科學實驗室，河北 石家莊 050031)

·論 著·

紅景天對老年癡呆大鼠認知功能的治療作用

劉 娜1，王金華1，王華龍1，邱會卿1，王彥永1,2*，王銘維1,2

(1.河北醫科大學第一醫院神經內一科，河北 石家莊 050031；2.河北省腦老化與認知神經科學實驗室，河北 石家莊 050031)

目的觀察紅景天對實驗性老年癡呆大鼠認知功能的治療作用。方法制作老年癡呆及紅景天干預大鼠模型，Morris 水迷宮檢測大鼠模型學習記憶能力；免疫印跡法檢測AKT、p-AKT、GSK-3β、p-GSK-3β、bcl-2及bax 蛋白表達水平，電鏡觀察大鼠海馬組織超微結構。結果造模后模型組、紅景天組逃避潛伏期時間均長于對照組；治療后逃模型組、紅景天組避潛伏期時間均長于對照組，而紅景天組短于模型組(P<0.05)。造模后模型組、紅景天組目標象限停留時間均明顯短于對照組(P<0.05)；治療后模型組、紅景天組目標象限停留時間均短于對照組，而紅景天組長于模型組(P<0.05)。p-GSK-3β蛋白紅景組與模型組低于對照組，紅景天組高于模型組；p-AKT蛋白紅景天組高于對照組與模型組，模型組低于對照組(P<0.05)。bcl-2模型組低于對照組，紅景天組高于對照組和模型組，(P<0.05)；bax模型組高于對照組和紅景天組(P<0.05)。結論紅景天可改善實驗性老年癡呆大鼠認知功能，其機制可能是通過PI3K/AKT/GSK3β 通路上調抑制凋亡蛋白bcl-2、下調促凋亡蛋白bax實現的。

阿爾茨海默病；紅景天；細胞凋亡

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一種慢性神經退行性疾病，其臨床特征為學習記憶能力減退，常表現為漸進性的記憶障礙、常找不到回家的路、人格改變、對家人冷漠[1]。病理學特征為出現異常蛋白結構，即tau蛋白的過度磷酸化和β淀粉樣蛋白斑塊形成[2-5]。tau蛋白的分布與疾病的癥候、發展密切相關，β淀粉樣蛋白變化廣泛[6-7]。目前，關于tau蛋白的過度磷酸化和β淀粉樣蛋白斑塊出現先后問題仍存在爭議[8-10]。有文獻表明，AD的“元兇”是tau蛋白的過度磷酸化而非Aβ蛋白。2種蛋白結構的異常與神經元及突觸減少有關。目前，臨床上改善AD癥狀的藥物很多，但效果并不明顯。全球范圍內AD的患者呈增加趨勢，且年齡逐漸年輕化，嚴重影響患者的生活質量，同時給患者和家庭帶來沉重的經濟負擔，因此亟須開發有效控制和改善其癥狀的藥物。現代藥理學認為，紅景天被廣泛用于心腦血管疾病，除抗衰老、抗疲勞、抗腫瘤外，其還具有強大的抗氧化作用，通過調節神經遞質實現對中樞神經系統保護作用[11-13]。紅景天可抑制caspase-3和細胞內鈣離子水平進而保護海馬神經元，發揮神經保護作用[14]。本研究采用AD大鼠模型觀察AKT、p-AKT、GSK-3β(ser9)、p-GSK-3β(ser9)、bcl-2、bax等蛋白水平，探討紅景天對AD大鼠的神經保護作用及機制，旨在為臨床治療AD提供可靠的理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物造模及分組 無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級雄性SD大鼠30只，體質量為(260±20) g，由河北省實驗動物中心提供，分為空白對照組10只，AD模型組10只，紅景天組10只。AD模型組及紅景天組大鼠每隔2 h皮下注射NaN3，連續4周，對照組注射等量的生理鹽水。4周后，Morris水迷宮檢測大鼠學習記憶功能，大鼠逃避潛伏期較對照組顯著延長，而通過目標象限的次數顯著減少，表明大鼠出現認知功能障礙，視為大鼠造模成功。水迷宮實驗結束后，紅景天組給予15 mg/kg灌胃，對照組和模型組給予等量的生理鹽水灌胃，持續4周Morris水迷宮觀察大鼠認知功能變化。

1.2 試劑 紅景天干燥粉末購自河北省中醫研究所。NaN3購自北京恒業中原化工有限公司，兔抗大鼠 GSK-3β、p-GSK-3β(ser9)、bax、bcl-2、AKT、p-AKT購自美國Sigma公司，PIPA裂解液、蛋白提取試劑盒、PDVF模等其他試劑均購自碧云天生物公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 Morris水迷宮 灌胃4周后進行Morris水迷宮檢測。水迷宮直徑150 cm，池壁高50 cm，水深40 cm，水溫(22±1) ℃。目標象限中央放置一直徑10 cm平臺，位于水面下1 cm。大鼠經過適應訓練后，進行定位航行實驗，大鼠面朝池壁下水，記錄大鼠找到平臺的時間，如果在120 s內找到平臺，記錄時間(逃避潛伏期)；如果120 s未找到平臺將其引上平臺并讓大鼠停留20 s，逃避潛伏期記錄為120 s。空間搜索實驗：定位航行實驗后，移除平臺，記錄大鼠在目標象限停留時間。

1.3.2 電鏡觀察大鼠海馬組織超微結構 Morris水迷宮后迅速處死大鼠，冰上取海馬組織，戊二醛固定。脫水→樹脂包埋→聚合→固化→切片(50～60 nm)，觀察并拍照。

1.3.3 免疫印跡法測定AKT、p-AKT、GSK-3β、p-GSK-3β(ser9)、bcl-2及bax水平 迅速斷頭，取海馬組織，提取蛋白，用于免疫印跡實驗。勻漿→冰浴→離心→取上清→BCA試劑盒蛋白定量→煮沸變性(加上樣緩沖液)。SDS-PAGE膠分離→轉膜→封閉2 h→一抗4℃過夜→洗膜→標記二抗→孵育2 h→ECL顯影。

1.4 統計學方法 應用SPSS 16.0統計軟件分析數據。計量資料比較分別采用單因素方差分析和SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 Morris水迷宮測試大鼠學習能力 3組造模前逃避潛伏期差異無統計學意義(P>0.05)。造模后模型組、紅景天組逃避潛伏期時間均長于對照組(P<0.05)；治療后模型組、紅景天組逃避潛伏期時間均長于對照組，而紅景天組短于模型組(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠逃避潛伏期比較 Table 1 Comparison of escape latency of rats in each group

*P<0.05與對照組比較 #P<0.05與模型組比較(SNK-q檢驗)

2.2 水迷宮測試大鼠記憶能力 3組大鼠造模前在目標象限停留時間差異無統計學意義(P>0.05)。造模后模型組和紅景天組目標象限停留時間均明顯短于對照組(P<0.05)；治療后模型組、紅景天組目標象限停留時間均短于對照組，而紅景天組長于模型組(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠目標象限停留時間比較Table 2 The retention time of the target quadrant in each group

*P<0.05與對照組比較 #P<0.05與模型組比較(SNK-q檢驗)

2.3 免疫印跡法檢測各種蛋白定量 模型組p-GSK-3β蛋白明顯低于對照組，紅景天較模型組明顯升高，但仍低于對照組(P<0.05)；模型組p-AKT低于對照組，紅景天p-AKT明顯高于模型組和對照組(P<0.05)；模型組bcl-2蛋白明顯低于對照組，而紅景天組高于模型和對照組(P<0.05)；模型組bax蛋白明顯高于對照組，紅景天組明顯低于模型組(P<0.05)，但與對照組差異無統計學意義(P>0.05)；3組間GSK-3β和AKT差異無統計學意義(P>0.05)。見表3，圖1，2。

2.4 電鏡觀察大鼠海馬組織超微結構 對照組海馬神經元核膜核膜完整，核仁清晰可見，線粒體飽滿，脊清晰可見；模型組染色質邊集，核仁消失，線粒體腫脹，脊消失，紅景天顯著改善了這一狀況(圖3)。

表3 不同組別海馬組織中AKT、GSK-3β、bcl-2和bax相對活性比較Table 3 The relative activity of AKT，GSK-3β，bcl-2 and bax in hippocampus of different groups

*P<0.05與對照組比較 #P<0.05與模型組比較(SNK-q檢驗)

圖1 免疫印跡法檢測p-GSK-3β和 GSK-3β，p-AKT和AKT

圖2 免疫印跡法檢測bcl-2、 bax結果

圖3 大鼠海馬神經元電鏡觀察結果

3 討 論

AD是一種不可逆的慢性神經退行性疾病，表現為學習記憶障礙及記憶減退，尤其是近事遺忘突出，性格和行為改變，執行能力下降等癡呆特征[15]。AD患者多見于70歲以上老人，存在性別差異，女性多于男性。隨著病情的進展，患者記憶能力嚴重喪失且生活不能自理，大小便失禁，并出現原始反射，最后昏迷，常死于感染。專家學者致力于AD的研究已逾百年。最初，普遍認為其與細胞外淀粉樣斑塊形成和神經組織中神經原纖維纏結密切相關。最近有報道指出，以上特征包括神經突觸變性、海馬神經元數目減少。但是，新的組織學證據認為，AD的病理學特征仍是細胞外淀粉樣斑塊形成和神經組織中神經原纖維纏結。

目前，用于治療AD的藥物包括多奈哌齊、利斯的明、加蘭他敏和美金剛等藥物。這些藥物能在一定程度上延緩記憶喪失，改善溝通能力和其他的行為障礙。然而，其效果甚微，甚至出現嚴重的不良反應[16]。迄今為止，沒有藥物能有效阻止記憶喪失、認知障礙以及學習能力、判斷力、日常生活能力喪失[17-18]。也就是說，沒有任何藥物能治愈AD。

紅景天是一種從植物的根莖中提取的傳統中藥，廣泛用于心腦血管疾病、抗衰老、抗疲勞、抗腫瘤，同時具有保護中樞神經系統作用，可抑制caspase-3和細胞內鈣離子水平進而保護海馬神經元，發揮神經保護作用，其機制可能與PI3K/AKT信號通路相關[19-20]。研究表明，紅景天通過降低活性氧族生成減少小鼠腦缺血再灌注損傷，進而延長小鼠的壽命[21]。此外，紅景天具有清除自由基的藥理作用。另有研究發現，紅景天對小鼠缺血再灌注腦保護作用是通過減少神經細胞凋亡，其機制可能與PI3K/AKT信號通路相關聯[10]。紅景天激活PI3K，進而激活AKT，使其磷酸化，從而影響凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax，同時降低caspase-3、caspase-6和caspase-9表達水平，發揮抗凋亡作用，從而具有神經保護作用[22-23]。研究發現，神經膠質細胞中1 052種基因受紅景天調控，其中95種基因與神經疾病相關，可見紅景天可進行多靶點調控細胞應答，從而作用于多個信號通路[24-25]。

本研究采用AD大鼠模型，Morris水迷宮測試發現，紅景天干預后，大鼠的學習記憶能力明顯改善，p-GSK-3β/GSK-3β、p-AKT/AKT、bcl-2水平升高，bax水平下降。表明紅景天改善認知與PI3K/AKT信號通路有關。電鏡觀察海馬神經元超微結構顯示，紅景天干預后細胞器數目較AD大鼠增多，染色質邊集有明顯改善。

綜上所述，紅景天可改善實驗性老年癡呆大鼠認知功能，其機制可能是通過PI3K/AKT/GSK3β通路上調抑制凋亡蛋白bcl-2、下調促凋亡蛋白bax實現的。隨著研究的深入，紅景天越來越受到研究者青睞，其抗氧化、抗凋亡以及抗炎作用，已經得到普遍認可。紅景天的藥理機制已逐漸明了，改善AD認知功能障礙的療效亦被廣大研究者和臨床工作者接受。今后的研究將進一步探討紅景天改善認知的機制，以便為臨床治療AD提供有效的理論依據，從而提高AD患者的生活質量，緩解其家庭的壓力。

[1] Hasegawa M,Watanabe S,Kondo H,et al. Murayama,S. 3r and 4r tauisoforms in paired helical filaments in Alzheimer's disease[J]. Acta Neuropathol,2014,127(4)：303-305.

[2] 王玲，朱鳴峰.阿爾茨海默病發病機制的研究進展[J].吉林醫學，2013，34(3):531-532.

[3] 金艷玲，周洋，王洪海，等.紅景天苷對大鼠腎臟缺血再灌注損傷的預防與保護作用[J].中藥新藥與臨床藥理，2010，21(1)：22-25.

[4] 余夢瑤，許曉燕，江南,等.阿爾茨海默癥痰濕蘊結與β-淀粉樣肽聚集及自噬相關性探討[J].中華中醫藥雜志，2016，31(9)：3632-3635.

[5] 趙歡,陳曉宇,姬飛虹,等.遠志提取物清除β淀粉樣蛋白的途徑及其信號通路的研究[J].安徽醫科大學學報,2014,49(7):913-917.

[6] 陳琛,張中豪,吳秋艷,等.APP/Tau/PS轉基因阿爾茨海默病小鼠行為學、炎癥反應及自噬水平的研究[J].中華神經醫學雜志，2015,14(2)：119-124.

[7] 張中豪，石慶學，溫蕾，等．轉基因阿爾茨海默病小鼠tau蛋白的病理變化[J].中華老年醫學雜志，2014，33(6)：657-660．

[8] 王楠，何遠宏，潘雙杰，等.阿爾茨海默病患者認知功能及血清銅、同型半胱氨酸、尿酸水平、tau和A阻-42蛋白的檢測[J].鄭州大學學報：醫學版，2014，43(7):1283-1285.

[9] 王麗.研究證實驅動阿爾茨海默病癥狀的“元兇”為Tau蛋白，而非Aβ蛋白[J].海南醫學，2016，35(10)：1003.

[10] 張艷梅，陳金，鄔偉，等.GCs對VD大鼠行為學及海馬腦區tau蛋白P-tau蛋白、Aβ淀粉樣蛋白表達影響的實驗研究[J].中風與神經疾病雜志，2015,23(6)：494-496.

[11] Wang S,He H,Chen L,et al. Protective effects of salidrosidein the MPTP/MPP(+) -induced model of Parkinson's diseasethrough ROS-NO-related mitochondrion pathway[J]. Mol Neurobiol,2015,51(2):718-728.

[12] Lu-Nguyen NB,Broadstock M,Schliesser MG,et al. Transgenic expression of human glial cell line-derived neurotrophicfactor from integration-deficient lentiviral vectors is neuroprotectivein a rodent model of Parkinson's disease[J]. Hum Gene Ther,2014,25(7):631-641.

[13] Panossian A,Hamm R,Wikman G,et al. Mechanism of actionof Rhodiola,salidroside,tyrosol and triandrin in isolated neuroglialcells:an interactive pathway analysis of the downstream effectsusing RNA microarray data[J]. Phytomedicine,2014,21(11):1325-1348.

[14] Xiao L,Li H,Zhang J,et al. Salidroside protects Caenorhabditiselegans neurons from polyglutamine-mediated toxicity by reducing oxidative stress[J]. Molecules,2014,19(6):7757-7769.

[15] Kim M,Shin MS,Lee JM,et al. Inhibitory effects of isoquinolinealkaloid berberine on ischemia-induced apoptosis via activation ofphosphoinositide 3-kinase/protein kinase B signaling pathway[J]. Int Neurourol J,2014,18(3):115-125.

[16] 趙敏，邊芳，田卓華，等.甘草、紅景天及黃芪粗提取物對UVB誘導小鼠皮膚慢性光損傷的保護作用[J].世紀科技研究與發展，2015,34(5)：295-299.

[17] 朱建建.紅景天苷對腦缺血再灌注損傷保護機制概述[J].山東中醫雜志，2013，21(10)：765-767.

[18] 韓雪嬌，郭娜，朱美宣，等.紅景天苷藥理作用及其作用機理研究進展[J].中國生物藥學雜志，2015,35(1)：171-175.

[19] 張德鈞，元王濤，李夢婷，等.藏藥洮河紅景天trnS-G基因與紅景天苷含量變異的相關性研究[J].基因組學與應用生物學，2015，22(1)：130-135.

[20] Li S,Wu C,Chen J,et al. An effective solution to discover synergisticdrugs for anti-cerebral ischemia from traditional Chinese medicinalformulae[J]. PLoS One,2013，8(11):e78902.

[21] Lin TY,Lin YW,Lu CW,et al. Berberine inhibits the release of glutamate in nerve terminals from rat cerebral cortex[J]. PLoS One,2013,8(6):e67215.

[22] Jiang W,Wei W,Gaertig MA,et al. Therapeutic effect of berberine on Huntington's disease transgenic mouse model[J]. PLoS One,2015,10(7):e0134142.

[23] Friedemann T,Schumacher U,Tao Y,et al. Neuroprotective activity of coptisine from Coptis chinensis(Franch)[J]. Evid Based Complement Alternat Med,2015,2015:827308.

[24] Ahmed T,Gilani AU,Abdollahi M,et al. Berberine and neurodegeneration:a review of literature[J]. Pharmacol Rep，2015,67(5):970-979.

[25] Zhang JK， Yang L， Meng GL， et al. Protection by salidroside against bone loss via inhibition of oxidative stress and bone-resorbing mediators[J]. PloS One，2013，8(2):e57251.

(本文編輯：劉斯靜)

The therapeutic effects of Rhodosin on cognition in AD rats

LIU Na1, WANG Jin-hua1, WANG Hua-long1, QIU Hui-qing1, WANG Yan-yong1,2*， WANG Ming-wei1,2

(1.DepartmentofNeurology,theFirstHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050031，China；2.BrainagingandCognitiveNeuroscienceLaboratoryofHebeiProvince,Shijiazhuang050031，China)

Objective To study the therapeutic effects of Rhodosin on cognitive function in Alzheimer disease(AD) rats. Methods The AD rat models and Rhodosin intervention models were established. Learning and memory abilities of rats were tested by the Morris water maze. The protein expressions of AKT, p-AKT, GSK-3β, P-GSK-3β, bcl-2 and bax were examined via Western blotting. And the ultrastructure of hippocampus neurons was determined by transmission electron microscopy. Results After modeling, the latent period of the model group and Rhodosin group was prolonged than that in the control group. After treatment, the latent period of the model group and Rhodosin group was prolonged than that in the control group. The Rhodosin group was shorter than the model group(P<0.05). After modeling, the stay time of the target quadrant in model group and Rhodosin group was significantly shorter than the control group, the difference was statistically significant(P<0.05). After treatment, the stay time of the target quadrant in model group and Rhodosin group was also shorter than the control group, but the Rhodosin group was longer than the model group(P<0.05). The protein expressions of p-GSK-3β in the model group and Rhodosin group was lower than that in the control group, Rhodosin group higher than model group. The protein expressions of p-AKT in Rhodosin group was higher than control group and model group, model group lower than control group(P<0.05). The protein expressions of bcl-2 in model group lower than control group, Rhodosin group was higher than control group and model group(P<0.05). The bax protein expressions in model group was high than control group and Rhodosin group(P<0.05). Conclusion Rhodosin could improve cognitive function in AD rats. Its mechanisms may be through up-regulating anti-apoptotic protein bcl-2 and down-regulating pro-apoptotic protein bax via the PI3K/AKT/GSK3β pathway.

Alzheimer disease; RHODIOLA SACRA； apoptosis

2016-11-01；

2016-11-30

河北省醫學科學研究重點課題(20110301)；河北省醫學適用技術跟蹤項目(GL2014015)；河北省應用基礎研究計劃重點基礎研究項目(14967725D)

劉娜(1981-)，女，河北趙縣人，河北醫科大學第一

醫院主治醫師，醫學碩士，從事神經內科疾病診治研究。

R745.7

A

1007-3205(2017)02-0133-05

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.02.003

*通訊作者。E-mail:13223455938@163.com