不同方法建立雙足大鼠脊柱側彎動物模型的特點比較

李鵬飛，賈 楠，趙 鵬，楊建博，劉金錄，靳憲輝

(哈勵遜國際和平醫院骨病科，河北 衡水 053000)

·論 著·

不同方法建立雙足大鼠脊柱側彎動物模型的特點比較

李鵬飛，賈 楠，趙 鵬，楊建博，劉金錄，靳憲輝*

(哈勵遜國際和平醫院骨病科，河北 衡水 053000)

目的探討不同方法建立雙足大鼠脊柱側彎動物模型的特點及意義。方法脫離哺乳期SD大鼠40只，隨機分為4組各10只。通過手術完全切除大鼠的前肢及尾部。對照組10只，單純制作雙足大鼠動物模型。設立3個實驗組，其中6-巰基嘌呤組腹腔內注射6-巰基嘌呤(30 mL/kg)，低褪黑素組腹腔內注射 2-苯基-N-乙酰色胺(0.2 mg/kg)，肉毒毒素組椎旁肌注射肉毒毒素。對4組實驗動物手術前后的脊柱曲度指數(Cobb角)、椎體高度變化情況及脊柱側彎特點進行比較評估。結果所有實驗動物均存活至完成脊柱側彎建模實驗。對照組未發生脊柱側彎，3個實驗組雙足鼠均發生了脊柱側彎。4組大鼠Cobb角均呈增加趨勢，6-巰基嘌呤組Cobb角的幅度最大；4組椎體高度均呈升高趨勢，與對照組比較，6-巰基嘌呤組和肉毒毒素組椎體高度丟失，低褪黑素組高度增加，4組組間、時點間、組間·時點間交互作用差異均有統計學意義(P<0.05)。結論腹腔注射6-巰基嘌呤、 2-苯基-N-乙酰色胺以及椎旁肌注射肉毒毒素均可成功建立SD雙足大鼠脊柱側彎動物模型。

脊柱側凸;模型,動物;大鼠

動物模型在特發性脊柱側彎的病因學研究中具有重要作用[1]。針對特發性脊柱側彎的多種發病原因，一系列動物模型被制作出來[2]。文獻已經對各種特發性脊柱側彎的動物模型進行了報道,包括鼠類、山羊、狗、兔、雞、豬等[3]。其中，對鼠類脊柱側彎的病因學動物模型研究報道較多：包括切除前肢及尾部建立雙足直立行走動物模型；6-巰基嘌呤產生神經源性損傷；低褪黑素造成神經內分泌調節功能異常；肉毒毒素使椎旁肌損傷功能異常[4]。但都未針對不同的特發性脊柱側彎動物模型產生的機制及特點進行深入的比較研究。本研究針對神經源性損傷、神經內分泌調節功能異常、椎旁肌功能異常等發病原因分別進行了動物模型的建立，旨在探討不同方法建立雙足大鼠脊柱側彎動物模型的機制特點及對臨床工作的指導意義。報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 選擇出生時間相同的40只脫離哺乳期SD大鼠(健康，等級為一級，普通實驗動物)，雌、雄各20只，體質量92.5～106.8 g，均由河北省實驗動物中心提供，并在室溫18～22 ℃、相對濕度40%～60%、光照12 h/d的條件下進行常規分籠飼養。本研究中動物實驗過程及處置方法均嚴格遵守動物倫理學要求，并經過作者所在單位倫理委員會的批準。實驗于2015年2—12月在河北醫科大學第三醫院動物實驗中心、影像學中心及骨科研究所完成。

1.2 實驗方法 將SD大鼠飼養觀察1周。之后隨機分為對照組、6-巰基嘌呤組、2-苯基-N-乙酰色胺組(低褪黑素組)、肉毒毒素組并編號，每組10只SD大鼠。手術均由同一實驗人員完成切除前肢及尾部的操作。大鼠術前停止飼喂及飲水8 h術前準備。應用10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉(0.3 mg/g)。麻醉后對SD大鼠進行備皮、消毒，之后應用手術絲線雙重結扎大鼠前腿近端及尾巴基底部，應用手術刀小心分離肩肱關節后完全離斷SD大鼠雙前肢，并在SD大鼠尾根部完全離斷其長尾，完成SD大鼠雙足直立動物模型的建立。術后處理：對照組術后不進行任何干預；6-巰基嘌呤組術后腹腔注入6-巰基嘌呤(6-mercaptopurine,Glaxo Smith Kline Company,US)，注射劑量嚴格按照30 mL/kg計算；低褪黑素組術后腹腔注入 2-苯基-N-乙酰色胺(luzindole,Sigma Company,US)，注射劑量嚴格按照0.2 mg/kg計算；肉毒毒素組術后椎旁肌內注射肉毒毒素(botulinum toxin A,Allergan Botox Cosmetic Company,US，100 U/tube)，注射劑量嚴格按照50 U/kg計算，使用1 mL標準注射器給予雙足大鼠椎旁肌多點注射肉毒毒素。

1.3 一般情況 雙足大鼠完成切除前肢及尾部術后改為高圍欄飼養籠。嚴密觀察雙足大鼠進食、飲水等生物學行為。并觀察其直立行走情況。每日對雙足大鼠生物學行為觀察記錄并測量體質量。

1.4 影像學觀察 術后拍攝脊柱全長正位X線片。拍攝脊柱全長正位X線片觀察之前采用10%水合氯醛進行腹腔注射麻醉。嚴格按照0.3 mg/g使用麻醉藥物水合氯醛。將SD雙足大鼠固定脊柱承重直立向上的體位后，保持直立位拍攝脊柱全長正位X線。需要指出的是：拍攝脊柱全長正位X線片頻率為每月1次。

1.5 圖像處理及測量 應用Photoshop CS4.0軟件進行圖像處理及測量。由同一實驗人員仔細測量各組每一只實驗動物術前及術后的脊柱曲度指數(Cobb角)。確定脊柱側彎產生的標準為：Cobb角>10 °。同時，由同一實驗人員測定各組每一只SD雙足大鼠的胸、腰椎各個節段的椎體高度。具體方法為通過Photoshop CS 4.0軟件作出上下終板中央的連線，測量連線之間的距離。將測量的胸、腰椎高度進行統計后，計算每一只雙足大鼠胸、腰椎的椎體高度之和，應用統計軟件進行分析。

1.6 統計學方法 應用SPSS 17.0統計學軟件分析數據。計量資料比較采用重復測量的方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 雙足大鼠生物學行為 所有大鼠均順利度過圍手術期。所有實驗動物均無嚴重手術并發癥及死亡。完成大鼠切除前肢及尾部的操作術后改為高圍欄飼養籠。觀察發現雙足大鼠逐漸開始直立體位站立及并較快適應直立行走。同時，由同一實驗人員持續觀察雙足大鼠進食、飲水等生物學行為。雙足大鼠在整個研究過程中生物學行為均正常，未發現明顯異常。雙足大鼠術后適應性直立行走情況良好。在拍攝脊柱全長正位X線片的麻醉及拍攝過程中均無實驗動物死亡。同時，在搬運實驗動物及全部拍攝過程中，實驗人員均未發現雙足大鼠異常生物學行為。

2.2 脊柱側彎形成情況 術后3個月時，測定4組每只雙足大鼠的胸、腰各節段椎體高度，計算椎體高度之和。對照組雙足大鼠Cobb角均<10 °，尚未產生脊柱側彎；3個實驗組雙足大鼠Cobb角均大于10 °，符合脊柱側彎標準。4組大鼠Cobb角均呈增加趨勢，6-巰基嘌呤組Cobb角增加幅度最大，4組組間、時點間、組間·時點間交互作用差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1，圖1。

表1 各組應用藥物干預后脊柱曲度變化比較Table 1 Comparison of Cobb angle changes after drug intervention in each group

圖1 雙足大鼠脊柱側彎產生情況

2.3 椎體高度變化情況 術后4組椎體高度均呈升高趨勢，與對照組進行比較，6-巰基嘌呤組和肉毒毒素組椎體高度丟失，低褪黑素組高度增加，4組組間、時點間、組間·時點間交互作用差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2，圖2。

表2 各組應用藥物干預后椎體高度變化比較Table 2 Comparison of total height of vertebral body changes after drug intervention in each group

圖2 顯示雙足大鼠椎體高度測量方法

3 討 論

特發性脊柱側彎對青少年成長發育影響重大[5]。病因學研究對其意義重大[6]。因此，建立特發性脊柱側彎的動物模型是闡明其病因、發展、診斷、治療的重要方法[7]。雙足大鼠具有飼養和繁殖容易、產生脊柱側彎時間短、存活率較高等特性[8]。同時，其脊柱解剖學結構與人類相似[9]。這些特點使其在建立特發性脊柱側彎的動物模型研究中應用非常廣泛[10]。有學者對于實驗室誘發雙足大鼠產生脊柱側彎的方法進行了廣泛研究，主要有藥物致畸、低褪黑素致畸、椎旁肌生物力學失衡致畸三大類[11]。但是，對于不同方法制作脊柱側彎鼠類動物模型的原理及效果尚存爭議。

本研究選擇6-巰基嘌呤進行雙足大鼠腹腔注射，成功模擬神經源性損害誘發脊柱側彎畸形的動物模型。首先，6-巰基嘌呤可以直接影響并抑制次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶的生物活性。同時，6-巰基嘌呤可以明顯抑制嘌呤核苷酸補救合成途徑。本研究應用6-巰基嘌呤產生明顯脊柱側彎原理即是利用其對動物機體的不良反應，主要為脊髓神經功能紊亂。最終，脊髓所支配脊柱區域的血液、養分供應破壞，嚴重影響脊柱發育，并進一步阻礙神經元、神經纖維生長及抑制功能形成，使機體喪失對脊柱發育平衡性的支配和調控。在脊髓和脊柱均失去有效調節之后，進入發育異常的惡性循環，側彎畸形進展加速。本研究發現6-巰基嘌呤抑制脊柱生長，使脊柱發育異常，椎體高度丟失。

國內外學者在褪黑素水平與脊柱側彎關系方面進行了大量的研究[12]。低褪黑素水平與脊柱側彎存在正相關，低褪黑素水平可以誘發脊柱側彎[13]。進展期脊柱側彎患者血液中褪黑素水平與健康人比較明顯降低。但對于特發性脊柱側彎患者血液中褪黑素水平是否均降低這一觀點存在較大爭議。關于低褪黑素與脊柱側彎畸形誘發的相關性分析中，目前文獻報道主要有兩方面原因：首先，低褪黑素可以影響中樞神經系統的信號傳導；其次，低褪黑素直接影響脊柱脊髓的調節功能。并且可以使成骨細胞的功能受損，最終誘發脊柱側彎畸形。本研究應用肉毒毒素進行椎旁肌內注射，成功制作出了脊柱側彎模型。筆者對實驗動物椎旁肌肉內注射肉毒毒素后進行了持續觀察及X線片精確測量，發現椎旁肌肉內注射肉毒毒素的雙足大鼠的椎體高度無明顯改變。說明椎旁肌的生物力學失衡對脊柱本身的生長發育影響不大。

神經源性損害產生的脊柱側彎的原因主要為脊髓的神經功能紊亂。本研究發現雙足大鼠脊髓神經源性損害所致的脊柱側彎嚴重。因此，脊髓神經源性損害對研究人體所出現的嚴重特發性脊柱側彎有重要意義。證明脊髓營養水平不足、支配功能下降、神經源性損害為脊柱側彎發病原因之一。其次，機體的低褪黑素水平可以影響其中樞神經系統的信號傳導，影響脊柱脊髓的調節功能，使成骨細胞的功能受損。低褪黑素水平與脊柱側彎的關系一直是研究的熱點。本研究證明褪黑素拮抗劑所造成的機體褪黑素水平降低可以誘發雙足大鼠產生脊柱側彎。證明機體長期處于低褪黑素水平可誘發脊柱側彎，同時其與脊柱側彎的進展相關。低褪黑素水平與神經源性損害產生的脊柱側彎的原因有相似之處，即兩者均可以產生脊髓的神經功能調節紊亂。但對兩者進行椎體高度變化分析比較發現，神經源性損害產生的脊柱發育異常表現為椎體短小，而低褪黑素水平誘發的脊柱側彎的特點為椎體高度增加。神經源性損害與低褪黑素水平兩者在對脊柱生長發育過程中的影響存在明顯差異，但均可誘發機體產生脊柱側彎。表明特發性脊柱側彎可由于不同原因誘導產生。提示在臨床工作之中，要根據患者自身不同情況分析患者脊柱側彎產生的原因，更深一步了解脊柱側彎的特點、病因、類型，積極指導預防及治療工作。同時，兩者所產生脊柱側彎的部位及程度均不可控，均不適合應用于固定及矯正脊柱側彎畸形的相關實驗研究。

對實驗組脊柱側彎特點進行比較，發現椎旁肌生物力學失衡所致脊柱側彎原理簡單，即椎旁肌肉收縮及自身調節能力喪失，最終造成實驗動物兩側椎旁肌生物力學產生不可逆性變化，脊柱在椎旁肌攣縮和牽引作用下失去平衡，產生脊柱側彎。椎旁肌生物力學失衡所致脊柱側彎對脊柱骨性結構、脊髓神經功能和脊柱韌帶結構產生的影響相對小。而低褪黑素水平與神經源性損害產生脊柱側彎可以使椎體結構發育明顯異常、脊髓神經功能明顯受損、脊柱韌帶結構失去平衡。值得指出的是，可以通過調整肉毒毒素的注射劑量，控制椎旁肌肉組織攣縮和牽引作用。

本研究中，6-巰基嘌呤組和肉毒毒素組小鼠椎體高度丟失，低褪黑素組高度增加。筆者認為6-巰基嘌呤其明顯抑制了嘌呤核苷酸補救合成，致使雙足鼠神經調控功能受到嚴重損害，破壞了脊柱區域血液、養分供應及自身調節能力，最終椎體生長發育被抑制，椎體高度明顯丟失。與之不同，肉毒毒素對小鼠椎旁肌纖維組織嚴重破壞后，椎旁肌對脊柱的輔助支撐和共同維持穩定性的作用消失，雙足小鼠站立后由于四足類動物缺乏橫突間韌帶等結構，脊柱椎體及椎間盤承重增加，穩定性下降，對椎體發育起到負面作用。更重要的是，肉毒毒素對椎旁肌破壞后，生物機體自身修復過程中產生的纖維化、瘢痕化對脊柱發育、椎體高度增長產生阻力。褪黑素水平可影響脊柱的縱向生長，筆者認為其機制主要為對椎體生長板軟骨細胞的影響，高濃度褪黑素可以抑制椎體生長板軟骨細胞的增殖和分化，然而低褪黑素水平可起到促進作用。本研究中應用低濃度褪黑素促進了雙足小鼠椎體生長發育，椎體高度增加。但是隨時間增加(小鼠周齡)椎體生長板軟骨細胞的增殖能力逐漸下降。

本研究對3個實驗組脊柱側彎畸形特點進行比較研究，椎旁肌生物力學失衡所致脊柱側彎畸形的原理最簡單，即椎旁肌肉收縮及自身調節能力喪失，最終造成實驗動物兩側椎旁肌的生物力學產生不可逆性變化，脊柱在椎旁肌攣縮和牽引作用下失去平衡，產生脊柱側彎畸形。椎旁肌生物力學失衡所致脊柱側彎畸形對脊柱骨性結構、脊髓神經功能和脊柱韌帶結構產生的影響相對小。而低褪黑素水平與神經源性損害產生脊柱側彎畸形可以使椎體結構發育明顯異常、脊髓神經功能明顯受損、脊柱韌帶結構失去平衡。值得指出的是，椎旁肌生物力學失衡所致脊柱側彎畸形最具特點：即可以通過調整肉毒毒素的注射劑量，控制椎旁肌肉組織攣縮和牽引作用。實驗人員可以利用這一特點制作出不同側彎程度和部位的側彎動物模型。在進行固定及矯正脊柱側彎畸形以及相關實驗研究的過程中，所建立的動物模型側彎畸形程度和部位一致將使實驗更具有說服力。下一步實驗人員將致力于特發性脊柱側彎畸形的干預及治療。

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(本文編輯：趙麗潔)

The characteristics of different methods to create scoliosis model of bipedal rats

LI Peng-fei, JIA Nan, ZHAO Peng, YANG Jian-bo, LIU Jin-lu, JIN Xian-hui*

(DepartmentofOrthopaedics,HarrisonInternationalPeaceHospital,Hengshui053000,China)

Objective To explore the mechanism and the significance of different methods to establish scoliosis model of bipedal rats. Methods Forty SD rats were randomly divided into four groups. The front limb and tail of SD rats was completely removed. The control group only create model of bipedal rats. Ten bipedal rats in group A were given intraperitoneal injection of 6-mercaptopurine(30 mL/kg). Tenbipedal rats in group B received intraperitoneal injection of luzindole(0.2 mg/kg). 10 bipedal rats in group C received intramuscular injection of botulinum toxin A. The spinal curvature index, change of intervertebral height and the characteristics of scoliosis were compared between the four groups before and after operation. Results All the experimental animals survived to complete the modeling experiment of scoliosis. In control group, there was no scoliosis. All three experimental groups had scoliosis. Cobb's angle of rats were all increased in four groups and showed an raising trend. However, cobb's angle of the 6- mercaptopurine group increased the maximum. Vertebral height of rats in four groups were all increased and showed a rising trend. Compared with control group, the height of vertebral body was lost in 6-mercaptopurine group and botulinum toxin group. However, the vertebral height of low melatonin group height was increased. There were significant differences among groups, time points, interaction of group and point-in-time(P<0.05). Conclusion Application of intraperitoneal injection 6-mercaptopurine can establish a severe scoliosis model. Intraperitoneal injection of luzindole proved that low concentration of melatonin can induce scoliosis. The botulin can damage the fiber tissue of paraspinal muscle. It is proved that destruction of biomechanical balance of paraspinal muscle can creat scoliosis models.

scoliosis; models, animal; rats

2016-06-03；

2016-07-05

李鵬飛(1985-)，男，河北肅寧人，哈勵遜國際和平醫院主治醫師，醫學博士研究生，從事脊柱外科疾病診治研究。

*通訊作者。 E-mail:pengflyl@163.com

R682.3

A

1007-3205(2017)02-0154-05

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.02.008