HPV16 DNA存在狀態在宮頸病變篩查和預測中的應用價值

王麗麗，張 琳，王曉娜

(河北醫科大學第二醫院婦科，河北 石家莊 050000)

·論 著·

HPV16 DNA存在狀態在宮頸病變篩查和預測中的應用價值

王麗麗，張 琳，王曉娜

(河北醫科大學第二醫院婦科，河北 石家莊 050000)

目的研究人乳頭瘤病毒16(human papillomavirus 16，HPV16)陽性患者病毒存在狀態與宮頸病變級別的關系，以及HPV16整合型對高級別宮頸病變的預測和診斷價值。方法選擇已明確病理學結果且為HPV16陽性的165例患者為研究對象，其中宮頸炎18例，子宮頸上皮內瘤變(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)1為24例，CIN2為45例，CIN3為51例，宮頸癌27例。應用多重PCR檢測165例患者宮頸脫落細胞中HPV16 DNA的E2、E6基因，通過比較E2和E6的面積灰度值得到E2/E6比值，比較不同級別病變中HPV16 DNA存在狀態。結果在炎癥中HPV16單一型別感染的檢出率為6.73%(7/104)，CIN1中其檢出率為10.58%(11/104)，CIN2中為29.81%(31/104)，CIN3中為30.77%(32/104)，宮頸癌組中為22.11%(23/104)。隨著宮頸病變級別的升高，HPV16單一型別感染的檢出率逐漸增加(Z=3.119，P=0.002)。在宮頸炎、CIN1、CIN2、CIN3、宮頸癌中混合型的檢出率分別為16.67%(3/18)、20.83%(5/24)、46.67%(21/45)、62.74%(32/51)、77.78%(21/27)，將不同級別宮頸病變整合型的檢出率進行統計學分析，差異有統計學意義(χ2=28.009，P<0.05)。HPV16 DNA整合狀態診斷宮頸病變的靈敏度為60.16%，特異度為79.07%，陽性預測值為90.24%，陰性預測值為40.96%，其診斷宮頸病變有較高的特異度和陽性預測值。結論運用多重PCR擴增HPV16的E2和E6基因，E2/E6比值可以作為判斷病毒存在狀態的指標，與宮頸病變的級別相關。此外，整合在HPV感染進程中是一個早期事件，隨著宮頸病變級別的升高，整合的發生率增加。

宮頸腫瘤；宮頸上皮內瘤樣病變；人乳頭瘤病毒16

宮頸癌是發展中國家最常見的惡性腫瘤之一，高危型人乳頭瘤病毒(high risk human papillomavirus，hrHPV)持續感染被認為是宮頸癌和子宮頸上皮內瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)的主要病因。研究表明50%以上的宮頸癌患者中均可以檢測到人乳頭瘤病毒16(human papillomavirus 16，HPV16)。HPV在體內存在的狀態可能與宮頸病變的發生發展有關，本研究通過檢測宮頸脫落細胞中的HPV16 DNA的存在狀態與宮頸病變級別的相關性，判斷其是否可作為預測HPV16 DNA陽性者發展至CIN風險的標志物，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2009年1月—2012年9月于我院門診行新柏液基細胞學技術(Thinprep cytologic test，TCT)或HPV檢測者為研究對象，其中對細胞學結果大于等于無明確診斷意義的不典型鱗狀上皮細胞病變(atypical squamous cell of undertermind significant，ASCUS)或HPV分型檢測高危型陽性者行陰道鏡檢查，對異常陰道鏡圖像患者采取多點活組織檢查送病理，以病理診斷作為金標準。所有研究對象為已知病理學結果和HPV16感染者，按病理學診斷分為炎癥、CIN1、CIN2、CIN3和宮頸癌5個級別組。從上述各組中選取165例HPV16陽性患者，年齡19～77歲，平均(40.7±9.4)歲，取其剩余細胞學標本應用多重PCR技術進行HPV基因存在狀態的檢測。其中宮頸脫落細胞血標本取自病理組織學檢查之前，時間間隔為1個月。入選標準：非妊娠期，未合并其他性傳播疾病，無宮頸治療史，無盆腔放療和化療史。

1.2 宮頸脫落細胞的收集 由經過規范培訓的醫生采集，并于4 ℃冰箱保存，用于HPV基因分型檢測，剩余的標本放置于-80 ℃冰箱儲存，用于HPV整合狀態的檢測。

1.3 HPV分型檢測 采用凱普核酸分子快速導流雜交基因芯片技術進行21種基因分型檢測。

1.4 陰道鏡下活組織檢查和組織病理學診斷 對TCT大于等于ASCUS者以及高危型HPV16陽性者，均于陰道鏡下取活組織檢查，并送組織病理學診斷。

1.5 DNA提取和觀察 選取HPV16 DNA陽性的宮頸脫落細胞標本，進行離心、提取，將 DNA產物保存在-20 ℃冰箱以備實驗應用，長期保存則放置于-80 ℃冰箱中。

1.6 電泳 取6 μL PCR反應所得的DNA產物與上樣緩沖液混合后，點樣于樣品槽中，在1×TBE緩沖液中110 V/era電壓下電泳約20 min，并設置陰性對照。在波長254 nm紫外燈下觀察結果，應用凝膠電泳圖像分析軟件分析HPV16E2、E6基因PCR擴增所得的產物電泳條帶的面積灰度值。從而可以確定目的基因的含量。通過計算E2/E6比值判斷HPVl6感染的體內狀態：游離型E2/E6>0.9；整合型E2/E6為0～0.15；混合型E2/E6>0.15～0.9。

1.7 統計學方法 應用SPSS 13.0統計軟件處理數據。等級資料比較采用秩和檢驗；計數資料比較采用趨勢χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 HPV16單一感染和多重感染與宮頸病變級分布 165例研究對象中HPV16單一型別感染占63.03%(104/165)，HPV16的多型別感染占36.97%(61/165)，包括了2～5種HPV型別。與HPV感染的多型別比較，隨著宮頸病變級別的升高，HPV16單一型別感染的檢出率逐漸增加。不同感染類型的宮頸病變分級分布差異有統計學意義(Z=3.119，P=0.002)，見表1。

表1 不同級別CIN和宮頸癌中HPV16感染類型的比較Table 1 Comparison of different types of HPV 16 of patients with different grades of CIN and cervical cancer (例數，%)

2.2 不同級別宮頸病變中HPV16 DNA的存在狀態 在165例研究對象中，不同級別宮頸病變的HPV16在體內存在狀態共檢出游離型83例，游離型和整合型共同存在的混合型82例，尚未發現單純整合型。

炎癥、CIN1、CIN2、CIN3、宮頸癌5個病變級別中HPV16 DNA混合型的檢出率分別為16.67%(3/18)、20.83%(5/24)、46.67%(21/45)、62.74%(32/51)、77.78%(21/27)，隨著宮頸病變嚴重程度的增加，混合型的檢出率逐漸增加，差異有統計學意義(趨勢χ2=28.009，P<0.05)，見表2。

表2 不同級別CIN和宮頸癌中HPV16 DNA存在狀態比較Table 2 Comparison of physical states of HPV-16 DNA of patients with different grades of CIN and cervical cancer (例數，%)

2.3 HPV16 DNA整合狀態對CIN2及以上宮頸病變的診斷價值 HPV16 DNA整合狀態診斷宮頸病變的靈敏度為60.16%，特異度為80.95%，陽性預測值為90.24%，陰性預測值為40.96%，其診斷和篩檢宮頸病變有較高的特異度和陽性預測值，見表3。

表3 HPV16 DNA整合狀態對CIN2及以上宮頸病變的診斷價值Table 3 HPV16 integration state for the prediction of ≥CIN2 lesions (例數)

3 討 論

3.1 HPV E2與E6、E7的結構和功能 HPV E2蛋白可調節病毒的轉錄和復制，在病毒DNA復制及抑制病毒早期基因轉錄方面起重要作用[1]。HPV早期基因產物E6和E7蛋白利用多種機制逃避宿主的免疫監視，使病毒持續感染，并解除對細胞周期和細胞凋亡的調控，從而促進DNA損傷的積累，最終促使細胞轉化，在腫瘤發生中起關鍵作用[2]。有研究指出HPV在體內的整合狀態可作為宮頸病變進展的生物標志[3]。Cricca等[4]研究發現E1、E2基因的破壞和缺失在宮頸高級別病變中的發生率遠遠高于在宮頸低級別病變中的發生率。因此，在高級別宮頸病變中，E2基因可以作為判斷HPV16 DNA整合入宿主基因組的指標[5]。Boulet等[6]通過檢測綜合乳頭瘤病毒序列的多聚合酶鏈反應(detection of integrated papillomavirus sequences polymerase chain reaction，DIPS-PCR)和基因測序系統性評價了E2/E6作為病毒整合狀態判定方法的可靠性，并且Chang等[7]的研究也肯定了HPV整合狀態在診斷宮頸病變中的靈敏度和特異度。

目前檢測病毒存在形式的方法主要是通過E2/E6比值判斷，本研究中將E2/E6為0～0.15判斷為整合型[8]，E2/E6>0.15～0.9判斷為混合型，E2/E6>0.9判斷為游離型[9]。隨著宮頸病變級別的升高，E2/E6比值逐漸降低，且呈線性相關。有學者發現E2/E6比值大多介于0和0.8之間，也就是說不同級別病變中的病毒大多以游離和混合型共同存在于宿主細胞中，本研究中不同級別病變中均存在混合型的HPV。

本研究以165例不同級別的HPV16 DNA陽性患者為研究對象，但未發現以純整合型存在的形式，一方面可能是因為樣本量小，另一方面可能是因為本研究的引物只是針對E2區域設計的，整合可能發生在E2以外的區域。本研究中HPV混合型在慢性宮頸炎中的檢出率為16.67%，在CIN1中為20.83%，在CIN2中為46.67%，在CIN3中為62.74%，在宮頸癌中為77.78%。可見隨著宮頸病變嚴重程度的增加，整合的發生率相應增加，這也表明HPV16的整合可以發生在CIN即癌前病變階段，甚至可發生在慢性宮頸炎患者中，這與Manawapat等[10]在一項關于病毒基因組整合狀態及病毒載量的前瞻性隊列研究結論相一致。然而在過去的 10年中，一些學者則認為整合是發生在浸潤性宮頸癌中的一個事件。本研究結果顯示宮頸癌中HPV16以游離形式存在的為22.22%。Nambaru等[11]研究同樣發現宮頸癌中HPV16以20%～40%的游離形式存在。這表明HPV16的整合是宮頸病變發生發展的早期事件，但隨著宮頸病變級別的升高，整合的發生率升高。整合的發生與HPV的致癌機制相關，HPV16 DNA整合可導致E6、E7的過表達，這是導致細胞向惡性轉化的機制之一[12]。

3.2 病毒整合狀態與持續感染 病毒持續感染者發展至宮頸高級別瘤變的風險較高，病毒基因組以整合狀態存在時一方面難以被細胞免疫所清除[2]，另一方面由于E2負調控蛋白的缺失增加了病毒癌基因的表達，這些因素促進了病毒持續感染的發生[13]。導致病毒基因以整合狀態存在的婦女比以游離狀態存在的婦女有更高的發展為持續感染的風險。本研究為回顧性研究，為了進一步研究HPV16整合和疾病進展之間的關系，后期的研究應致力于對這些患者的隨訪。

由于整合和持續感染之間的關系，整合狀態的檢測可作為篩查宮頸病變的輔助指標以及預測高級別CIN和浸潤性宮頸癌的轉歸指標，并可能成為判斷病毒感染持續的有效預測指標。

3.3 整合狀態與多重感染 有關整合狀態與多重感染之間的聯系鮮有報道，有學者發現在宮頸癌中更常表現為單一感染而非多重感染，本研究結果也支持這一觀點，隨著宮頸病變級別的升高，HPV感染更趨向于單一型別的感染。在HPV16和HPV18雙重感染中，比起任一型別單一感染，病毒基因組更多以游離狀態存在，表明可能存在競爭細胞整合位點的相關機制[14]。因此，多重感染可能并不增加宮頸癌發生的風險。HPV DNA可以游離型、整合型、混合型3種方式存在于宿主細胞中，不同存在形式與病毒的致病能力相關，整合是宮頸病變發生發展中的常見事件，是宮頸病變進展的關鍵因素之一。病毒基因組整合入宿主細胞后可導致宿主基因組不穩定、抑癌基因功能失活，從而導致細胞永生化，引發宮頸惡性腫瘤的發生。

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(本文編輯：許卓文)

Application value of HPV16DNA integration in screening and prediction of cervical lesions

(DepartmentofObstetricsandGynecology,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China)

Objective To evaluate the correlation between physical status of human papillomavirus 16(HPV16) and degree of cervical lesion and the role of HPV-16 integration in prediction and diagnosis of high squmous intrepithelil lesion(HSIL). Methods A total of 165 cervical cells samples were collected from the patients with HPV positive. All patients′ pathological results were definite, including 18 cases of cervicitis, 24 cases with cervical intraepithelial neoplasia(CIN)1, 45 cases with CIN2, 51 cases with CIN3 and 27 cases with cervical cancer. The total genomic DNA were extracted and multiplex PCR were performed for detection of the level of HPV E2 and E6 genes. Comparing the physical status of HPV16 in different degrees of cervical lesions according to the E2/E6 ratio. Results The single infection ratios of HPV16 in cervicitis, CIN1, CIN2, CIN3 and cervical cancer were 6.73%(7/104), 10.58%(11/104), 29.81%(31/104), 30.77%(32/104), 22.11%(23/104), respectively. Single HPV infection rate was gradually increasing with the processing of cervical lesion level. The integration ratios of HPV16 in cervicitis, CIN1, CIN2, CIN3 and cervical cancer were 16.67%(3/18), 20.83%(5/24), 46.67%(21/45), 62.74%(32/51), 77.78%(21/27), respectively. The difference was statistically significant(P<0.05). The sensitivity and specificity of diagnosis of cervical lesions by HPV16 DNA integrate status were 60.16% and 79.07% and the positive predictive value and negative predictive value were 40.96% and 90.24%. Conclusion The E2/E6 ratio of HPV16 can be used as indicators to judge the state of viral integration, and the integration status of HPV16 was accompanied with the processing of cervical lesion level.

uterine cervical neoplasms; cervical intraepithelial neoplasia; human papillomavirus 16

2016-01-20；

2016-11-21

王麗麗(1965-)，女， 河北泊頭人，河北醫科大學第二醫院主任醫師，醫學學士，從事宮頸病變、普通婦科疾病診治研究。

R737.33

A

1007-3205(2017)02-0164-04

WANG Li-li, ZHANG Lin, WANG Xiao-na

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.02.010