高效液相色譜法測定復方制劑中的大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚和二苯乙烯苷的含量

張 霞，程曉葉，廖 曼，張玉倩，張蘭桐，樊淑彥

(河北醫科大學藥學院藥物分析教研室，河北 石家莊 050017)

·論 著·

高效液相色譜法測定復方制劑中的大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚和二苯乙烯苷的含量

張 霞，程曉葉，廖 曼，張玉倩，張蘭桐*，樊淑彥

(河北醫科大學藥學院藥物分析教研室，河北 石家莊 050017)

目的建立高效液相色譜法(high efficiency liquid chromatography,HPLC)同時測定明目上清片中4種化學成分(大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚)的含量以及降脂寧片中二苯乙烯苷的含量。方法明目上清片采用Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以甲醇-四氫呋喃-1%磷酸(84∶7∶9)為流動相，流速1.0 mL/min，檢測波長254 nm，進樣量20 μL；降脂寧片采用Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以甲醇-0.1%磷酸為流動相等度洗脫，流速1.0 mL/min，檢測波長320 nm，進樣量20 μL。結果大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚分別在0.500～4.00(r=0.999 3)、0.370～2.96(r=0.999 0)、1.10～8.80(r=0.999 1)、1.00～8.00 (r=0.999 3) ng范圍內呈良好線性關系，回歸方程分別為Y=8.60×103+9.62×104X、Y=-1.16×104+1.20×105X、Y=7.41×103+1.20×105X、Y=4.13×103+6.91×104X；二苯乙烯苷在0.218～1.31 μg范圍內線性關系良好(r=0.998 8)，回歸方程為Y=-6.33+3.18×103X。明目上清片含量測定的平均回收率分別為97.8%、97.8%、98.7%和99.5%，相對標準差(relative standard deviation，RSD)(n=6)分別為1.2%、0.89%、1.7%和1.7%；降脂寧片的平均回收率為96.6%，RSD(n=6)=0.65%。結論該方法簡便快速，準確度高，專屬性好，可以用于明目上清片以及降脂寧片的質量控制。

大黃酸；二苯乙烯苷；色譜法，反相

明目上清片由黃芩、黃連、熟大黃、桔梗、天花粉、石膏、麥冬等21味中藥材加工制成，具有清熱散風、明目止痛的功效，用于暴發火眼、紅腫作痛、頭暈目眩、眼邊刺癢、大便燥結、小便赤黃等癥狀[1]。明目上清片現收錄于2015年版《中國藥典》第一部[2]，其項下測定黃連的有效成分鹽酸小檗堿。明目上清片中的被測4種成分均屬于蒽醌類化合物，且均具有抗菌、抗衰老等藥理作用。文獻報道測定明目上清片中黃芩苷的含量[3]及橙皮苷的含量[4]，并且有關文獻報道高效液相色譜法(high efficiency liquid chromatography,HPLC)同時測定明目上清片中的10種成分，其中包括大黃素、大黃酚[2]。由于只監測中藥復方制劑中的一種指標成分不能有效控制其質量，故本研究建立了HPLC同時測定明目上清片中大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的含量。 降脂寧片由制何首烏、山楂(去核)、荷葉、決明子等4味中藥組成，其功效是軟化血管、降血脂，用于高血脂、心律不齊和增強冠狀動脈血液循環等癥。降脂寧顆粒標準簡單，且無含量測定項[5]。有文獻報道測定降脂寧片中的葛根素[6]及大黃素的含量[5]。制何首烏是降脂寧片的主要成分，且具有補肝腎、益精血、烏須發、強筋骨之功效，二苯乙烯苷是制何首烏中的主要成分。本研究建立了HPLC測定降脂寧片中二苯乙烯苷的含量。結果表明以上方法簡便可靠、靈敏迅速，成本及工作量降低，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 儀器 高效液相色譜儀，LC98-Ⅱ型，UV98-Ⅱ可變波長紫外可見分光檢測器，P98-Ⅱ高壓輸液泵，T-98型柱溫箱，北京溫分分析儀器技術開發有限公司；N-2000雙通道色譜工作站，浙江大學智能信息工程研究所；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司。美國 Aligent 1200 高效液相色譜儀，包括四元泵、柱溫箱、自動控溫進樣器、二極管陣列檢測器(DAD)，Agilent 化學工作站。

1.2 藥品 明目上清片(長春海外制藥集團有限公司，批號22020997)；大黃酸(批號110757-200206)、大黃素(批號110756-200110)、大黃酚(批號110796-200615)、大黃素甲醚(批號110758-200610)和二苯乙烯苷對照品(批號0844-1005)均購自于中國食品藥品檢定研究院；降脂寧片(長春萬德制藥有限公司，批號20120801、20140101、20140201)；甲醇為色譜純，水為蒸餾水，其余試劑均為分析純。

1.3 色譜條件 色譜柱Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，波長254 nm，流動相為甲醇-四氫呋喃-1%磷酸 (84∶7∶9)，進樣量20 μL，流速為1.0 mL/min， 柱溫25 ℃。分別取混合對照品溶液、供試品溶液以及陰性對照溶液進去色譜儀在上述色譜條件下進樣，記錄色譜圖。1～4的保留時間分別約為4、6、8和10 min，分離度均>1.5，理論塔板數均>10 000。陰性對照不干擾含量測定。

色譜柱Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，波長320 nm，流動相為甲醇A-0.1%磷酸B(35∶65)，進樣量20 μL，流速為1.0 mL/min，柱溫25 ℃。按上述色譜條件，分別吸取對照品溶液、供試品溶液以及陰性對照溶液進入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。二苯乙烯苷的保留時間約為17 min，分離度>1.5，理論塔板數>10 000。陰性對照不干擾含量測定。

1.4 溶液的制備

1.4.1 混合對照品溶液 精密稱取大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚對照品適量，分別置25 mL量瓶中，用甲醇溶解，稀釋至刻度。得到濃度分別為25、18.5、55和50 mg/L的對照品儲備液。分別精密量取大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚對照品儲備液2 mL，置同一10 mL量瓶中，用甲醇定容，得到大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚濃度分別為5.0、3.7、11、和10 mg/L的混合對照品溶液。精密稱取二苯乙烯苷對照品適量，置25 mL量瓶中，加入適量的甲醇溶解稀釋，用甲醇定容，得到濃度為43.5 mg/L的對照品溶液。

1.4.2 供試品溶液 取明目上清片20片，去糖衣，研細，稱取粉末約1.0 g，精密稱定，置50 mL的具塞錐形瓶中，精密加入95%乙醇25 mL，精密稱定，超聲30 min冷卻，用95%乙醇補足減失的質量，靜置，濾過，精密量取續濾液10 mL，置燒瓶中，水浴蒸干，精密加入30%乙醇-鹽酸溶液(10∶1)溶液15 mL，置水浴加熱水解1 h，立即冷卻，用氯仿強力振搖提取4次，每次15 mL，合并氯仿液，置水浴蒸干，殘渣用甲醇溶解，移置25 mL量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

取降脂寧片20片，去薄膜衣，精密稱定，研細，稱取粉末約1.0 g，精密稱定，置50 mL的具塞錐形瓶中，加入75%甲醇25 mL，精密稱定，超聲30 min，冷卻，用75%甲醇補足減失的質量，靜置，用0.45 μm的微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

1.4.3 陰性樣品溶液 按照處方比例，取桔梗、天花粉、石膏、麥冬和玄參等適量，按照制劑工藝制備缺熟大黃的空白樣品，再按照“1.4.2”項下方法制備陰性對照溶液。

按照處方比例，取山楂(去核)、決明子、荷葉適量，按照制劑工藝制備缺制何首烏的空白樣品，再按照“1.4.2”項下方法制備陰性對照溶液。

2 方法學驗證

2.1 標準曲線的繪制 精密量取明目上清片混合對照品溶液0.5、1、2、3、4 mL，分別置5 mL量瓶中，用甲醇定容，得到大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚對照品的濃度范圍為0.500～4.00、0.370～2.96、1.10～8.80和1.00～8.00 mg/L，按照“1.3”項下色譜條件，分別進樣20 μL，記錄色譜圖，分別以1～4的濃度為X/c(mg/L)為橫坐標，峰面積為縱坐標Y，進行線性回歸。得回歸方程見表1。

表1 4種化合物回歸方程以及相關系數Table 1 Regression equation and correlation coefficient of four kinds of compound

取降脂寧片對照品溶液，按照“1.3”項下色譜條件，分別進樣5、10、15、20、30、40 μL。記錄色譜圖，以進樣量為X(μg)為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程見表2。

表2 二苯乙烯苷的回歸方程以及相關系數Table 2 Regression equation and correlation coefficient of stibene glucoside

2.2 精密度試驗 精密吸取同一明目上清片供試品溶液，以上述色譜條件連續進樣5次，計算大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚峰面積的相對標準差(relative standard deviation ，RSD)(n=5)分別為1.6%、1.2%、0.85%和0.94%。表明儀器精密度良好。

精密吸取降脂寧片同一供試品溶液，按上述色譜條件連續進樣5次，記錄色譜峰面積，得到二苯乙烯苷的峰面積RSD=0.86%(n=5)。

2.3 穩定性試驗 精密吸取同一明目上清片供試品溶液，在室溫下放置0、2、4、8、12、24 h，分別進樣20 μL。計算大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚峰面積的RSD值(n=5)分別為1.6%、0.63%、2.2%和1.5%。表明供試品溶液中的4個待測成分在室溫放置24 h 內基本穩定。

取樣品粉末(降脂寧片)1.0 g，精密稱定，按照“1.4.2”項下配制供試品，于0、2、4、8和12 h進樣測定，二苯乙烯苷的的峰面積RSD=0.76%(n=5)。表明供試品溶液的待測成分二苯乙烯苷在室溫下12 h內穩定。

2.4 重復性試驗 取同一批號明目上清片樣品1 g，精密稱取5 份，分別按“1.4. 2”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件分別進樣20 μL。計算樣品中大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的平均含量分別為50.5、93.6、170和70.6 μg/g，RSD(n=5)分別為2.0%、1.9%、1.8%和2.1%。表明方法重復性良好。

取同一批降脂寧片樣品(批號20120801)5份，每份1.0 g，精密稱定，分別采用“1.4.2”項下的方法配制供試品溶液，進樣測定，二苯乙烯苷的平均含量為630 μg/g，RSD為0.30%(n=5)。

2.5 回收率試驗 采用加樣回收法。取已測定的同一批次的明目上清片樣品6份，每份0.5 g，精密稱定，置500 mL 圓底燒瓶中，分別加入各組分的對照品適量，按“1.4.2”項下方法制備供試溶液，在上述色譜條件下分別進樣20 μL，計算回收率。結果大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的平均回收率分別為97.8%、97.8%、98.7%和99. 5%，RSD(n=6)分別為1.2%、0.89%、1.7%和1.7%。

取已知含量的降脂寧20片(批號20120801)，研細后精密稱取6份，每份0.5 g，加入二苯乙烯苷對照品溶液適量，按照“1.4.2”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，按外標法計算得二苯乙烯苷的平均回收率96.6%，RSD=0.65%(n=6)。

2.6 樣品含量測定 取3批次明目上清片各1 份，分別按照“1.4.2”項下方法制備供試品溶液(明目上清片)，按上述色譜條件分別進樣20 μL，進行測定，以外標法計算1～4含量，結果見表3。

取3批樣品，按“1.4.2”項下方法制備供試品溶液(降脂寧片)，分別進樣測定，按外標法計算二苯乙烯苷的含量，結果見表4。

表3 4種待測成分含量測定結果 Table 3 Determination of four kinds of compound (n=3，μg/g)

表4 二苯乙烯苷的含量測定結果Table 4 Determination of stibene glucoside (n=3，μg/g)

3 討 論

3.1 提取工藝的確定 分別采用加熱回流、超聲提取等方法對明目上清片中大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚4種成分的提取效率的考察，結果表明超聲和回流提取待測成分得到相似的提取效率，且超聲提取方法簡便快速，故選用超聲提取；根據相關文獻[7-8]，又進一步考察不同濃度的提取溶劑乙醇即25%、50%、75%和95%，結果表明低濃度的乙醇提取不完全，故選擇95%的乙醇作為提取溶劑。而且還進一步考察超聲10、20、30、40和50 min處理待測樣品，結果表明30 min后，4種指標成分已基本提取完全，故將30 min作為最佳超聲提取時間。

考察降脂寧片中二苯乙烯苷的提取效率，結果選擇超聲提取，采用75%甲醇提取[9]；同時對比不同超聲時間20、25、30、35 和40 min，顯示超聲時間為30 min的待測組分峰面積達到峰值，30 min后各組分峰面積均變化不大，故選擇30 min為最佳提取時間。

3.2 測定波長的選擇 明目上清片中的4種待測成分均在254 nm處有最大紫外吸收波長，且254 nm檢測時各成分峰形最佳，分離度好，故選擇254 nm為檢測波長[10-12]。二苯乙烯苷的最大吸收波長為320 nm，故選擇320 nm為檢測波長[13-16]。

3.3 流動相的選擇 HPLC測定大黃酸、大黃素等含量常用流動相是不同比例的甲醇-1%磷酸系統，也有采用甲醇-冰醋酸，乙腈-0.2%磷酸等系統[12，17-18]，由于乙腈毒性大，故采用甲醇。在實驗中改變流動相中甲醇、四氫呋喃和1%磷酸緩沖液的配比，最終確定流動相為甲醇-四氫呋喃-1%磷酸(84∶7∶9)。

根據相關文獻[16, 19-23]，HPLC測定二苯乙烯苷含量常用流動相甲醇-水、乙腈-水系統，結果發現2種流動相系統對待測組分的分離影響無顯著性差異，考慮到乙腈的毒性較大且經濟成本較高，故選擇甲醇-水流動相系統。進一步考察磷酸對待測組分的影響，分別加入0.05%、0.1%和0.15%的磷酸，結果顯示添加0.1%磷酸后，峰形得到了改善且基線穩定，分離度良好，故確定以甲醇-0.1%磷酸為流動相。

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(本文編輯：許卓文)

Simultaneous determination of rhein,emodin, chryophanol,physcion and stibene glucoside in compound preparations by HPLC

ZHANG Xia, CHENG Xiao-ye, LIAO Man, ZHANG Yu-qian, ZHANG Lan-tong*, FAN Shu-yan

(DepartmentofPharmaceuticalAnalysis,SchoolofPharmacy,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China)

Objective To develop an analysis method for Rhein, Emodin, Chrysophanol and Physcion in Mingmu Shangqing tablets and stibene glucoside in Jiangzhining tablets by high efficiency liquid chromatography(HPLC). Methods The four constituents of Mingmu Shangqing tablets were separated on Kromasil C18column (250 mm×4.6 mm, 5 μm) using a mobile phase consisted of methanol-tetrahydrofuran-1% phosphoric acid in water at the detection wavelength of 254 nm. The constituent stibene glucoside in Jiangzhining tablets was separated on Kromasil C18column (250 mm×4.6 mm, 5 μm) using a mobile phase consisted of methanol 0.1% phosphoric acid in water at the detection wavelength of 320 nm. Results Rhein, Emodin, Chrysophanol and Physcionhad had a good liner relationship within the scope of 0.500 to 4.00(r=0.999 3), 0.370 to 2.96(r=0.999 0), 1.10 to 8.80(r=0.999 0), 1.00 to 8.00(r=0.999 0) ng, respectively. And their regression equation were Y=8.60×103+9.62×104X, Y=-1.16×104+1.20×105X, Y=7.41×103+1.20×105X, Y=4.13×103+6.91×104X, respectively. The average recoveries(n=6)were 97.8%， 97.8%， 98.7%， 99.5% and with relative standard deviation(RSD)(n=6) of 1.2%， 0.89%， 1.7%， 1.7%. Stibene glucoside had a good liner relationship within the scope of 0.218 to 1.31 ng(r=0.999 0). The regression equation was Y=-6.33+3.18×103X. The average recoveries were 96.6% and with RSD of 0.65%. Conclusion The method is rapid,simple,accurate and with good reproducibility and can be used in quality control of Mingmu Shangqing tablets and Jiangzhining tablets.

Rhein; stibene glucoside; chromatography, reverse-phase

2016-01-27；

2016-02-24

張霞(1991-)，女，河北衡水人，河北醫科大學藥學院藥理學碩士研究生，從事藥物分析研究。

*通訊作者。E-mail: zhanglantong@263.net

R944

A

1007-3205(2017)02-0201-05

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.02.019