豫西地區雞源大腸桿菌的耐藥性研究

（1.河南森隆獸藥有限公司，河南 鄭州 450000；2.河南省獸藥監察所）

豫西地區雞源大腸桿菌的耐藥性研究

王清玲1，王麗2，劉淑鶴1

（1.河南森隆獸藥有限公司，河南 鄭州 450000；2.河南省獸藥監察所）

從洛陽地區規模化養雞場采集病料，經大腸桿菌顯色培養基鑒定分離得耐藥性大腸桿菌菌株。對21個抗菌藥物進行抗菌活性測定，采用與膜通透促進劑乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）和β-內酰胺酶抑制劑舒巴坦鈉聯用測定抗菌藥物的抗菌活性是否受影響。

大腸桿菌；耐藥；96孔板；聯合用藥；MIC（50）；MIC（90）

大腸桿菌是埃希氏菌屬中最重要的一種細菌，屬于革蘭氏陰性兼性厭氧桿菌。隨著時間的推移，大腸桿菌的耐藥率大幅度上升，多重耐藥菌株劇增，耐藥譜增寬，大腸桿菌的耐藥問題已成為影響人類健康和養殖業發展的重要因素。近年來，集約化養禽場的其他疾病得到基本控制，但大腸桿菌病有明顯的上升趨勢，主要表現為大腸桿菌的耐藥能力不斷增強，使大腸桿菌病的動物臨床用藥選擇空間不斷縮小，治療效果也很難保障。因此，對雞源大腸桿菌的耐藥性進行監測與分析，對于指導臨床合理用藥及控制該病的流行非常重要。近年來，埃希氏大腸桿菌的耐藥性呈上升趨勢，關于大腸桿菌對抗生素的耐藥性問題，已在世界范圍內引起重視［1］。

1 材料和方法

1.1 試驗菌株

無菌采集病死雞的心、肝、脾、氣囊、十二指腸等，蘸取臟器的橫切面組織液。

1.2 培養基

LB培養基：蛋白胨1.2 g、酵母粉0.6 g、氯化鈉1.2 g、用蒸餾水補充至120 ml。麥康凱瓊脂培養基：稱取麥康凱瓊脂粉末54 g，加入1 000 ml蒸餾水中，加熱煮沸溶解，分裝，121℃高壓滅菌15 min備用。

1.3 器材與試劑

超凈工作臺，無菌96孔板，恒溫振蕩器，酶標儀，微量可調移液器，隔水式恒溫培養箱，蛋白胨，酵母提取物，TTC粉劑，NaCl，麥康凱瓊脂。

1.4 試驗方法

1.4.1 大腸桿菌的篩選與培養 從采取的病料中鉤菌劃線于麥康凱瓊脂平板上進行細菌培養與分離，置于37℃恒溫箱中培養20～22 h觀察生長情況，選定具有大腸桿菌菌落特征的可疑菌落繼續進行培養保存。直至呈現單一的中間深紅外周桃紅色、圓形、邊緣整齊、光滑、濕潤、中等大小的菌落。

1.4.2 藥敏性測定 采用96孔板微量稀釋法將抗菌藥物稀釋成最終濃度分別為1 μg/ml、2 μg/ml、4 μg/ml、8 μg/ml、16 μg/ml、32 μg/ml、64 μg/ml、128 μg/ml 8個梯度濃度，加入菌懸液后將96孔板搖勻，然后放置在37℃恒溫培養箱中培養20 h，再將96孔板各個附孔（邊緣附空除外）各加20 μl TTC染色，搖勻，37℃靜置4 h后吸出各附孔中的上清液，加200 μl二甲基亞砜（DMSO）溶解剩余的不溶絡合物，用酶標儀測吸光度。

1.4.3 聯合用藥 選藥敏性差的抗菌藥物分別與舒巴坦鈉和乙二胺四醋酸（EDTA）聯合用藥，再測抗菌藥物與舒巴坦鈉和EDTA同時聯合用藥，使加入的舒巴坦鈉與抗菌藥的濃度比為2∶1，EDTA的最終濃度為512 μg/ml，測定EDTA和舒巴坦鈉單獨與抗菌藥物聯用時對抗菌藥物抗菌活性的影響，及同時與抗菌藥物聯用時對活性的影響。

1.5 結果判定

抗菌藥物對大腸桿菌的抗菌活性用最終算出的最低抑菌濃度來判定。用聯合用藥的抗菌活性與單一用藥時抗菌藥物的抗菌活性對比，抑菌效果高于4倍或4倍以上的說明EDTA或（和）舒巴坦鈉對抗菌藥的活性有影響。

2 試驗結果

根據藥敏性在藥物最高濃度（128 μg/ml）未達到MIC（50）的及在128 μg/ml時對應的最大抑菌率由小到大的順序見表1：

根據MIC（50）值對抗菌藥物進行藥敏性由高到低進行排序，結果見表2：

根據MIC（90）值對抗菌藥物進行藥敏性由高到低進行排序，結果見表3：

表1 未達到最低抑菌濃度MIC（50）值的藥物排序表

表2 按最低抑菌濃度MIC（50）值大小的藥物排序表

表3 按最低抑菌濃度MIC（90）值大小的藥物排序表

3 結果分析

3.1 單一用藥試驗結果分析

藥敏試驗結果顯示在21個抗菌藥物中有5個藥物的抑菌效果已經很不明顯，對此大腸桿菌基本喪失了抑制作用。剩下的16個抗菌藥的抑菌率都可以達到MIC（50）值，保持一定的抗菌作用，占總藥物數量的76.2%；只有6個藥物抗菌能力可以達到MIC（90）值，具有很高的抗菌活性，占總藥物的28.6%。可見此株大腸桿菌對卡那霉素、鹽酸恩諾沙星、鹽酸環丙沙星、頭孢拉定和慶大霉素等藥物同時產生了很高的耐藥性；對鹽酸黃連素、痢菌凈、曲松鈉、磺胺六甲嘧啶鈉、鹽酸頭孢噻呋、磷酸素鈉、鹽酸土霉素、阿莫西林、乳酸諾氟沙星等藥物有較高的敏感性，對這些藥物的耐藥能力還不是很明顯；而對利福平、強力霉素、氟苯尼考、頭孢噻肟鈉、乳酸左氧氟沙星和痢菌凈等藥物有很高的敏感性，尚未對這些藥物長生耐藥性。

3.2 聯合用藥試驗結果分析

卡那霉素的聯合用藥數據顯示：卡那霉素與EDTA（512 μg/ml）聯用其抗菌效果整體有明顯的提高，隨著卡那霉素濃度的增加，抗菌活性呈穩步提高趨勢，但是提高的幅度并不大，卡那霉素的濃度在1 μg/ml和128 μg/ml的抑菌率分別是69.05%和80.60%；卡那霉素與舒巴坦鈉聯合用藥的抑菌效果隨卡那霉素和舒巴坦鈉的濃度提高（抗菌藥物∶舒巴坦鈉=1∶2）有大幅度的提高，卡那霉素濃度在16 μg/ml時的抑菌率達到52.72%，卡那霉素濃度為128 μg/ml時抑菌率達到99.20%，卡那霉素與EDTA和舒巴坦鈉同時聯合用藥的抑菌率提高的更加明顯，卡那霉素濃度在1μg/ml的抑菌率可達74.03%，在16 μg/ml濃度時的抑菌率可達到91.85%，而在卡那霉素單一用藥濃度為128 μg/ml時的抑菌率只有30.85%，所以，與卡那霉素單一用藥相比，EDTA和舒巴坦鈉分別或同時與卡那霉素聯合用藥時，對卡那霉素的抗菌活性均有很大的影響。

表4 聯合用藥對應的抗菌活性

鹽酸恩諾沙星聯合用藥數據顯示：鹽酸恩諾沙星與EDTA聯合用藥的抑菌效果整體提高很多，抑菌率隨鹽酸恩諾沙星的濃度提高而穩步提高，鹽酸恩諾沙星濃度在1μg/ml時候的抑菌率已經達到61.34%，在64 μg/ml時的抑菌率達到97.37%；鹽酸恩諾沙星與舒巴坦鈉聯用的抑菌效果隨藥物濃度的提高有大幅度的提高，鹽酸恩諾沙星的濃度在8 μg/ml時，抑菌率達到55.63%，濃度在32 μg/ml時的抑菌率達到93.67%；鹽酸恩諾沙星與EDTA和舒巴坦鈉同時聯用的抑菌效果提高更加明顯，在鹽酸恩諾沙星的濃度為1μg/ml時候的抑菌率可高達74.97%，32 μg/ml的藥物濃度抑菌率可達99.24%，而在鹽酸恩諾沙星單一用藥濃度為128 μg/ml時的抑菌率為32.96%，所以與鹽酸恩諾沙星單一用藥相比，EDTA和舒巴坦鈉分別或同時與鹽酸恩諾沙星聯合用藥時對鹽酸恩諾沙星的抗菌活性均有很大的影響。

鹽酸環丙沙星的聯合用藥數據顯示：鹽酸環丙沙星與EDTA聯合用藥的抑菌率整體有明顯的提高，但隨著鹽酸環丙沙星的濃度增加其抑菌率的提高并不是很明顯，鹽酸環丙沙星的濃度在1 μg/ml和128 μg/ml的抑菌率分別是73.54%和86.25%；鹽酸環丙沙星與舒巴坦鈉聯合用藥的抑菌效果隨鹽酸環丙沙星的藥物濃度的提高有大幅度的提高，鹽酸環丙沙星的濃度在1 μg/ml和128 μg/ml的抑菌率分別是7.02%和99.80%，可見藥物濃度對抑菌效果有很大影響，但是在藥物濃度低于16μg/ml時鹽酸環丙沙星與舒巴坦鈉聯合用藥的抑菌率卻比單一用鹽酸環丙沙星的抑菌率低，而在濃度大于16 μg/ml時的抑菌率提升非常大，鹽酸環丙沙星的濃度在32 μg/ml時抑菌率達到98.98%，可見鹽酸環丙沙星與舒巴坦鈉聯合用藥在藥物濃度超過16 μg/ml時才有提高抗菌活性的作用，并且作用很明顯。鹽酸環丙沙星與EDTA和舒巴坦鈉聯合用藥的抑菌效果不但對整體作用有提高，而且隨藥物濃度提高呈尾部提高的趨勢，藥物濃度在1 μg/ml時的抑菌率為74.22%，在16 μg/ml時的抑菌率達到92.34%，而鹽酸環丙沙星單獨用藥時在濃度為128 μg/ml時的抑菌率為43.89%，所以與單一用藥相比，EDTA和舒巴坦鈉分別或同時與鹽酸環丙沙星聯合用藥對鹽酸環丙沙星的抗菌活性均有很大的影響。

頭孢拉定聯合用藥數據顯示：頭孢拉定與EDTA聯合用藥的抑菌效果整體有很大提高，但是隨頭孢拉定的藥物濃度的增加對應的抑菌率提高幅度卻很小，頭孢拉定的濃度在1 μg/ml和128 μg/ml的抑菌率分別是60.42%和85.93%；頭孢拉定與舒巴坦鈉聯合用藥的抑菌率隨藥物濃度呈大幅度的提高趨勢，但是在頭孢拉定的濃度為128 μg/ml時的抑菌率只達到65.46%，較單一使用頭孢拉定時128 μg/ml的抑菌率為45.74%比，抑菌率的提升并不是很明顯，由于聯合用藥時藥物濃度在32 μg/ml時的抑菌率為57.56%，比單一用藥時128 μg/ml抑菌率為45.74%的抑菌率要高，舒巴坦鈉使頭孢拉定的抑菌活性提高超過4倍，所以舒巴坦鈉對頭孢拉定的抗菌活性有影響。頭孢拉定與EDTA和舒巴坦鈉聯合用藥的抑菌率整體上有很大的提高，隨藥物濃度的提高抑菌率提高范圍不大，頭孢拉定濃度在1 μg/ml時候抑菌率為73.20%，在16 μg/ml時抑菌率達到93.65%，頭孢拉定單一用藥時濃度在128 μg/ml時的抑菌率為45.74%，所以，EDTA和舒巴坦鈉同時與頭孢拉定聯合用藥對頭孢拉定的抗菌活性的影響非常大，而舒巴坦鈉與頭孢拉定聯合用藥對頭孢拉定的抗菌活性影響較小。

綜上所述，EDTA可以使抗菌藥物的活性有很大的提高，抗菌藥物濃度在1 μg/ml時的抑菌率可到達60%以上，對大腸桿菌病具有較強的治療效果，并且EDTA的市場價格很低，適合于工業生產和養殖戶的大規模使用；舒巴坦鈉的抑菌效果隨濃度的增加而增加，一般在藥物濃度為16 μg/ml時候抑菌率才可以達到50%以上，但是不同藥物對舒巴坦鈉的影響效果不同，并且舒巴坦鈉的市場價格較貴，不適合大規模使用。

4 討論

該試驗的藥敏數據一方面為該地區的用藥提供了一定的參考價值，另一方面也顯示了該地區動物源性大腸桿菌的耐藥性極其嚴重，有必要對本地區動物源性細菌的耐藥性進行跟蹤監測［2］。由于各地區的養殖模式和用藥習慣不同，導致細菌的耐藥性也存在一定的差異，所以各地區要根據實際情況對本地區細菌的耐藥性進行監測和抗菌藥的用藥管理。另外，通過對耐藥菌的耐藥機理研究，合理搭配藥物使失去抗菌活性的藥物重新恢復抗菌能力，從而有效控制細菌耐藥譜的擴增。

［1］汪洋，王育娜，易力，等.洛陽地區雞源大腸桿菌的耐藥性研究［J］.廣東農業科學，2011，（2）：124-125.

［2］茍清碧.鴨源致病性大腸桿菌耐藥性研究.西南大學碩士學位論文，2008：5.

S852.61＋2

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：1004-5090（2017）01-0003-03

2016-10-13）