姜黃素通過影響NF-κB信號通路促進肺癌細胞的放射敏感性

李曉波，徐 芳

(山東省滕州市棗莊科技職業學院醫學系 277500)

論著·基礎研究

姜黃素通過影響NF-κB信號通路促進肺癌細胞的放射敏感性

李曉波，徐 芳

(山東省滕州市棗莊科技職業學院醫學系 277500)

目的 探討姜黃素聯合放射治療對肺癌NCI-H460細胞的活性及肺癌小鼠放射敏感性的影響。方法 把肺癌NCI-H460細胞分為4組：空白對照組、姜黃素組、γ射線組及γ射線照射與姜黃素的聯合組；然后對各組分別應用噻唑藍(MTT)檢測細胞增殖，Annexin-V/PI染色法檢測細胞周期分布及凋亡，Western blot檢測凋亡相關蛋白Bcl-2及Bax的表達，RT-PCR 檢測核因子κB(NF-κB)基因表達情況。另外，建立小鼠肺癌模型同樣分為對應的4組,姜黃素按照1 mg/kg經尾靜脈注射于小鼠,腫瘤局部進行劑量為5 Gy射線照射,處理28 d后，比較不同處理組小鼠瘤體體積。結果 與空白對照組、姜黃素組和γ射線組比較，聯合組NCI-H460增殖率明顯降低(P<0.05)，凋亡率明顯增加(P<0.05)，抑凋亡蛋白Bcl-2表達明顯降低(P<0.05)，促凋亡蛋白Bax表達明顯增高(P<0.05)，NF-κB mRNA表達明顯降低(P<0.05)，并且腫瘤的體積有明顯減少(P<0.05)。結論 姜黃素可通過抑制γ射線處理條件下NF-κB的表達并促進細胞的G2/M期阻滯來增強肺癌NCI-H460細胞對γ射線的敏感性。

姜黃素；γ射線；細胞增殖；NF-κB;輻射耐受性

目前我國約有70%以上的腫瘤患者需要放療，并且對于許多肺瘤患者而言，放療是可用的治療方法之一[1]。但肺瘤患者往往在放療過程中出現抵抗，從而導致治療效果不理想[2-3]。因此，如何提高肺癌的放療敏感性，改善患者生活質量是目前急需解決的問題。

姜黃素(curcumin)是我國傳統中藥姜黃的主要活性成分。其主要成分包括多種調控生長因子，趨化因子及轉錄因子等，因此具有抗炎、抗氧化、抗凝、降血脂等多方面生物功能[4]。研究顯示，姜黃素可抑制體內、外腫瘤細胞的生長，是一種具有良好應用前景的抗癌新藥[5]。體外研究發現，姜黃素通過抑制(NF-κB)信號通路增強腫瘤細胞的放射敏感性[6-8]。但姜黃素能否增強肺癌的放療敏感性，目前還不清楚。本研究選用肺癌NCI-H460細胞系為研究對象，研究姜黃素對肺癌NCI-H460細胞放療敏感性的影響，為探索肺癌治療的新途徑提供實驗依據和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物來源 小鼠Lewis肺癌瘤系,購自北京協和細胞資源中心。C57BL/6純系小鼠，雄性，鼠齡4～6周，體質量16～22 kg，購自北京大學第一醫院實驗動物中心。

1.1.2 實驗試劑和儀器 姜黃素(上海同田生物技術公司)， RPMI-1640培養基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶(美國Gibco公司)，二甲基亞砜(DMSO，天津市天力化學試劑有限公司)，青霉素鈉和鏈霉素(華北制藥有限責任公司)，噻唑藍(MTT，美國Sigma公司)，二乙基亞硝胺(天津化學試劑研究所)，Trizol(美國Invitrogen公司)，流式細胞儀(美國BD公司)，抗體Bcl-2、Bax(Cell Signal公司)，Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(美國BD公司)，Spectra MR型酶標儀(美國Dynex公司)。

1.2 方法

1.2.1 NCI-H460細胞的γ射線照射條件 在室溫下采用60 Co γ 射線全身一次性照射，吸收劑量率1.701 Gy/min，一次性給予NCI-H460細胞5 Gy的吸收劑量。

1.2.2 NCI-H460的培養及傳代 采用含10%新生牛血清的RPMI-1640完全培養液，調整細胞密度為5×105個/mL接種于培養瓶中，待細胞長至80%～90%密度時，按比例傳代。實驗時取生長狀況良好的對數生長期細胞，分為空白對照組、γ射線組(5 Gy)、姜黃素組(10 μmol/L)和γ射線聯合姜黃素的聯合組(5 Gy射線聯合10 μmol/L姜黃素)。

1.2.3 細胞增殖實驗 采用MTT法檢測細胞增殖。取對數生長期NCI-H460細胞，調整細胞濃度為1.0×104個/mL，接種于48孔培養板中，按照試驗分組采用10 μmol/L姜黃素及5 Gy γ射線分別處理48 h，棄去培養基，每孔加入50 μL MTT，37 ℃繼續培養4 h，加200 μL DMSO，使甲瓚結晶完全溶解，酶標儀以參考波長630 nm，測量波長490 nm處的各孔的吸光度值(A)。實驗重復3次取平均值，計算細胞增殖活性。計算公式為細胞增殖抑制率(%)=(對照組A值-實驗組A值)/對照組A值×100%。

1.2.4 細胞凋亡實驗 應用PI和Annexin V染色的方法檢測細胞凋亡。取對數生長期NCI-H460細胞，接種于6孔培養板中。根據分組加入10 μmol/L姜黃素及5 Gy γ射線分別處理48 h。收集細胞及其上清液，1 000 r/min離心5 min后棄上清液，用預冷PBS將沉淀細胞清洗3遍，然后加入500 μL的 Binding Buffer懸浮細胞；加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，加入5 μL Propidium Iodide混勻，室溫避光反應15 min；1 h內流式細胞儀檢測。FITC陽性代表細胞凋亡發生，PI陽性代表細胞死亡。

1.2.5 細胞凋亡蛋白分析實驗 應用蛋白免疫印跡(Western blot)方法檢測凋亡相關蛋白的表達。取上述收集的細胞接種于6孔板中，根據實驗設計分組加入姜黃素及γ射線處理48 h后收集細胞。提取蛋白質，進行15%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白。半干轉膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,脫脂奶粉封閉1 h；分別加入一抗Bcl-2(1∶500)和Bax(1∶500)，4 ℃搖床孵育過夜；洗膜液清洗3次(每次10 min)，加入二抗(1∶5 000)室溫孵育3 h；洗膜液清洗3次(每次10 min)，用ECL發光顯色后在X射線洗片機(HQ 320XT)上曝光檢測，采用Quantity-One 4.6.2軟件進行圖像分析，以β-actin作為內參。

1.2.6 細胞周期分析實驗 按照上述分組，取對數生長期NCI-H460細胞，接種于6孔板中，根據實驗設計分組加入姜黃素及γ射線分別處理48 h后，收集細胞。用70%冰乙醇懸浮，吹打均勻，4 ℃放置12 h，PBS洗滌去乙醇，加入0.5 mL PBS重懸細胞，加入RNaseA至終濃度100 μg/mL，37 ℃ 溫浴30 min。加入PI至終濃度50 μg/mL室溫孵育30 min，采用流式細胞儀檢測細胞周期。

1.2.7 mRNA表達水平的分析 采用RT-PCR檢測NF-κB mRNA表達水平,按照上述分組，取對數生長期NCI-H460細胞，接種于6孔板中，根據實驗設計分組加入姜黃素及γ射線處理48 h，收集細胞。采用Trizol法提取細胞總mRNA，使用反轉錄試劑盒合成cDNA模板。采用RT-PCR分析NF-κB mRNA表達水平的變化。RT-PCR反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s；72 ℃ 8 min。產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離，0.5%溴化乙錠(EB)染色后，凝膠成像儀觀察圖像，分析各組間mRNA表達水平的差異。

1.2.8 C57BL/6小鼠Lewis肺癌模型建立及體內給藥、獲取標本 將小鼠Lewis肺癌瘤系制備成單細胞懸液，在小鼠右后肢皮下接種瘤細胞懸液，1×107個/只。將40只荷瘤小鼠隨機分為4個組，分為空白對照組、γ射線組(5 Gy)、姜黃素組(1 mg/kg)和γ射線聯合姜黃素的聯合組(5 Gyγ射線聯合1 mg/kg姜黃素)。姜黃素按照1 mg/kg經尾靜脈注射于小鼠,腫瘤局部進行照射，照射劑量為15 Gy,治療后28 d，分別將小鼠處死獲取腫瘤組織，標本凍存于-20 ℃冰箱。用游標卡尺測量各組小鼠腫瘤長徑(a)及短徑(b)，計算腫瘤平均體積。腫瘤體積計算公式：腫瘤體積(mm3)=a×b2/2。

2 結 果

2.1 MTT法測定姜黃素與γ射線對NCI-H460細胞增殖的影響 從圖1可以看出，空白對照組NCI-H460細胞增殖活躍，而經過10 μmol/L姜黃素、5 Gy的γ射線或γ射線聯合姜黃素處理48 h后姜黃素組，γ射線組，聯合組，細胞的增殖均受到不同程度的抑制，其中聯合組對細胞增殖活性抑制最明顯，差異有統計學意義(P<0.05)。

a:P<0.05，與其余各組比較。

圖1 姜黃素和γ射線對NCI-H460細胞增殖活性的影響

2.2 流式細胞術檢測γ射線與姜黃素對NCI-H460細胞凋亡率的影響 與空白對照組[(2.29±0.08)%]相比，γ射線組[(2.29±0.73)%]或姜黃素組[(2.41±0.59)%]細胞凋亡率有輕微增加，差異無統計學意義(P>0.05)；而聯合組[(215.21±0.32)%]明顯促進細胞凋亡，與空白對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3 γ射線與姜黃素對NCI-H460細胞周期的影響 流式細胞儀檢測細胞周期的結果表明，γ射線組或姜黃素組G2/M期細胞增多，但與空白對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。而聯合組與對照相比較則可明顯提高G2/M期細胞比例，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 姜黃素和γ射線對NCI-H460 細胞周期的影響

a:P<0.05,與其余各組比較。

2.4 γ射線與姜黃素對NCI-H460細胞凋亡相關蛋白表達的影響 與對照組比較，聯合組NCI-H460細胞內抗凋亡蛋白Bcl-2的表達明顯降低，促凋亡蛋白Bax的表達明顯升高(P<0.05)，而γ射線和姜黃素單獨處理則對Bcl-2和Bax蛋白的表達無顯著影響，見圖2。

A：Bcl-2蛋白表達；B：Bax蛋白表達；1：空白對照組；2：聯合組；3：姜黃素組；4：γ 射線組。

圖2 姜黃素和γ射線對NCI-H460細胞凋亡蛋白表達的影響

2.5 γ射線與姜黃素對NCI-H460細胞NF-κB mRNA表達的影響 與空白對照組比較，聯合組NCI-H460細胞NF-κB mRNA的表達明顯增加(P<0.05)，而γ射線或姜黃素單獨處理對NF-κB的表達無顯著影響，見圖3。

a：P<0.05，與其余各組比較。

圖3 姜黃素和γ射線對NCI-H460細胞NF-κB mRNA表達的影響

2.6 γ射線與姜黃素對肺癌小鼠腫瘤體積的影響 C57BL/6小鼠經過接種肺癌腫瘤細胞兩周后腫瘤直徑增至5～8 mm時，根據分組，對小鼠進行相對應的治療，與空白對照組相比，聯合組明顯抑制腫瘤的生長(P<0.05)，見圖4。

a：P<0.05，與其余各組比較。

圖4 姜黃素和γ射線對肺癌小鼠腫瘤體積的影響

3 討 論

肺癌逐漸成為危害人類生命的一種主要疾病之一。近年來許多學者嘗試采用常規的化療藥等來增加放射治療的效果[9-10]。盡管在某些情況下這種方法可以引起更好的治療效果，但受到特定了一些因素的限制，包括增加的毒性反應，正常組織的損傷，增加的不良反應等，因此獲得最小毒性的放療增敏劑對肺癌患者至關重要。

目前中藥放射敏感性的研究較少，探索中藥在此方面的作用具有重要意義，姜黃素便是其中之一。研究發現，姜黃素在達到12 mg/d的劑量時，無明顯的不良反應出現。也有研究發現，姜黃素對結腸癌具有預防作用[11]。本實驗研究姜黃素對肺癌NCI-H460細胞放療增敏的影響。結果發現，經過10 μmol/L姜黃素處理肺癌細胞，再進行5 Gy γ射線處理，能夠明顯抑制細胞增殖，增加細胞凋亡及促進促凋亡相關蛋白Bax的表達，抑制抑凋亡相關蛋白Bcl-2的表達。說明姜黃素可增強肺癌NCI-H460細胞對γ射線的敏感性。此外，肺癌動物模型結果顯示，γ射線與姜黃素聯合處理可明顯抑制腫瘤生長，說明聯合治療能起到很好的抑瘤效果。

大量的研究表明，NF-κB與腫瘤的放射耐受性密切相關。例如，在惡性膠質瘤、乳腺癌、膀胱癌、食道上皮細胞癌中均發現放射激活了 NF-κB，而激活的NF-κB可保護細胞免受放射影響而死亡，從而在細胞放射耐受性上起作用[12-13]。相反，通過對NF-κB的抑制可增加放射敏感性，主要表現為DNA 結合能力減弱、 凋亡增加，或細胞生長和克隆源生存下降[6,14-16]。本次研究發現，經過姜黃素和γ射線處理肺癌細胞后，顯著抑制NF-κB mRNA表達水平，提示姜黃素可能是通過抑制NF-κB的表達增強肺癌細胞放療敏感性。另外，NF-κB可控制細胞周期調控基因如 C-MYC、Cyclin D1的表達，從而使G1期及 S 期細胞增加，而G1/S 期、G2/M 期細胞減少[17]。而誘導腫瘤細胞G2/M期阻滯是影響腫瘤細胞放射敏感性的重要原因[18]。本次研究也發現，經過姜黃素和γ射線處理后的肺癌細胞，可導致細胞的G2/M期阻滯，從而進一步說明姜黃素是通過抑制NF-κB的表達，并進而誘導腫瘤細胞G2/M期阻滯達到增強肺癌細胞放療敏感性。

綜上，本研究發現姜黃素能夠增強肺癌細胞系NCI-H460的放療敏感性，而這種作用可能與其對NF-κB活性的抑制相關。本研究為姜黃素應用肺癌的增敏治療提供了新的實驗依據，為其在臨床中的應用奠定了基礎。

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Curcumin induce the radiosensitivity of human lung carcinoma NCI-H460 cells through the NF-κB pathway

LiXiaobo,XuFang

(DepartmentofMeolicme,VocationalCollegeofScienceandTechnology,Tengzhou,Shandong277500,China)

Objective To study the combination effect of curcumin and γ ray on the activity of human lung carcinoma NCI-H460 cells and explore the sensitization of curcumin to γ ray.Methods The NCI-H460 cells proliferation were detected by MTT,the cell cycle and apoptosis by flow cytometry.The expression of Bcl-2 and Bax were detected by Western Blot and the NF-κB gene expression by RT-PCR.In addition,the mice model of lung cancer was randomly divided into 4 groups:control group,curcumin group,γ ray group and combination group.After 28 days,the tumor volume was measured.Results The proliferation and cell cycle of NCI-H460 cells were inhibited and the apoptosis was increased in combination group.In addition,compared with curcumin group or γ ray group,the expression of Bcl-2 was inhibited,but the expression of Bax was increased and the mRNA expression of NF-ΚB was inhibited in combination group(allP<0.05).Also in combination group the tumor volume was significantly inhibited compared with curcumin group or γ ray group(allP<0.05).Conclusion Curcumin might induce the radiosensitivity of Human Lung Carcinoma NCI-H460 cells through the pathway.

curcumin;γ ray;cell proliferation;NF-κB;radiation tolerance

李曉波(1980-),講師，碩士，主要從事基礎醫學研究。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.06.009

R734.2

A

1671-8348(2017)06-0749-03

2016-10-19

2016-11-17)