溫度對復合肌原纖維蛋白結構及其表面疏水性的影響

李清正　張順亮　羅永康　馮力更

摘 要：溫度是影響蛋白質結構和功能變化的主要因素。實驗研究豬肉肌原纖維蛋白、鰱魚肉肌原纖維蛋白、復合肌原纖維蛋白（豬肉、鰱魚肉肌原纖維蛋白質量比1∶1），在不同溫度下二級結構、構象、濁度、表面疏水性的變化，并對其結構和表面疏水性變化規律的差別與相關性進行研究。結果表明：隨著溫度的升高，豬肉、鰱魚肉和復合肌原纖維蛋白的濁度都會升高；α-螺旋和無規則卷曲含量降低至穩定，β-折疊含量升高至穩定；蛋白質構象發生變化趨向穩定以適應新環境；表面疏水性升高后在高溫下輕微下降至穩定，蛋白質逐漸趨向完全變性。復合肌原纖維蛋白的熱變性規律與單一蛋白不完全相同，能夠結合豬肉、鰱魚肉肌原纖維蛋白的優點，改善肌原纖維蛋白隨溫度變化的性質。

關鍵詞：肌原纖維蛋白；豬肉；鰱魚；復合；溫度；結構；表面疏水性

肌原纖維蛋白是肌肉中主要的蛋白質之一，又稱鹽溶蛋白，由肌動蛋白、肌球蛋白、肌鈣蛋白等組成，占肌肉總蛋白含量的50%～55%。肌原纖維蛋白具有良好的凝膠能力[1]，其凝膠性能的變化影響著肉制品的品質，因此肌原纖維蛋白在肉制品，尤其是糜類肉制品加工中發揮著重要作用。

溫度是影響蛋白質結構和功能特性的主要因素。隨著溫度升高，蛋白質結構逐漸變化，蛋白質分子發生變性、分解或聚集，從而導致蛋白質的水合特性、凝膠特性、分子間相互作用等功能特性發生改變。此外，不同加熱方式對蛋白質結構和功能特性的影響也有差別[2-5]。蛋白質的熱變性對肌肉品質有很大影響，能夠改變肌肉的持水性能、色澤、質構等?？妆ＨA等[6]研究發現，豬肉肌原纖維蛋白在70～80 ℃之間保水性最好；Lin等[7]指出，新鮮草魚經熱處理后，硬度、彈性和咀嚼性等都會優于生鮮草魚；趙冰等[8]發現，100 ℃的中溫殺菌溫度能夠很好地保持乳化香腸的質構特性；姜啟興[9]指出，鳙魚肌原纖維蛋白中α-螺旋結構隨著溫度升高逐漸轉變為β-折疊、β-轉角和無規則卷曲，硬度、咀嚼性呈現先增后降的趨勢。

近年來，有關復合蛋白凝膠、復合魚糜的研究逐漸增多。劉蕾等[10]研究發現，凝膠化溫度為30 ℃，鰱魚和帶魚魚糜比例為7∶3時，復合魚糜凝膠強度高于鰱魚魚糜和帶魚魚糜；劉蕾等[11]還發現小黃魚和鰱魚肌原纖維蛋白

1∶1復合后的變化規律與小黃魚相似，而不同于鰱魚；王衛芳[12]則推測魚肉和豬肉肌原纖維蛋白復合后經加熱可形成一種復合凝膠，蛋白質之間發生了相互作用。但關于溫度對復合肌原纖維蛋白結構和表面疏水性影響及其關系的研究卻很少，因此有必要對此開展相應研究。

本實驗通過研究溫度對復合肌原纖維蛋白二級結構、構象和表面疏水性的影響，對比分析了復合肌原纖維蛋白和單一肌原纖維蛋白在熱加工中結構、表面疏水性的變化規律。這將為復合肉制品和中溫肉制品的開發提供理論依據，同時也為肉制品品質控制和加工工藝優化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉（后腿精瘦肉）購自北京美廉美超市學院路店；鰱魚購自北京健翔橋農貿市場，活運至實驗室。

所有試劑均為分析純 北京化學試劑公司。

1.2 儀器與設備

FW 2000分散均質機 上海弗魯克公司；GL-21M超速冷凍離心機 長沙平凡儀器儀表公司；FE20酸

度計 梅特勒-托利多（上海）儀器有限公司；WZ-100SP水浴鍋 上海申生科技有限公司；UV-2600分光光度計

上海優尼科儀器公司；F97PRO熒光分光光度計 上海棱光技術有限公司；Pistar π-180遠紫外圓二色譜儀 英國

Applied Photophysics公司。

1.3 方法

1.3.1 預處理

豬肉剔去脂肪和結締組織，切碎后備用。鰱魚擊暈后立即去鱗和內臟，流動水沖洗干凈，瀝干后取背部白肉備用。

1.3.2 肌原纖維蛋白的提取

參考姜啟興[9]的方法，略作改動。取5 g肉，加入20 mL pH7.0的50 mmol/L磷酸緩沖液（含0.1 mol/L NaCl、1 mmol/L乙二胺四乙酸、2 mmol/L MgCl2），均質后于4℃、8 000 r/min離心15 min，傾去上清液，沉淀重復上述步驟1次。所得沉淀加入20 mL冷的0.1 mol/L NaCl溶液，4℃、8 000 r/min離心15 min，傾去上清液，沉淀重復洗滌1次。最后所得沉淀即為肌原纖維蛋白。

1.3.3 蛋白質濃度的測定

參照楊建雄[13]的方法，采用雙縮脲法測定。

1.3.4 肌原纖維蛋白加熱處理

將所得肌原纖維蛋白沉淀用0.6 mol/L KCl溶液調至所需質量濃度，分別置于30、40、50、60、70、80、90、100 ℃水浴中加熱10 min，結束后立即放入冰水浴中降溫備用。對照組不經加熱處理（20 ℃）。

1.3.5 濁度的測定

調整蛋白質量濃度為2 mg/mL，加熱后于350 nm波長處測定吸光度，以0.6 mol/L KCl做空白。

1.3.6 蛋白質二級結構的測定

參考Zhang等[14]的方法略作修改，采用圓二色譜法測定。將肌原纖維蛋白用0.4 mol/L NaCl溶液稀釋至質量濃度為0.2 mg/mL，以0.4 mol/L NaCl溶液作為空白掃描，掃描范圍190～260 nm，比色皿長度0.1 cm。二級結構含量使用Dichroweb分析，在線網址http：//dichroweb.cryst.bbk.ac.uk[15]。

1.3.7 蛋白質構象變化的測定

采用熒光光度法。將肌原纖維蛋白用0.6 mol/L KCl溶液稀釋至質量濃度為0.05 mg/mL，激發波長295 nm，激發和發射狹縫寬度均為2.5 nm，波長掃描范圍310～400 nm，掃描速率3 000 nm/min。

1.3.8 表面疏水性的測定

以1-苯奈氨-8-磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）作為熒光探針，用pH 7.0的0.6 mol/L NaCl-10 mmol/L磷酸鹽緩沖液將肌原纖維蛋白質量濃度分別調至0.2、0.3、0.5、1.0 mg/mL。4種質量濃度的蛋白溶液各取2 mL，加入10 μL pH 7.0含8 mmol/L ANS的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液，混勻后用熒光分光光度計測定，條件為：激發波長和發射波長分別為390 nm和470（468） nm，λEX和λEM縫寬均為5 nm。用熒光強度對蛋白質濃度的斜率表示蛋白質表面疏水性。

1.4 數據處理

實驗數據處理采用Excel 2007，作圖采用Origin 8.5，顯著性分析采用SPSS 21。

2 結果與分析

2.1 溫度對復合肌原纖維蛋白濁度的影響

由圖1可知，隨著溫度升高，豬肉、魚肉、復合肌原纖維蛋白濁度都顯著增加（P<0.05），蛋白質逐漸交聯、聚集、沉淀，變性程度加劇。復合蛋白濁度變化與魚肉無明顯差異（P>0.05），與豬肉顯著不同（P<0.05）。

根據劉茹[16]的報道，鰱魚肉肌球蛋白和肌動蛋白的變性峰分別為44.7 ℃和71.7 ℃，豬肉蛋白質的變性峰分別是59.7 ℃和76.8 ℃，濁度變化率變化點基本出現在蛋白變性溫度附近，在50℃之后，3 種蛋白濁度的變化程度逐漸減小，60～70 ℃后濁度基本趨同，肌原纖維蛋白趨向完全變性。

2.2 溫度對復合肌原纖維蛋白二級結構的影響

天然蛋白質中不同的二級結構在圓二色譜中會表現出不同的特征吸收[17]：α-螺旋在190 nm波長處有1 個正峰，在204 nm和221 nm波長處有2 個負峰；β-折疊在195 nm有正峰，在215～217 nm出現負峰；β-轉角在180～190 nm會出現負峰；無規則卷曲在小于200 nm波長處會出現單負峰，在218 nm附近則有較弱譜帶。

由圖2可知，3 種肌原纖維蛋白在204 nm和221 nm附近均有2 個負峰，對照組2 個負峰非常明顯，說明未加熱的肌原纖維蛋白中含有較多的α-螺旋結構。隨著溫度升高，2 個負峰逐漸變弱，尤其在溫度升高到30～40 ℃時，負峰明顯減弱，表明α-螺旋含量明顯下降。3 種肌原纖維蛋白二級結構含量變化如表1所示。

由表1可知，豬肉肌原纖維蛋白的α-螺旋和無規則卷曲含量隨溫度升高而下降，β-折疊含量則上升，在40 ℃后基本穩定；隨溫度升高，魚肉肌原纖維蛋白的α-螺旋和無規則卷曲含量下降，β-折疊含量上升，但在30 ℃后即達到穩定。這說明豬肉肌原纖維蛋白比魚肉肌原纖維蛋白擁有更高的熱穩定性。劉茹[16]的研究也證實了豬肉蛋白具有更高的變性溫度，因而具有更好的熱穩定性；Wu等[18]和Arai等[19]也曾報道魚肉蛋白的熱穩定性低于哺乳動物蛋白。

復合肌原纖維蛋白初始時的二級結構含量與魚肉肌原纖維蛋白相近。隨著溫度升高，α-螺旋和無規則卷曲含量下降，β-折疊含量上升，在40 ℃后達到穩定，這與豬肉肌原纖維蛋白的變化趨勢無明顯差別（P>0.05），表明復合肌原纖維蛋白能夠結合豬肉和魚肉肌原纖維蛋白的特點，熱穩定性有所改善。同時，復合肌原纖維蛋白穩定后的α-螺旋和無規則卷曲含量要高于單一肌原纖維蛋白，β-折疊含量則較低，這表明豬肉和魚肉肌原纖維蛋白之間可能發生了相互作用，對蛋白質二級結構的含量產生了影響，因而與單一蛋白性質產生差異。Bouraoui等[20]曾報道魚肉和豬肉蛋白能夠發生相互作用形成更多的無規則卷曲結構；蛋白質二級結構的變化也將對蛋白質功能特性產生影響，尤其是β-折疊含量的變化，會對蛋白質表面疏水性產生很大影響[21]。

2.3 溫度對復合肌原纖維蛋白構象的影響

蛋白質中含有的芳香族氨基酸殘基側鏈基團具有吸收紫外入射光而發射熒光的特性，可利用此特點來研究變性過程中蛋白質的空間構象變化。色氨酸摩爾消光系數高，對周圍微環境敏感[22]，是最常用的內源熒光探針。隨著蛋白質的變性，色氨酸側鏈基團逐漸暴露在水溶液中，其所處環境的極性變大，蛋白質熒光發射峰λmax增大，發生紅移[23]。紅移程度越大，變性過程中蛋白質構象變化程度越大。此外，熒光強度會隨著色氨酸從內部疏水區向外暴露而增大，能夠表征蛋白質構象的變化程度[24]。3 種肌原纖維蛋白在不同溫度下的構象變化如圖3所示。

由圖3a可知，豬肉肌原纖維蛋白λmax從332 nm紅移至335 nm，熒光強度先增大后減小至穩定，在40 ℃達到最大，70 ℃后基本穩定。這表明隨著溫度的升高，豬肉肌原纖維蛋白內部色氨酸側鏈基團逐漸暴露，蛋白構象發生改變，蛋白變性程度增加，但在達到一定溫度后，蛋白質會趨向完全變性，構象逐漸趨向較為穩定的變性狀態以適應環境變化[25]。由圖3b可知，魚肉肌原纖維蛋白隨著加熱溫度升高，λmax從333 nm紅移至335 nm，熒光強度先降低后升高，在50 ℃降至最低，100 ℃升至最大，這可能是因為魚肉蛋白色氨酸側鏈基團在加熱過程中會出現短暫的收縮，達到一定溫度后逐漸舒展暴露，直至構象穩定。由圖3c可知，隨著溫度升高，復合肌原纖維蛋白λmax由332 nm紅移至336 nm，熒光強度出現2 次上升和下降，在30 ℃和70 ℃達到最高，最后達到穩定。這表明復合肌原纖維蛋白構象隨溫度變化的規律與豬肉和魚肉蛋白都不同，蛋白質之間可能發生了相互作用，從而在一定程度上改變了色氨酸對環境的敏感程度，影響了蛋白構象的變化。這種蛋白構象變化規律的改變，可能會對蛋白質熱變性過程產生影響，進而在一定程度上改變蛋白質的凝膠特性，改善復合肉制品的品質。

2.4 溫度對復合肌原纖維蛋白表面疏水性的影響

由圖4可知，3 種蛋白的表面疏水性均隨溫度上升而升高，在70～80 ℃后出現下降并趨于平緩，但具體變化過程卻不同。豬肉肌原纖維蛋白表面疏水性從40 ℃開始急劇上升，80 ℃后下降并逐漸穩定；魚肉肌原纖維蛋白表面疏水性全程變化較平緩，在70 ℃后下降至穩定；復合肌原纖維蛋白表面疏水性在40 ℃開始迅速上升，與豬肉蛋白相似，至70 ℃下降并趨于穩定，與魚肉蛋白相似，且最終與魚肉蛋白持平。隨著溫度升高，維持蛋白質空間構象的作用力逐漸減弱，氫鍵、范德華力、二硫鍵等遭到破壞，二級、三級結構發生改變，內部疏水殘基暴露，進而引發蛋白質表面疏水區域分布的改變[26-27]。本實驗中，蛋白質表面疏水性與α-螺旋和β-折疊含量呈負相關，與無規則卷曲含量呈正相關，相關研究也證實蛋白質的表面疏水性與α-螺旋含量呈負相關[28]，與β-折疊含量也有密切關系[21]。但當溫度過高時，蛋白質又會發生聚集和側鏈間的反應，出現沉淀，導致表面疏水性出現下降[29-31]。因此3 種肌原纖維蛋白的表面疏水性都是隨溫度先升高，達到較高溫度后出現降低。相關研究也曾報道不同來源的蛋白因結構存在差異而導致表面疏水性不同[32]，因而復合肌原纖維蛋白能夠結合豬肉和魚肉肌原纖維蛋白表面疏水性的變化特點，但復合肌原纖維蛋白表面疏水性的變化規律與單一豬肉和魚肉蛋白又不完全相同，豬肉和魚肉肌原纖維蛋白復合后蛋白質之間可能發生了相互作用，改變了原有疏水區域的分布，進而表現出不同的變化規律。

3 結 論

隨著溫度的升高，豬肉、鰱魚肉和復合肌原纖維蛋白的濁度都會升高，α-螺旋和無規則卷曲含量降低至穩定，β-折疊含量升高至穩定，蛋白質構象會發生相應變化以適應新環境，表面疏水性均會先升高后在高溫下輕微下降至穩定，蛋白質逐漸趨向完全變性。但復合肌原纖維蛋白結構和表面疏水性隨溫度變化的規律與單一蛋白又不完全相同，不同蛋白之間可能發生了相互作用，影響了蛋白質結構和性質的變化規律。這在結構和機理層面說明，復合肌原纖維蛋白在結合單一蛋白特點的同時，蛋白質間也可能發生相互作用，對蛋白質的凝膠特性產生影響。這將為復合蛋白凝膠、復合肉制品和中低溫肉制品的研究提供理論依據和參考。

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