小鼠脾臟間充質干細胞調節T淋巴細胞的增殖與活化

丁 麗，朱 恒，張海宏，楊 洋，韓冬梅，王志東，鄭曉麗，董 磊， 閆洪敏，劉 靜，朱 玲，薛 梅，郭子寬，王恒湘

(1. 中國人民解放軍空軍總醫院血液科，北京 100142；2. 軍事醫學科學院基礎醫學研究所，北京 100850；3. 中國人民解放軍空軍總醫院普外科，北京 100142； 4. 軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所，北京 100850)

研究報告

小鼠脾臟間充質干細胞調節T淋巴細胞的增殖與活化

丁 麗1，朱 恒2，張海宏3，楊 洋1，韓冬梅1，王志東1，鄭曉麗1，董 磊1， 閆洪敏1，劉 靜1，朱 玲1，薛 梅1，郭子寬4，王恒湘1

(1. 中國人民解放軍空軍總醫院血液科，北京 100142；2. 軍事醫學科學院基礎醫學研究所，北京 100850；3. 中國人民解放軍空軍總醫院普外科，北京 100142； 4. 軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所，北京 100850)

目的 研究小鼠脾臟間充質干細胞(Sp-MSCs)對T淋巴細胞增殖與活化的調節作用。方法 采用組織塊法從小鼠脾臟中分離培養出Sp-MSCs，并做多向誘導分化實驗。分離小鼠T淋巴細胞，開展淋巴細胞轉化試驗和混合淋巴細胞反應，分別檢測Sp-MSCs對于非特異抗原和同種異體抗原活化的T淋巴細胞的影響。以CFSE流式法檢測Sp-MSCs對活化的T淋巴細胞增殖的影響。采用定量PCR分析Sp-MSCs對T淋巴細胞表達的炎性細胞因子的影響。結果 流式檢測結果顯示Sp-MSsC可以抑制非特異抗原和同種異體抗原引起的T淋巴細胞增殖。Sp-MSCs能夠有效抑制淋巴細胞轉化試驗和混合淋巴細胞反應引起的細胞活化。進一步分析發現，Sp-MSCs抑制T淋巴細胞表達干擾素γ，腫瘤壞死因子α和白細胞介素17A。結論 Sp-MSCs能夠抑制T淋巴細胞增殖與活化，抑制T淋巴細胞表達多種炎性細胞因子。

脾臟間充質干細胞；T淋巴細胞；增殖；活化；炎性細胞因子

間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一種最早在骨髓中發現的非造血譜系的干細胞[1,2]，隨后亦在骨、臍帶和脂肪等組織中有發現。MSCs不僅具有干細胞的共性，同時也具有自身的特性。MSCs像大多數干細胞一樣，具有多向分化和自我更新能力。更重要的是，MSCs是目前已知的多種干細胞中，較為確定地具有免疫調節能力的一類干細胞[3]。相關研究表明， MSCs可以調節多種免疫細胞如巨噬細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞、樹突狀細胞和中性粒細胞等發育分化和凋亡，有助于維持機體免疫反應和免疫穩態[3]。此外，MSCs還調節多種免疫細胞的功能，避免過度的機體免疫應答[3]。目前的研究結果表明，MSCs主要通過表達細胞間粘附分子(如細胞間粘附分子1和內皮細胞粘附分子1)、釋放一些重要的細胞因子和活性物質以及釋放膜微粒等形式來發揮免疫調控作用。

脾臟是人和動物體內最大的外周免疫器官[4,5]。脾臟內含有多種免疫細胞如巨噬細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞、樹突狀細胞和中性粒細胞等，是免疫細胞發育和成熟的重要器官之一，更是機體的體液免疫中心和細胞免疫。脾臟內免疫細胞的發育功能要受到脾臟微環境的調控。多種基質細胞混合組成的脾臟基質組織既為免疫細胞發育提供了空間依托，又表達多種活性分子調節免疫細胞功能，是脾臟微環境的重要組成部分[4,5]。因此，脾臟基質組織內細胞對于免疫細胞發育和功能的調控一直是免疫學研究的熱點之一[6,7]。但是，以往的研究多關注于脾臟內皮源性基質細胞和成纖維細胞等成體細胞的作用，對于處于發育源頭的脾臟間充質干細胞(spleen mesenchymal stem cells, Sp-MSCs)是否參與免疫調控，國內外文獻報道不多。基于此，我們依靠前期工作建立的膠原酶消化聯合組織塊培養法(待發表數據)，分離獲得了大量細胞純凈度較高的小鼠Sp-MSCs。在此可靠的細胞模型基礎之上，本研究著重關注了Sp-MSCs對非特異抗原和同種異體抗原活化的T淋巴細胞增殖和活化的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

健康BALB/cl和C57BL/6 小鼠，雌雄不限，6～8周齡，購自維通利華實驗動物技術有限公司(北京)(動物生產許可證號SCXK: 京2012-0001)。

1.2 主要試劑與儀器

干細胞培養專用胎牛血清，磷酸鹽緩沖液(PBS)，高糖DMEM培養基以及α-MEM 培養基均為美國Gibco公司產品；II型膠原酶，胰酶，磷酸化維生素C，β-磷酸甘油，地塞米松，3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)，胰島素，堿性磷酸酶試劑盒，油紅O 染液，熒光染料CFSE，刀豆蛋白A(Con A)，定量PCR試劑盒為美國Sigma 公司產品；RNA提取和逆轉錄試劑購自大連寶生物公司；尼龍毛，細胞培養板和培養瓶為美國康寧公司產品；流式細胞儀為美國Becton Dickinson 公司產品；細胞培養箱為英國 Thermo 公司產品；倒置顯微鏡為日本Olympus 公司產品。

1.3 Sp-MSCs的分離培養

無菌條件下以注射器柄將脾臟碾碎，以0.1%的II型膠原酶液消化獲得的基質組織1 h，將消化后的基質組織種入Sp-MSCs培養體系內(含有10%血清的α-MEM)，3 d首次換液。待Sp-MSCs 爬滿培養瓶后，以胰酶消化傳代，取第3～6 代細胞用于相關實驗。

1.4 Sp-MSCs的分化能力鑒定

參照以往建立的方法進行[8]。取第4 代Sp-MSCs，種于24孔培養板中(5× 104/cm2)，加入成骨誘導體系：含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養基，地塞米松( 10-7mol /L)，β 磷酸甘油( 10 mmol /L)和維生素C 磷酸鹽( 50 μmol /L)。誘導7 d進行堿性磷酸酶染色。取第4 代Sp-MSCs，種于24孔培養板中(3× 104/cm2)，加入成脂肪誘導體系：含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養基，IBMX ( 0.5 μmol /L)，地塞米松( 10- 6mol /L)和胰島素( 10 ng/mL)。誘導7 d后進行油紅染色。

1.5 小鼠T淋巴細胞分離

參照以往發表的方法進行[9]。無菌條件下以注射器柄碾磨鼠脾臟，將獲得的粗制細胞懸液過200目鋼篩去除團塊，再以Ficoll分離液以800 g離心20 min，從而得到混合的脾臟免疫細胞；以PBS洗凈，將脾臟免疫細胞過填充有尼龍毛的50 mL注射器，收獲的不貼附的細胞即為T淋巴細胞，流式檢測CD3細胞比例高于于80%后用于下一步實驗。

1.6 CSFE法標記T淋巴細胞

用于流式分析的T淋巴細胞需要用熒光染料CFSE標記。簡言之，小鼠T淋巴細胞以含有2%胎牛血清的PBS調整為1× 107mL，加入CFSE (10 μM)，避光染色20分鐘，以大量含有血清的PBS重懸，洗滌，終止染色。 標記過的T淋巴細胞用于后繼實驗。1.7 淋巴細胞轉化實驗(lymphocyte transformation test，LTT)和混合淋巴細胞反應(mixed lymphocyte reaction，MLR)

進行流式分析的T淋巴細胞需預先進行CFSE標記。LTT參照以往的方法開展[2]。T淋巴細胞的密度調整為1 × 106ml，加入Con A (2 μg/mL)，不同的實驗組添加或者不添加Sp-MSCs共培養，48 h后拍照。收集懸浮的T淋巴細胞上流式分析。MLR則是把小鼠T淋巴細胞加入照射過的同種異基因的小鼠T淋巴細胞混合培養(如BALB/cl小鼠和C57BL/6小鼠的T淋巴細胞)，比例為10:1。不同的實驗組加入或者不加入Sp-MSCs共培養，48 h后拍照，收集懸浮的T淋巴細胞上流式分析。

1.8 T淋巴細胞表達的免疫因子檢測

進行定量PCR分析的T淋巴細胞無需進行CFSE標記。簡言之，收集LTT和MLT實驗中的各組T淋巴細胞，以PBS洗滌，以氯仿法提取RNA，逆轉錄后用做定量PCR的模板。引物序列為：小鼠干擾素γ(IFN-γ)：上游序列- 5′-CTCATGGCTGT TTCTGGCTGTTA-3′，下游序列5′-GACGCTTATGTT GTTGCTGATGG-3′；小鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)： 上游序列5′-CACTTGGTGGTTTGCTACGA-3，下游序列5′-GCCTCCCTCTCATCAGTTCTA-3′；小鼠白細胞介素17A(IL-17A)：上游序列5′-TCCAGAAGGCCC TCAGACTA-3′，下游序列5′- AGCATCTTCTCGACC CTGAA-3′, 內參GADPH上游序列5′-AAACCCATC ACCATCTTCCA-3′，下游序列5′-GTGGTTCACACC CATCACAA-3′。

1.9 統計學方法

實驗結果以SPSS 16.0軟件分析，數據以均值方差表示，以Studentttest 分析，P值小于0.05為統計學意義，P< 0.05 ,P< 0.01。

2 結果

2.1 小鼠Sp-MSCs 抑制T淋巴細胞增殖

如圖1A和1B所示，組織塊法分離獲得的小鼠Sp-MSCs具有經典的MSCs成纖維狀細胞的形態特點，成骨誘導分化后磷酸酶染色陽性，提示其具有成骨分化能力(圖1C)，成脂肪誘導后油紅O染色后可見脂肪滴被染料染為紅色(圖1D)。以上結果表明本研究所用的干細胞的確為MSCs。

CFSE是一種可以摻入細胞的熒光染料，隨著細胞增殖分裂，細胞所攜帶的熒光強度逐漸降低[2]。細胞增殖的速度越快，其熒光強度衰減地越快[2]。在LTT中，T淋巴細胞受到Con A刺激之后，增殖迅速，熒光強度衰減明顯，而Sp-MSCs存在時，T淋巴細胞衰減的速度明顯減慢，表明T淋巴細胞增殖受到了抑制(圖2A)。在MLR中，同種異基因抗原也促使T淋巴細胞顯著增殖。與LTT結果相似，Sp-MSCs表現出了抑制T淋巴細胞增殖能力(圖2B)。

A為原代Sp-MSCs，B為快速增殖的Sp-MSCs， C為Sp-MSCs成骨分化后堿性磷酸酶染色陽性，D為Sp-MSCs成脂肪分化后油紅O染色陽性(標尺=200 μm)圖1 Sp-MSCs及其成骨和成脂肪分化(A) primary Sp-MSCs; (B) Highly proliferating Sp-MSCs; (C) ALP-staining for osteogenically differentiated Sp-MSCs; (D)Oil-red-O staining for adipogenically differentiated Sp-MSCs (Bar=200 μm)Fig.1 Primary culture and the osteogenic and adipogenic differentiation of Sp-MSCs

2.2 小鼠Sp-MSCs 抑制非特異性抗原誘導的T淋巴細胞活化

Con A是一種非特異抗原，具有強大的活化T淋巴細胞能力[9]。如圖3A所示，Con A刺激后， T淋巴細胞顯著活化，聚集成巨大的細胞團塊，而有Sp-MSCs存在時，這種活化作用受到顯著抑制，大多數T淋巴細胞為松散的單個細胞或者小細胞團(圖3B)，以上結果表明小鼠Sp-MSC 可抑制非特異性抗原誘導的T淋巴細胞活化。

2.3 小鼠Sp-MSCs 抑制同種異基因抗原誘導的T淋巴細胞活化

除了非特異性抗原之外，同種異基因抗原同樣可以活化T淋巴細胞。如圖4A所示，同種異基因的T淋巴細胞混合在一起之后，T淋巴細胞顯著活化，培養皿中可見多個巨大的細胞團塊，而 Sp-MSCs則可以顯著抑制這種活化作用。培養皿中的T淋巴細胞無法聚合為大細胞團塊，更多地變現為為松散小細胞團(圖4B)。此結果表明小鼠Sp-MSCs 可抑制同種異基因抗原誘導的T淋巴細胞活化。

A為Con A刺激引發T淋巴細胞活化，B為Sp-MSCs抑制CoA誘導的T淋巴細胞活化(標尺=200μm)圖3 Sp-MSCs抑制非特異抗原誘導的T淋巴細胞活化(A) Con A-induced T lymphocyte activation; (B) Sp-MSCs suppressed Con A-induced T lymphocyte activation. Bar=200 μm.Fig.3 Sp-MSCs suppressed non-specific antigen-induced T lymphocyte activation

A為Sp-MSCs抑制LTT實驗，B為Sp-MSCs抑制MLR反應。黑色峰代表的是未增殖的T淋巴細胞，藍色峰代表的是加入了Con A或者異基因抗原的刺激后，顯著增殖的T淋巴細胞，紅色峰代表的是Sp-MSCs抑制相應的T淋巴細胞增殖。圖2 Sp-MSCs抑制T淋巴細胞增殖(A) Sp-MSCs suppressing LTT. (B) Sp-MSCs suppressing MLR. The black empty flags represent low proliferative T lymphocytes. The blue empty flags represent high proliferative T lymphocytes, and the red empty flags indicate that the proliferation of T lymphocytes, suppressed by Sp-MSCs, respectively.Fig.2 Sp-MSCs suppressed the proliferation of T lymphocytes

A為同種異基因的抗原刺激引發T淋巴細胞活化，B為Sp-MSCs抑制同種異基因抗原誘導的T淋巴細胞活化(標尺=200μm)。圖4 Sp-MSCs抑制同種異基因抗原誘導的T淋巴細胞活化(A) Allogeneic antigen-induced T lymphocyte activation; (B) Sp-MSCs suppressed allogeneic antigen-induced T lymphocyte activation. Bar=200 μm.Fig.4 Sp-MSCs suppressed allogeneic antigen-induced T lymphocyte activation

2.4 小鼠Sp-MSCs抑制T淋巴細胞表達炎性細胞因子

為進一步觀察Sp-MSCs對T淋巴細胞的免疫功能影響，我們用定量PCR檢測了各組T淋巴細胞表達的炎性細胞因子的水平。如圖5和圖6所示，加入Sp-MSCs上可顯著抑制LTT和MLR實驗中T淋巴細胞內IFN-γ和TNF-α的表達。有意義的是，與LTT相比，Sp-MSCs抑制MLR中IL-17A的作用更強(圖5和圖6)(*P<0.05 ,**P<0.01.)。該結果提示，Sp-MSCs對于不同抗原活化的T細胞調節能力可能存在差異。

圖5 Sp-MSCs抑制非特異抗原活化的T淋巴 細胞表達炎性細胞因子Fig.5 Sp-MSCs suppressed the expression of non-specific antigen-induced proinflammatory cytokines.

3 討論

Friedenstein等[1]研究骨髓造血時，意外地發現骨髓中除了造血干細胞之外還存在有另外一類非造血干細胞，隨后這種類似成纖維細胞樣的干細胞被命名為MSCs[3]。后繼的研究表明，MSCs并不僅存在骨髓中，骨、脂肪、臍帶等多種組織也存在著MSCs。近年來，MSCs被發現可以調控多種免疫細胞的發育和功能。

基于此，MSC已經被應用于治療移植物抗宿主病、類風濕性關節炎和系統性紅斑狼瘡等疾病，并取得了滿意的效果[3]。

圖6 Sp-MSCs抑制同種異基因抗原活化的T淋巴細胞表達炎性細胞因子Fig.6 Sp-MSCs suppressed the expression of allogeneic antigen-induced proinflammatory cytokines.

Sp-MSCs是脾臟微環境的重要組成部分，其在空間結構上與多種免疫細胞緊密相鄰，但是目前有關其免疫調節能力的報道卻不多。T淋巴細胞是免疫細胞的重要組成部分，既參與細胞免疫，又連接體液免疫，其發育和功能的改變對于維持機體免疫功能極為重要[10]。本研究基于前期建立的可靠細胞模型開展了Sp-MSCs調節T淋巴細胞相關研究。我們發現，Sp-MSCs可以顯著抑制T淋巴細胞的增殖和活化。這種抑制作用具有廣譜性，即Sp-MSCs不僅抑制非特異抗原引起的T淋巴細胞增殖與活化，而且抑制同種異基因引起的T淋巴細胞增殖與活化。 但是，我們同時注意到，Sp-MSCs對于不同抗原活化后的T淋巴細胞分泌功能具有差異性調節作用。一般認為，IFN-γ和TNF-α多由Th1調節亞群的T淋巴細胞分泌。IL-17A是IL-17家族的重要一員，多有Th17調節亞群分泌，與慢性aGVHD和類風濕性關節炎等自身免疫性疾病密切相關。本研究中， Sp-MSCs對于非特異抗原和同種異基因抗原誘導的IFN-γ和TNF-α表達均具有強大的抑制作用，提示其抑制Th1調節亞群的活化和功能。有趣的是，Sp-MSCs對于同種異基因抗原誘導的IL-17A表達具有良好的抑制作用，而對于非特異抗原誘導的IL-17A表達雖然具有抑制作用，但是沒有統計學差異，提示其調節相應T淋巴細胞中T h17 亞群的能力較弱。其內在的機制不明，仍有待于進一步的研究[11]。此外，本研究主要基于體外實驗開展，相關發現亦需在體內和不同的動物模型水平進一步驗證。

通過本研究，我們發現了小鼠Sp-MSCs能夠抑制T淋巴細胞增殖與活化，抑制T淋巴細胞表達多種炎性細胞因子，并且這種調節能力存在差異性。

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Modulatory effects of mouse spleen-derived mesenchymal stem cells on the proliferation and activation of T lymphocytes

DING Li1, ZHU Heng2, ZHANG Hai-hong3, YANG Yang1, HAN Dong-mei1, WANG Zhi-dong1, ZHENG Xiao-li1, DONG Lei1, YAN Hong-min1, LIU Jing1, ZHU Ling1, XUE Mei1, GUO Zi-kuan4, WANG Heng-xiang1

(1. Department of Hematology, Air Force General Hospital of Chinese PLA, Beijing 100142, China; 2. Institute of BasicMedical Sciences, Beijing 100850; 3. Department of General Surgery, Air Force General Hospital of Chinese PLA, Beijing 100142; 4. Institute of Radiation Medicine, Beijing 100850)

Objective To investigate the modulatory effects of mouse spleen-derived mesenchymal stem cells (Sp-MSCs) on the proliferation and activation of T lymphocytes. Methods The mouse Sp-MSCs were isolated from mouse spleens by using explant tissue culture protocol and the cells were induced to differentiate into osteoblasts and adipocytes. The effects of Sp-MSCs on proliferation of activated T lymphocytes were determined by carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) staining assay. Furthermore, the effects of Sp-MSCs on lymphocyte transformation test (LTT) and mixed lymphocytes reaction (MLR) were observed, respectively. In addition, the mRNA expression of T cell derived proinflammatory cytokines by Sp-MSCs was detected by quantitative PCR. Results The results of CFSE assay demonstrated that Sp-MSCs suppressed ConA and allogeneic lymphocyte-induced T cell proliferation. Moreover, the Sp-MSCs were capable of suppressing LLT and MLR. Additionally, the results of quantitative PCR revealed that Sp-MSCs significantly suppressed the T cells expressing interferon-γ, tumor necrosis factor-α and interleukine-17A. Conclusions Sp-MSCs are capable of suppressing the proliferation and activation of T lymphocytes as well as the expression of T cell-derived proinflammatory cytokines.

Spleen-derived mesenchymal stem cells; T lymphocytes; Proliferation, Activation; Proinflammatory cytokines; Mouse

國家自然科學基金項目(81500083, 81371945, 81572159, 81101342)；空軍總醫院院級課題( KZ2014023)；北京市自然科學基金項目(7132133)。

丁麗 (1975-)，女，博士，研究方向：干細胞與血液病學。E-mail: dingli7578@163.com。

王恒湘，碩士，主任醫師，從事血液系統疾病的研究與治療，E-mail: wanghengxiang123@aliyun.com；郭子寬，博士，研究員，主要從事轉化醫學研究E-mail: guozk@bmi.ac.cn；朱恒，博士，副研究員，主要從事干細胞與再生醫學研究，E-mail: zhudingdingabc@163.com。

R-33

A

1671-7856(2017) 02-0015-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.02.003

2016-06-30