人羊膜間充質干細胞移植后慢性酒精性肝損傷大鼠血生化指標含量的變化

韓海燕，宋文廣，劉 錦，崔云濤，薛占國

(1.武警后勤學院附屬醫院檢驗科，天津 300162；2.武警后勤學院附屬醫院生殖醫學研究中心，天津 300162； 3.大同市第五人民醫院重癥醫學科，山西 037000)

研究報告

人羊膜間充質干細胞移植后慢性酒精性肝損傷大鼠血生化指標含量的變化

韓海燕1，宋文廣2，劉 錦1，崔云濤1，薛占國3

(1.武警后勤學院附屬醫院檢驗科，天津 300162；2.武警后勤學院附屬醫院生殖醫學研究中心，天津 300162； 3.大同市第五人民醫院重癥醫學科，山西 037000)

目的 有研究表明人羊膜間充質干細胞(human amniotic mesenchymal stem cells，hAMSCs)具有多種分化和增殖功能，其可以誘導分化成肝樣細胞，從而對肝損傷有一定的修復作用。方法 體外復蘇培養人羊膜間充質干細胞，66只健康雌性 Wistar 大鼠，隨機取22只，不做任何處理為正常對照組，余44只采用白酒灌胃30 d的方式建立大鼠慢性酒精性肝損傷模型，建模后將其隨機分為模型組(尾靜脈注射1 mL PBS)，hAMSCs組(經尾靜脈注入1 mL hAMSCs(2×106個)，每組各22只。于移植后4周，采用全自動生化分析儀分別檢測各組大鼠血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、血清總膽紅素(TBIL)、血清白蛋白(ALB)、血清總蛋白(Tp)；同時檢測檢測各組大鼠肝臟超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH- PX)、過氧化氫酶(CAT)、以及丙二醛(MDA)、IL- 4含量變化；免疫熒光顯微鏡觀察PKH-26 標記的 hAMSCs分布情況，TUNEL法檢測各組肝細胞凋亡情況。結果 各組大鼠血生化檢測結果顯示，與正常對照組比較，模型組中ALT、AST、TBIL、Tp含量均顯著升高，而與模型組比較，hAMSCs移植組中ALT、AST、TBIL、Tp含量均顯著下降(P<0.05)，與正常對照組比較，模型組中ALB含量明顯下降，而與模型組比較，hAMSCs移植組中ALB含量明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，hAMSCs移植組SOD、GSH- PX、CAT含量均顯著增高，MDA、IL- 4 含量均顯著下降，與正常對照組比較，hAMSCs移植組SOD、GSH- PX、CAT含量均降低，MDA、IL- 4含量均升高(P<0.05)；移植組可見移植的PKH-26 標記陽性的hAMSCs細胞分布于肝臟組織內，其余各組未見此類細胞分布(P<0.05)；TUNEL法檢測各組肝細胞凋亡可見凋亡細胞數，模型組最多(34.27±5.71)，hAMSCs移植組次之(18.42±3.95)，正常對照組未見凋亡細胞。結論 人羊膜間充質干細胞移植能夠改善大鼠肝硬化的血生化指標水平，hAMSCs移植后可以減輕慢性酒精性肝損傷大鼠的肝臟細胞凋亡。

人羊膜間充質干細胞；大鼠；移植；修復作用；酒精性肝損傷；

酒精性肝損傷是一系列肝功能損害的總稱，主要因長期大量飲酒引起，按照發病的不同階段可分為肝脂肪變性→肝炎→肝纖維化，隨著病情的逐漸加重最終發展成為肝硬化[1，2]，其最主要的致病因素是長期過量飲酒，但同時還受包括環境因素、遺傳因素在內的其他因素的影響[3]。慢性酒精性肝損傷是指肝功能損害病程需超過6個月，調查研究發現在2010年全球共有493 300 人死于酒精引起的肝硬化[4]，人們精神及心理壓力隨著社會的發展逐漸增加，酒品的銷量也相應增加，也因此慢性酒精性肝損傷的發病率逐年增高，成為影響人類健康的又一因素。戒酒為酒精性肝損傷進一步發展的最為主要的治療方式，對于已經造成嚴重肝功能損害的患者，目前尚無有效的藥物治療，臨床中多以支持治療進行調節，但臨床效果一般[5]

干細胞可以在特定條件下分化成為不同的組織[6-10]，因此被廣泛地用于各種疾病治療的研究中，大量研究將干細胞移植運用于各種疾病的治療中，試圖依靠干細胞移植來解決先前存在的治療方法無法解決的問題，并且已經取得了令人囑目的進展[11-14]，包括肝臟疾病的治療[15-17]。在干細胞移植相關研究中不斷地發現問題解決問題，使得相關研究逐漸深入，人羊膜間充質干細胞(human amniotic mesenchymal stem cells，hAMSCs)也逐漸走進我們的研究視野，hAMSCs不僅來源廣泛，而且具有較強的分化能力及強大的增殖能力，這些特點使得hAMSCs成為繼骨髓干細胞之后干細胞研究領域中的又一熱點[18-20]。本文旨在利用hAMSCs的多種分化和增殖功能，觀察其對肝損傷的修復作用。

1 材料和方法

1.1 主要材料及來源

PKH-26 體外標記試劑盒(產品編號 MINI26)(Sigma-Aldrich公司)、Konelab PRIME 30 型全自動生化分析儀(美國 Thermo 公司)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)試劑盒(批號:20120626)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)試劑盒(批號：20120625)、白蛋白(Alb)試劑盒(批號:20120607)、總蛋白(TP)試劑盒(批號:20120410)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(批號:20120628)、丙二醛( MDA)試劑盒(批號:20120514)、微量還原型谷肌甘膚(GSH)試劑盒(批號:20120621)均購自北京百奧萊博科技有限公司、freedom evolyzer 全自動酶免工作站(瑞士TECAN公司)、TUNEL 細胞凋亡原位檢測試劑盒(北京中昊生物，批號 1103110)。

1.2 方法

1.2.1 建立大鼠模型及實驗分組:將66只健康的Wistar 大鼠進行隨機分組，分別為正常對照組，模型組，hAMSCs組，共3組，每組22只，分組后對各組動物進行不同處理，其中正常對照組不做任何處理，模型組各只大鼠經過43%白酒按照10 mL/kg·d劑量灌胃處理30 d，30 d后經尾靜脈為各只大鼠注射PBS，劑量為1 mL，頻率為每天1次，共注射4周；hAMSCs組的各只大鼠采用與模型組相同的方式、使用相同的白酒灌胃處理30 d，30 d后經尾靜脈分別為各只大鼠注射1 mL hAMSCs，約2×106個hAMSCs細胞，頻率為每天1次，共注射4周。實驗動物生產許可證號：SCXK(津)2013-0021，實驗動物使用許可證號：SYXK(津)2013-0001。

1.2.2 體外復蘇培養人羊膜間充質干細胞: 從冰箱中取出儲存在凍存管中凍存的hAMSCs(在天津醫科大學總醫院，經醫院倫理委員會批準，批準(號:201458)并經家屬同意，取產后棄置的完整胎盤組織，將羊膜層與絨毛膜層鈍性分離，用含有雙抗的平衡液反復沖洗，盡可能去除血污，用酶消化法從羊膜中分離和培養 hAMSCs，然后凍存備用。)將凍存管放置在37℃的水箱中進行水浴，使hAMSCs進行快速解凍并復蘇，經過1 min解凍處理，hAMSCs已徹底解凍，1 min后將凍存管取出，將凍存管中的hAMSCs倒入培養瓶再取適量α-MEM培養基加入其中，將培養瓶放置在培養箱中培養，觀察細胞生長情況，將培養箱的條件設置為37℃，含有5% CO2。

1.2.3 檢測各組大鼠ALT、 AST、TBIL、ALB、Tp含量變化:于移植后4周后，分別從各只大鼠眼眶靜脈取血，各組中不同大鼠采用相同的方法采血，采血量相同，把收集到的血液樣本靜置30 min，調整離心機為3 000 r/min狀態，將收集的血液標本進行離心處理，10 min后取出離心管用膠頭滴管取血清置于-20℃冰箱進行保存。使用全自動生化分析儀測定ALT、 AST、TBIL、ALB、Tp。具體操作按照相關說明書進行。

1.2.4 檢測各組大鼠SOD、GSH- PX、CAT、MDA、IL- 4含量變化:于移植后4周后，分別將各組大鼠腹腔注射法麻醉后進行固定，用注射器針頭進行心臟穿刺處死大鼠，取出肝臟并從中剪取部分進行反復沖洗后進行保存備用。檢測時從液氮中取出肝臟迅速解凍，剪取肝臟同一部位肝組織200 mg，加入適量PBS液 (pH 7.4)，勻漿后定容至2 mL，離心收取上清液，采用全自動酶免工作站檢測SOD、GSH- PX、CAT、MDA、IL- 4含量的變化。

1.2.5 免疫熒光顯微鏡觀察PKH-26 標記的 hAMSCs分布情況:用熒光染料PKH-26對hAMSCs進行標記，所有操作均嚴格按照相關說明書進行，具體操作步驟如下：取少量事先準備好的于培養瓶中進行貼壁生長達90%以上的細胞，加入胰酶消化細胞形成單細胞懸液，收集2×107細胞于離心管，向其中加1 mL稀釋液C制備成細胞懸液保證細胞完全散離，染色前準備4×10-6mol/L的PKH-26染液，用稀釋液C稀釋后置于離心管，盡快加1 mL 2×細胞到1 mL 2×染料，立即用吸管均勻快速混合樣品，為保證液體充分混合需過一段時間將離心管來回倒置數次，此過程孵育時長約為2 min。加入等量FBS中止染色反應，孵育1 min。400 r/min離心10 min，去上清液。用DMEM洗3次，然后調整細胞濃度至所需濃度。收集PKH-26標記后的hAMSCs注射入hAMSCs移植組及聯合組大鼠體內，24 h后處死大鼠, 顯微鏡下觀察PKH-26 標記的 hAMSCs分布情況。

1.2.6 TUNEL法檢測各組肝細胞凋亡情況：于移植后4周，分別將各組大鼠腹腔注射法麻醉后，將大鼠進行固定，然后用注射器針頭進行心臟穿刺將大鼠處死后，打開腹腔取出肝臟組織，經過石蠟包埋后進行切片處理，切片厚薄一致，約6 μm，將制備好的切片浸入1×PBS 3次；滴加100 μL proteinase K工作液。制陽性片，具體操作步驟如下，滴加100 μL DNase I反應液→浸入1×PBS三次(注：樣本片和陰性片不加DNase I反應液)→加50 μL TdT酶，漂洗→標記、顯色→透明、封片→觀察。在高倍鏡下隨機選擇3個視野進行觀察并計算出細胞的凋亡情況，具體方法為計數200個細胞中陽性細胞數作為凋亡指數。

2 結果

2.1 人羊膜間充質干細胞形態觀察

取凍存的h AMSCs進行復蘇后接種于培養瓶中進行培養，接種濃度為1×105個/mL，24 h后培養瓶中可見少量細胞貼壁(圖1A)，隨著時間的延長貼壁細胞數逐漸增多，48 h后差不多全部細胞均已貼壁，且貼壁較為牢固晃動培養瓶時不易脫離(圖1B)，顯微鏡下觀察細胞形態時可見大部分細胞具有較為一致的形態，多呈梭形，呈旋窩狀生長。

2.2 各組大鼠ALT、 AST、TBIL、ALB、Tp檢測結果

采用全自動生化分析儀對各組大鼠血液中ALT、 AST、TBIL、ALB、Tp含量進行測定，將各組結果進行比較，結果顯示，模型組與正常對照組相比，模型組中ALT、AST、TBIL、Tp含量均顯著升高，而ALB含量則明顯下降，而與模型組比較，hAMSCs移植組中ALT、AST、TBIL、Tp含量均顯著下降，而ALB含量明顯升高，差異有顯著性意義。如表1。

2.3 各組大鼠肝臟SOD、GSH- PX、CAT、MDA、IL- 4檢測結果

采用全自動酶免工作站檢測各組中SOD、GSH- PX、CAT、MDA、IL- 4含量的變化，結果顯示：將hAMSCs移植組與模型組相比，SOD、GSH- PX、CAT含量在hAMSCs移植組中顯著增高，而相反MDA、IL- 4 含量則比模型組顯著下降，與正常對照組比較，SOD、GSH- PX、CAT含量在hAMSCs移植組均降低，相反MDA、IL- 4含量均升高( P<0.05)，見表2。

2.4 PKH-26 標記的 hAMSCs分布情況

以PKH-26 標記的 hAMSCs后將各組肝組織置于顯微鏡下進行觀察，觀察陽性細胞的分布情況，被標記成功的細胞顯微鏡下呈紅色熒光，將各組觀察結果進行比較時發現在hAMSCs移植組肝臟組織中絕大部分的 hAMSCs均有紅色熒光，這說明該方法具有較好的標記敏感性，標記率高，而其余各組未見相似細胞出現(P<0.05)，如圖2所示。

2.5 細胞凋亡情況

如圖3TUNEL 結果顯示：正常細胞核不著色，當細胞凋亡后，細胞核呈棕黃色，形態也發生相應的改變，變得小而圓。將三組結果對比，模型組凋亡率升高，凋亡細胞數是3組中最多的為(34.27±5.71)，hAMSCs移植組次之，凋亡細胞數為(18.42±3.95)，在正常對照組(0.00±0.00)則沒有發現凋亡的細胞。

表1 各組大鼠血液中ALT、AST、TBIL、ALB、Tp含量變化比較

注：P<0.05。 Note.P<0.05.

表2 各組大鼠肝臟組織中SOD、GSH- PX、CAT、MDA、IL- 4含量變化比較

注：P<0.05。Note.P<0.05.

圖1A : 24 h后h AMSCs；圖1B：48h后h AMSC圖1 hAMSCs的形態觀察(標尺=100 μm)Fig.1A:hAMSCs at 24 h；Fig.1B:hAMSCs at 48 hFig.1 Morphological observation of the hAMSCs(Bar=100 μm)

3 討論

隨著社會的發展，人民的精神壓力、心理壓力也逐漸增加，酒精的銷量逐年增加，為人類的健康造成了嚴重的威脅[21-25]。飲酒后酒精主要在肝臟進行代謝，在肝臟內先后轉化成為乙醛、乙酸，最終以二氧化碳及水的形式排除體外[26-27]，當大量長期飲酒后，酒精的中間代謝產物在肝內大量蓄積，對肝臟造成慢性損傷，此外乙醛還能使肝細胞發生脂質過氧化反應破壞肝細胞結構以及誘導自身免疫反應，使肝細胞發生變性壞死[28]。

隨著干細胞的相關研究越來越多，使其成為多個領域中的研究熱點當然也包括肝損傷在內。大量研究顯示干細胞可以在特定條件下分化成各種組織器官，這為多種疾病尋找新的治療方案提供了新的思路。hAMSCs作為干細胞的另一個來源因其取材方便，來源廣泛受到廣泛關注，研究證實hAMSCs在體外可以穩定增殖傳代，同樣具有干細胞的特性，即具有高度分化的潛能。本實驗即利用hAMSCs的本特點將其用于慢性酒精性肝損傷的治療，觀察其對肝損傷的修復作用。

本研究在建立慢性酒精性肝損傷模型后，為 hAMSCs組的各只大鼠經尾靜脈注入 hAMSCs進行治療，通過測定血生化判斷 hAMSCs對肝損傷的修復作用。本研究主要從血生化及肝細胞凋亡情況來判斷這種作用。首先在將各組血生化值進行相應比較時發現，將模型組與正常對照組的各項血生化值對比時，ALT、AST、TBIL、Tp含量在模型組中顯著高于正常對照組，而ALB含量則相反是明顯低于正常對照組的；其次比較hAMSCs移植組與模型組兩組結果，ALT、AST、TBIL、Tp含量及MDA、IL- 4 含量在hAMSCs移植組中較模型組顯著下降，而ALB及SOD、GSH- PX、CAT含量升高較為顯著，以上比較差異均有顯著性意義；hAMSCs移植組與正常對照組比較，hAMSCs移植組SOD、GSH- PX、CAT含量均降低，MDA、IL- 4含量均升高(P<0.05)；此外研究還發現用PKH-26 標記的hAMSCs陽性細胞，在hAMSCs移植組可見移植細胞分布于肝臟組織，其余各組未見(P<0.05)；而當采用TUNEL法檢測各組肝細胞凋亡時可見其在模型組中是最多，正常對照組則沒有發現凋亡細胞，hAMSCs移植組的細胞凋亡數介于二者之間。

綜上所述：hAMSCs移植能夠改善大鼠肝硬化的血生化指標水平，且可以減輕慢性酒精性肝損傷大鼠的肝臟細胞凋亡。本實驗為大鼠大鼠肝硬化的實驗研究提供了理論依據。

圖2A：正常對照組；圖2B：模型組；圖2C：hAMSCs移植組圖2 各組PKH-26 標記的 hAMSCs分布(標尺=100 μm)Note.A：Normal control group；B:Model group；C:hAMSCs groupFig.2 Distribution of PKH-26-labelled hAMSCs in each ±s)(Bar=100 μm)

圖3A：正常對照組；圖3B：模型組；圖3C：hAMSCs移植組圖3 各組大鼠細胞凋亡變化(標尺=100 μm)Note.A:Normal control group；B:Model group；C:hAMSCs groupFig.

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Changes of blood biochemical indexes in the rats with chronic alcoholic liver injury after transplantation of human amniotic mesenchymal stem cells

HAN Hai-yan1,SONG Wen-gGuang2, LIU Jin1, CUI Yun-tao1, XUE Zhan-guo3

(1. Department of laboratory medicine, The Affiliated Hospital of the Armed Police Ligistics College,Tianjin 300162, China;2.Research Center of Reproductive Medicine, the Affiliated Hospital of the Armed Police Logistics College, Tianjin 300162;3.Department of Care, Datong Fifth People’s Hospital, Shanxi 037000 )

Objective Studies have suggested that human amniotic mesenchymal stem cells (hAMSCs) have multiple differentiation and proliferation functions, and can be induced to differentiate into hepatocyte-like cells to repair the liver injury.Methods Human amniotic mesenchymal stem cell swere prepared by resuscitation of frozen cells. Sixty-six healthy female Wistar rats were divided randomly into normal control group (n=22) without any treatment,and rat models of chronic alcoholic liver injury(n=44) treated by gastric gavage of alcohol for consecutive 30 days. After modeling,22 of those 44 rats were randomly divided into model group (tail vein injection of 1 mL PBS), ad another 22 rats as hAMSCs group which received tail vein injection of 1 mL (2 ×106) hAMSCs.Four weeks after the transplantation, the rat serum alanine aminotransferase (ALT),aspartate aminotransferase(AST), total bilirubin (TBIL), albumin (ALB), total protein (TP)were detected by a full automatic biochemical analyzer, and the catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase(GSH PX), malondialdehyde (MDA) and IL-4 content in the liver tissue were detected,the distribution of PKH-26 labeled hAMSCs was observed by immunofluorescence microscopy, and TUNEL staining was used to detect apoptosis in liver cells.Results The rat blood biochemical test showed that compared with normal control group, the serum content of ALT, AST, Tp and TBIL in the model group was significantly higher,compared with those of the model group; the serum contents of ALT, AST, TBIL and Tp in the hAMSCs transplantation group were significantly decreased(P<0.05), compared with hose of the normal control group. The content of ALB in the model group was significantly decreased, and the content of ALB in hAMSCs transplantation group was significantly higher (P<0.05)compared with those of the model group. The contents of SOD GSH- PX and CAT in the liver tissues were significantly increased in the hAMSCs transplantation group. The contents of MDA and IL-4 were decreased significantly, compared with those of the normal control group. The contents of SOD GSH- PX, CAT in the liver tissues were decreased in the hAMSCs transplantation group, and the content of MDA and IL-4 in the liver tissues were significantly increased(P<0.05). PKH-26-labeled positive hAMSCs cells were observed to be distributed in the liver tissue of the hAMSCs transplantation group but not in the liver tissue of other groups (P<0.05).TUNEL assay detected apoptotic cells in the liver of all model groups, with the highest number in the model group (34.27±571) and less in the hAMSCs transplantation group (18.42±3.95), but not found in the normal control group.Conclusions Human amniotic mesenchymal stem cell transplantation can improve the blood biochemical indexes of rats with cirrhosis, and hAMSCs can reduce the apoptosis in liver cells in rats with chronic alcoholic liver injury.

Human amniotic mesenchymal stem cells; Rat; Transplantation; Repair; Alcoholic liver injury

韓海燕(1983-)，女；宋文廣(1982-)，男。研究方向：醫學檢驗。E-mail: hanhaiyangyh@126.com。

薛占國(1983-)，男，研究方向：重癥醫學。E-mail: weiyanxiahn@163.com。

R-33

A

1671-7856(2017) 02-0049-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.02.009

2016-09-09