人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞移植后慢性酒精性肝損傷大鼠血生化指標(biāo)含量的變化

韓海燕，宋文廣，劉 錦，崔云濤，薛占國(guó)

(1.武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，天津 300162；2.武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)研究中心，天津 300162； 3.大同市第五人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，山西 037000)

研究報(bào)告

人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞移植后慢性酒精性肝損傷大鼠血生化指標(biāo)含量的變化

韓海燕1，宋文廣2，劉 錦1，崔云濤1，薛占國(guó)3

(1.武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，天津 300162；2.武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)研究中心，天津 300162； 3.大同市第五人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，山西 037000)

目的 有研究表明人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(human amniotic mesenchymal stem cells，hAMSCs)具有多種分化和增殖功能，其可以誘導(dǎo)分化成肝樣細(xì)胞，從而對(duì)肝損傷有一定的修復(fù)作用。方法 體外復(fù)蘇培養(yǎng)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞，66只健康雌性 Wistar 大鼠，隨機(jī)取22只，不做任何處理為正常對(duì)照組，余44只采用白酒灌胃30 d的方式建立大鼠慢性酒精性肝損傷模型，建模后將其隨機(jī)分為模型組(尾靜脈注射1 mL PBS)，hAMSCs組(經(jīng)尾靜脈注入1 mL hAMSCs(2×106個(gè))，每組各22只。于移植后4周，采用全自動(dòng)生化分析儀分別檢測(cè)各組大鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、血清總膽紅素(TBIL)、血清白蛋白(ALB)、血清總蛋白(Tp)；同時(shí)檢測(cè)檢測(cè)各組大鼠肝臟超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH- PX)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、以及丙二醛(MDA)、IL- 4含量變化；免疫熒光顯微鏡觀察PKH-26 標(biāo)記的 hAMSCs分布情況，TUNEL法檢測(cè)各組肝細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果 各組大鼠血生化檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組中ALT、AST、TBIL、Tp含量均顯著升高，而與模型組比較，hAMSCs移植組中ALT、AST、TBIL、Tp含量均顯著下降(P<0.05)，與正常對(duì)照組比較，模型組中ALB含量明顯下降，而與模型組比較，hAMSCs移植組中ALB含量明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，hAMSCs移植組SOD、GSH- PX、CAT含量均顯著增高，MDA、IL- 4 含量均顯著下降，與正常對(duì)照組比較，hAMSCs移植組SOD、GSH- PX、CAT含量均降低，MDA、IL- 4含量均升高(P<0.05)；移植組可見(jiàn)移植的PKH-26 標(biāo)記陽(yáng)性的hAMSCs細(xì)胞分布于肝臟組織內(nèi)，其余各組未見(jiàn)此類細(xì)胞分布(P<0.05)；TUNEL法檢測(cè)各組肝細(xì)胞凋亡可見(jiàn)凋亡細(xì)胞數(shù)，模型組最多(34.27±5.71)，hAMSCs移植組次之(18.42±3.95)，正常對(duì)照組未見(jiàn)凋亡細(xì)胞。結(jié)論 人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞移植能夠改善大鼠肝硬化的血生化指標(biāo)水平，hAMSCs移植后可以減輕慢性酒精性肝損傷大鼠的肝臟細(xì)胞凋亡。

人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞；大鼠；移植；修復(fù)作用；酒精性肝損傷；

酒精性肝損傷是一系列肝功能損害的總稱，主要因長(zhǎng)期大量飲酒引起，按照發(fā)病的不同階段可分為肝脂肪變性→肝炎→肝纖維化，隨著病情的逐漸加重最終發(fā)展成為肝硬化[1，2]，其最主要的致病因素是長(zhǎng)期過(guò)量飲酒，但同時(shí)還受包括環(huán)境因素、遺傳因素在內(nèi)的其他因素的影響[3]。慢性酒精性肝損傷是指肝功能損害病程需超過(guò)6個(gè)月，調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)在2010年全球共有493 300 人死于酒精引起的肝硬化[4]，人們精神及心理壓力隨著社會(huì)的發(fā)展逐漸增加，酒品的銷量也相應(yīng)增加，也因此慢性酒精性肝損傷的發(fā)病率逐年增高，成為影響人類健康的又一因素。戒酒為酒精性肝損傷進(jìn)一步發(fā)展的最為主要的治療方式，對(duì)于已經(jīng)造成嚴(yán)重肝功能損害的患者，目前尚無(wú)有效的藥物治療，臨床中多以支持治療進(jìn)行調(diào)節(jié)，但臨床效果一般[5]

干細(xì)胞可以在特定條件下分化成為不同的組織[6-10]，因此被廣泛地用于各種疾病治療的研究中，大量研究將干細(xì)胞移植運(yùn)用于各種疾病的治療中，試圖依靠干細(xì)胞移植來(lái)解決先前存在的治療方法無(wú)法解決的問(wèn)題，并且已經(jīng)取得了令人囑目的進(jìn)展[11-14]，包括肝臟疾病的治療[15-17]。在干細(xì)胞移植相關(guān)研究中不斷地發(fā)現(xiàn)問(wèn)題解決問(wèn)題，使得相關(guān)研究逐漸深入，人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(human amniotic mesenchymal stem cells，hAMSCs)也逐漸走進(jìn)我們的研究視野，hAMSCs不僅來(lái)源廣泛，而且具有較強(qiáng)的分化能力及強(qiáng)大的增殖能力，這些特點(diǎn)使得hAMSCs成為繼骨髓干細(xì)胞之后干細(xì)胞研究領(lǐng)域中的又一熱點(diǎn)[18-20]。本文旨在利用hAMSCs的多種分化和增殖功能，觀察其對(duì)肝損傷的修復(fù)作用。

1 材料和方法

1.1 主要材料及來(lái)源

PKH-26 體外標(biāo)記試劑盒(產(chǎn)品編號(hào) MINI26)(Sigma-Aldrich公司)、Konelab PRIME 30 型全自動(dòng)生化分析儀(美國(guó) Thermo 公司)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒(批號(hào):20120626)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)試劑盒(批號(hào)：20120625)、白蛋白(Alb)試劑盒(批號(hào):20120607)、總蛋白(TP)試劑盒(批號(hào):20120410)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(批號(hào):20120628)、丙二醛( MDA)試劑盒(批號(hào):20120514)、微量還原型谷肌甘膚(GSH)試劑盒(批號(hào):20120621)均購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司、freedom evolyzer 全自動(dòng)酶免工作站(瑞士TECAN公司)、TUNEL 細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒(北京中昊生物，批號(hào) 1103110)。

1.2 方法

1.2.1 建立大鼠模型及實(shí)驗(yàn)分組:將66只健康的Wistar 大鼠進(jìn)行隨機(jī)分組，分別為正常對(duì)照組，模型組，hAMSCs組，共3組，每組22只，分組后對(duì)各組動(dòng)物進(jìn)行不同處理，其中正常對(duì)照組不做任何處理，模型組各只大鼠經(jīng)過(guò)43%白酒按照10 mL/kg·d劑量灌胃處理30 d，30 d后經(jīng)尾靜脈為各只大鼠注射PBS，劑量為1 mL，頻率為每天1次，共注射4周；hAMSCs組的各只大鼠采用與模型組相同的方式、使用相同的白酒灌胃處理30 d，30 d后經(jīng)尾靜脈分別為各只大鼠注射1 mL hAMSCs，約2×106個(gè)hAMSCs細(xì)胞，頻率為每天1次，共注射4周。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(津)2013-0021，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(津)2013-0001。

1.2.2 體外復(fù)蘇培養(yǎng)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞: 從冰箱中取出儲(chǔ)存在凍存管中凍存的hAMSCs(在天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)(號(hào):201458)并經(jīng)家屬同意，取產(chǎn)后棄置的完整胎盤(pán)組織，將羊膜層與絨毛膜層鈍性分離，用含有雙抗的平衡液反復(fù)沖洗，盡可能去除血污，用酶消化法從羊膜中分離和培養(yǎng) hAMSCs，然后凍存?zhèn)溆谩?將凍存管放置在37℃的水箱中進(jìn)行水浴，使hAMSCs進(jìn)行快速解凍并復(fù)蘇，經(jīng)過(guò)1 min解凍處理，hAMSCs已徹底解凍，1 min后將凍存管取出，將凍存管中的hAMSCs倒入培養(yǎng)瓶再取適量α-MEM培養(yǎng)基加入其中，將培養(yǎng)瓶放置在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，將培養(yǎng)箱的條件設(shè)置為37℃，含有5% CO2。

1.2.3 檢測(cè)各組大鼠ALT、 AST、TBIL、ALB、Tp含量變化:于移植后4周后，分別從各只大鼠眼眶靜脈取血，各組中不同大鼠采用相同的方法采血，采血量相同，把收集到的血液樣本靜置30 min，調(diào)整離心機(jī)為3 000 r/min狀態(tài)，將收集的血液標(biāo)本進(jìn)行離心處理，10 min后取出離心管用膠頭滴管取血清置于-20℃冰箱進(jìn)行保存。使用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定ALT、 AST、TBIL、ALB、Tp。具體操作按照相關(guān)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.4 檢測(cè)各組大鼠SOD、GSH- PX、CAT、MDA、IL- 4含量變化:于移植后4周后，分別將各組大鼠腹腔注射法麻醉后進(jìn)行固定，用注射器針頭進(jìn)行心臟穿刺處死大鼠，取出肝臟并從中剪取部分進(jìn)行反復(fù)沖洗后進(jìn)行保存?zhèn)溆谩z測(cè)時(shí)從液氮中取出肝臟迅速解凍，剪取肝臟同一部位肝組織200 mg，加入適量PBS液 (pH 7.4)，勻漿后定容至2 mL，離心收取上清液，采用全自動(dòng)酶免工作站檢測(cè)SOD、GSH- PX、CAT、MDA、IL- 4含量的變化。

1.2.5 免疫熒光顯微鏡觀察PKH-26 標(biāo)記的 hAMSCs分布情況:用熒光染料PKH-26對(duì)hAMSCs進(jìn)行標(biāo)記，所有操作均嚴(yán)格按照相關(guān)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，具體操作步驟如下：取少量事先準(zhǔn)備好的于培養(yǎng)瓶中進(jìn)行貼壁生長(zhǎng)達(dá)90%以上的細(xì)胞，加入胰酶消化細(xì)胞形成單細(xì)胞懸液，收集2×107細(xì)胞于離心管，向其中加1 mL稀釋液C制備成細(xì)胞懸液保證細(xì)胞完全散離，染色前準(zhǔn)備4×10-6mol/L的PKH-26染液，用稀釋液C稀釋后置于離心管，盡快加1 mL 2×細(xì)胞到1 mL 2×染料，立即用吸管均勻快速混合樣品，為保證液體充分混合需過(guò)一段時(shí)間將離心管來(lái)回倒置數(shù)次，此過(guò)程孵育時(shí)長(zhǎng)約為2 min。加入等量FBS中止染色反應(yīng)，孵育1 min。400 r/min離心10 min，去上清液。用DMEM洗3次，然后調(diào)整細(xì)胞濃度至所需濃度。收集PKH-26標(biāo)記后的hAMSCs注射入hAMSCs移植組及聯(lián)合組大鼠體內(nèi)，24 h后處死大鼠, 顯微鏡下觀察PKH-26 標(biāo)記的 hAMSCs分布情況。

1.2.6 TUNEL法檢測(cè)各組肝細(xì)胞凋亡情況：于移植后4周，分別將各組大鼠腹腔注射法麻醉后，將大鼠進(jìn)行固定，然后用注射器針頭進(jìn)行心臟穿刺將大鼠處死后，打開(kāi)腹腔取出肝臟組織，經(jīng)過(guò)石蠟包埋后進(jìn)行切片處理，切片厚薄一致，約6 μm，將制備好的切片浸入1×PBS 3次；滴加100 μL proteinase K工作液。制陽(yáng)性片，具體操作步驟如下，滴加100 μL DNase I反應(yīng)液→浸入1×PBS三次(注：樣本片和陰性片不加DNase I反應(yīng)液)→加50 μL TdT酶，漂洗→標(biāo)記、顯色→透明、封片→觀察。在高倍鏡下隨機(jī)選擇3個(gè)視野進(jìn)行觀察并計(jì)算出細(xì)胞的凋亡情況，具體方法為計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)作為凋亡指數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)觀察

取凍存的h AMSCs進(jìn)行復(fù)蘇后接種于培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，接種濃度為1×105個(gè)/mL，24 h后培養(yǎng)瓶中可見(jiàn)少量細(xì)胞貼壁(圖1A)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)貼壁細(xì)胞數(shù)逐漸增多，48 h后差不多全部細(xì)胞均已貼壁，且貼壁較為牢固晃動(dòng)培養(yǎng)瓶時(shí)不易脫離(圖1B)，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)時(shí)可見(jiàn)大部分細(xì)胞具有較為一致的形態(tài)，多呈梭形，呈旋窩狀生長(zhǎng)。

2.2 各組大鼠ALT、 AST、TBIL、ALB、Tp檢測(cè)結(jié)果

采用全自動(dòng)生化分析儀對(duì)各組大鼠血液中ALT、 AST、TBIL、ALB、Tp含量進(jìn)行測(cè)定，將各組結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，模型組與正常對(duì)照組相比，模型組中ALT、AST、TBIL、Tp含量均顯著升高，而ALB含量則明顯下降，而與模型組比較，hAMSCs移植組中ALT、AST、TBIL、Tp含量均顯著下降，而ALB含量明顯升高，差異有顯著性意義。如表1。

2.3 各組大鼠肝臟SOD、GSH- PX、CAT、MDA、IL- 4檢測(cè)結(jié)果

采用全自動(dòng)酶免工作站檢測(cè)各組中SOD、GSH- PX、CAT、MDA、IL- 4含量的變化，結(jié)果顯示：將hAMSCs移植組與模型組相比，SOD、GSH- PX、CAT含量在hAMSCs移植組中顯著增高，而相反MDA、IL- 4 含量則比模型組顯著下降，與正常對(duì)照組比較，SOD、GSH- PX、CAT含量在hAMSCs移植組均降低，相反MDA、IL- 4含量均升高( P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.4 PKH-26 標(biāo)記的 hAMSCs分布情況

以PKH-26 標(biāo)記的 hAMSCs后將各組肝組織置于顯微鏡下進(jìn)行觀察，觀察陽(yáng)性細(xì)胞的分布情況，被標(biāo)記成功的細(xì)胞顯微鏡下呈紅色熒光，將各組觀察結(jié)果進(jìn)行比較時(shí)發(fā)現(xiàn)在hAMSCs移植組肝臟組織中絕大部分的 hAMSCs均有紅色熒光，這說(shuō)明該方法具有較好的標(biāo)記敏感性，標(biāo)記率高，而其余各組未見(jiàn)相似細(xì)胞出現(xiàn)(P<0.05)，如圖2所示。

2.5 細(xì)胞凋亡情況

如圖3TUNEL 結(jié)果顯示：正常細(xì)胞核不著色，當(dāng)細(xì)胞凋亡后，細(xì)胞核呈棕黃色，形態(tài)也發(fā)生相應(yīng)的改變，變得小而圓。將三組結(jié)果對(duì)比，模型組凋亡率升高，凋亡細(xì)胞數(shù)是3組中最多的為(34.27±5.71)，hAMSCs移植組次之，凋亡細(xì)胞數(shù)為(18.42±3.95)，在正常對(duì)照組(0.00±0.00)則沒(méi)有發(fā)現(xiàn)凋亡的細(xì)胞。

表1 各組大鼠血液中ALT、AST、TBIL、ALB、Tp含量變化比較

注：P<0.05。 Note.P<0.05.

表2 各組大鼠肝臟組織中SOD、GSH- PX、CAT、MDA、IL- 4含量變化比較

注：P<0.05。Note.P<0.05.

圖1A : 24 h后h AMSCs；圖1B：48h后h AMSC圖1 hAMSCs的形態(tài)觀察(標(biāo)尺=100 μm)Fig.1A:hAMSCs at 24 h；Fig.1B:hAMSCs at 48 hFig.1 Morphological observation of the hAMSCs(Bar=100 μm)

3 討論

隨著社會(huì)的發(fā)展，人民的精神壓力、心理壓力也逐漸增加，酒精的銷量逐年增加，為人類的健康造成了嚴(yán)重的威脅[21-25]。飲酒后酒精主要在肝臟進(jìn)行代謝，在肝臟內(nèi)先后轉(zhuǎn)化成為乙醛、乙酸，最終以二氧化碳及水的形式排除體外[26-27]，當(dāng)大量長(zhǎng)期飲酒后，酒精的中間代謝產(chǎn)物在肝內(nèi)大量蓄積，對(duì)肝臟造成慢性損傷，此外乙醛還能使肝細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)破壞肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)以及誘導(dǎo)自身免疫反應(yīng)，使肝細(xì)胞發(fā)生變性壞死[28]。

隨著干細(xì)胞的相關(guān)研究越來(lái)越多，使其成為多個(gè)領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)當(dāng)然也包括肝損傷在內(nèi)。大量研究顯示干細(xì)胞可以在特定條件下分化成各種組織器官，這為多種疾病尋找新的治療方案提供了新的思路。hAMSCs作為干細(xì)胞的另一個(gè)來(lái)源因其取材方便，來(lái)源廣泛受到廣泛關(guān)注，研究證實(shí)hAMSCs在體外可以穩(wěn)定增殖傳代，同樣具有干細(xì)胞的特性，即具有高度分化的潛能。本實(shí)驗(yàn)即利用hAMSCs的本特點(diǎn)將其用于慢性酒精性肝損傷的治療，觀察其對(duì)肝損傷的修復(fù)作用。

本研究在建立慢性酒精性肝損傷模型后，為 hAMSCs組的各只大鼠經(jīng)尾靜脈注入 hAMSCs進(jìn)行治療，通過(guò)測(cè)定血生化判斷 hAMSCs對(duì)肝損傷的修復(fù)作用。本研究主要從血生化及肝細(xì)胞凋亡情況來(lái)判斷這種作用。首先在將各組血生化值進(jìn)行相應(yīng)比較時(shí)發(fā)現(xiàn)，將模型組與正常對(duì)照組的各項(xiàng)血生化值對(duì)比時(shí)，ALT、AST、TBIL、Tp含量在模型組中顯著高于正常對(duì)照組，而ALB含量則相反是明顯低于正常對(duì)照組的；其次比較hAMSCs移植組與模型組兩組結(jié)果，ALT、AST、TBIL、Tp含量及MDA、IL- 4 含量在hAMSCs移植組中較模型組顯著下降，而ALB及SOD、GSH- PX、CAT含量升高較為顯著，以上比較差異均有顯著性意義；hAMSCs移植組與正常對(duì)照組比較，hAMSCs移植組SOD、GSH- PX、CAT含量均降低，MDA、IL- 4含量均升高(P<0.05)；此外研究還發(fā)現(xiàn)用PKH-26 標(biāo)記的hAMSCs陽(yáng)性細(xì)胞，在hAMSCs移植組可見(jiàn)移植細(xì)胞分布于肝臟組織，其余各組未見(jiàn)(P<0.05)；而當(dāng)采用TUNEL法檢測(cè)各組肝細(xì)胞凋亡時(shí)可見(jiàn)其在模型組中是最多，正常對(duì)照組則沒(méi)有發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞，hAMSCs移植組的細(xì)胞凋亡數(shù)介于二者之間。

綜上所述：hAMSCs移植能夠改善大鼠肝硬化的血生化指標(biāo)水平，且可以減輕慢性酒精性肝損傷大鼠的肝臟細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)為大鼠大鼠肝硬化的實(shí)驗(yàn)研究提供了理論依據(jù)。

圖2A：正常對(duì)照組；圖2B：模型組；圖2C：hAMSCs移植組圖2 各組PKH-26 標(biāo)記的 hAMSCs分布(標(biāo)尺=100 μm)Note.A：Normal control group；B:Model group；C:hAMSCs groupFig.2 Distribution of PKH-26-labelled hAMSCs in each ±s)(Bar=100 μm)

圖3A：正常對(duì)照組；圖3B：模型組；圖3C：hAMSCs移植組圖3 各組大鼠細(xì)胞凋亡變化(標(biāo)尺=100 μm)Note.A:Normal control group；B:Model group；C:hAMSCs groupFig.

[1] Bruha R,Dvorak K,Petrtyl J A,et al.Alcoholic liver disease[J].World J hepatol,2012,4 (3) :81-90.

[2] 厲有名,范建高,土炳元,等.酒精性肝病診療指南[J].臨床肝膽病雜志,2010,7 (3):229-232.

[3] Williams JA, Ding WX. A mechanistic review of mitophagy and its role in protection against alcoholic liver disease[J]. Biomolecules 2015, 5:2619-2642.

[4] Rehm J, Samokhvalov AV, Shield KD. Global burden of alcoholic liver diseases [J]. J Hepatol 2013, 59: 160-168.

[5] 王燕.酒精性肝損傷保護(hù)作用的研究進(jìn)展[J].科技展望,2014, (20):221.

[6] Lindenmair A,Hatlapatka T, Kollwig G, et al.Mesenchymal stem or stromal cells from amnion and umbilical cord tissue and their potential for clinical applications[J]. Cells, 2012,1(4): 1061-1088.

[7] 胡澤斌,王立生,崔春萍,等.干細(xì)胞臨床應(yīng)用安全性評(píng)估報(bào)告[J].中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù),2013,8(5):349-361.

[8] 何金秋,潘興南,王崇國(guó),等.自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療終末期肝病 39 例[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù),2010,14(45):8521-8525．

[9] Kharaziha P,Hellstr?m PM,Noorinayer B,et al.Improvement of liver function in liver cirrhosis patients after autologous mesenchymal stem cell injection: a phase I-II clinical trial[J].Eur J Gastroenterol Hepatol,2009,21(10):1199-1205．

[10] 楊華強(qiáng),張榮環(huán),杜玲,等.臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療脊髓損傷的臨床研究[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2012,12(3):518-521.

[11] Amable RP, Teixeira MV, Carias RB,et al.Protein synthesis and secretion in human mesenchymal cells derived from bone marrow, adipose tissue and Wharton’s jelly[J].Stem Cell Res Ther,2014,5(2): 53.

[12] de Girolamo L, Lucarelli E,Alessandri G, et al.Mesenchymal stem/stromal cells: a new “cells as drugs” paradigm. efficacy and critical aspects in cell therapy[J].Curr Pharm Des,2013,19: 2459-2473.

[13] 牟樂(lè)明,孫占勝,王伯珉,等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)脊髓損傷大鼠Toll樣受體4表達(dá)的影響[J].山東大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2014,52(1):37-41.

[14] Sun ZM,Liu HL,Geng LQ,et al. HLA-matched sibling transplantation with G-CSF mobilized PBSCs and BM decreases GVHD in adult patients with severe aplastic anemia[J].J Hematol Oncol,2010,3: 51.

[15] Manuelpillai U,Moodley Y,Borlongan CV,et al.Amniotic membrane and amniotic cells: Potential therapeutic tools to combat tissue inflammation and fibrosis[J].Placenta,2011,32: S320-325.

[16] Takami T,Terai S,Sakaida I.Advanced therapies using autologous bone marrow cells for chronic liver disease[J].Discov Med,2012,14( 74): 7-12.

[17] Russo FP,Parola M.Stem cells in liver failure[J].Best Pract Res Clin Gastroenterol,2012,26(1) : 35-45.

[18] Kita K,Gauglitz GG,Phan TT,et al.Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from the sub-amniotic human umbilical cord lining membrane[J].Stem Cells Dev,2010,19(4): 491-502.

[19] Perin L,Sedrakyan S,Giuliani S.Protective effect of human amniotic fluid stem cells in an immunodeficient mouse model of acute tubular necrosis[J].PLo S One,2010,5(2): e9357.

[20] Portmann-Lanz CB,Schoeberlein A,Portmann R,et al.Turning placenta into brain: placental mesenchymal stem cells differentiate into neurons and oligodendrocytes[J].Am J Obstet Gynecol,2010,202(3): 294. e1-294.e11.

[21] Mattson SN, Crocker N, Nguyen TT. Fetal alcohol spectrum disorders: Neuropsychological and behavioral features[J]. Neuropsychol Rev, 2011, 21(2): 81-101.

[22] Guerri C, Bazinet A, Riley EP. Foetal alcohol spectrum disorders and alterations in brain and behavior [J]. Alcohol 2009, 44(2): 108-114.

[23] Ahmed-Landeryou MJ. Fetal central nervous system development and alcohol—the evidence so far [J].Fetal Pediatr Pathol 2012, 31(6): 349-359.

[24] Wang J, Zhang Y, Zhang H, et al. Toxic effects of fluoride on reproductive ability in male rats: Sperm motility, oxidative stress, cell cycle, and testicular apoptosis [J]. Fluoride 2009, 42(3): 174-178.

[25] Laslett AM, Ferris J, Dietze P, et al. Social demography of alcohol-related harm to children in Australia [J]. Addiction 2012, 107(6): 1082-1089.

[26] 翟紅梅,肖穎,肖霄,等.酒在人體內(nèi)的代謝及酒精中毒[J]. 石家莊學(xué)院學(xué)報(bào),2010,12(3):27-29.

[27] 周曉娟,王超.槲皮素對(duì)大鼠慢性酒精性肝損傷的保護(hù)作用[J].長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)(自科版) 醫(yī)學(xué)下旬刊,2013,10(11): 8-10.[28] 韻海霞,穆志龍,俞科賢,等.帕珠丸對(duì)慢性酒精性肝損傷大鼠肝組織SOD、CAT 活性及 MDA 含量的影響[J].青海醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2014,35(1): 57-59.

Changes of blood biochemical indexes in the rats with chronic alcoholic liver injury after transplantation of human amniotic mesenchymal stem cells

HAN Hai-yan1,SONG Wen-gGuang2, LIU Jin1, CUI Yun-tao1, XUE Zhan-guo3

(1. Department of laboratory medicine, The Affiliated Hospital of the Armed Police Ligistics College,Tianjin 300162, China;2.Research Center of Reproductive Medicine, the Affiliated Hospital of the Armed Police Logistics College, Tianjin 300162;3.Department of Care, Datong Fifth People’s Hospital, Shanxi 037000 )

Objective Studies have suggested that human amniotic mesenchymal stem cells (hAMSCs) have multiple differentiation and proliferation functions, and can be induced to differentiate into hepatocyte-like cells to repair the liver injury.Methods Human amniotic mesenchymal stem cell swere prepared by resuscitation of frozen cells. Sixty-six healthy female Wistar rats were divided randomly into normal control group (n=22) without any treatment,and rat models of chronic alcoholic liver injury(n=44) treated by gastric gavage of alcohol for consecutive 30 days. After modeling,22 of those 44 rats were randomly divided into model group (tail vein injection of 1 mL PBS), ad another 22 rats as hAMSCs group which received tail vein injection of 1 mL (2 ×106) hAMSCs.Four weeks after the transplantation, the rat serum alanine aminotransferase (ALT),aspartate aminotransferase(AST), total bilirubin (TBIL), albumin (ALB), total protein (TP)were detected by a full automatic biochemical analyzer, and the catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase(GSH PX), malondialdehyde (MDA) and IL-4 content in the liver tissue were detected,the distribution of PKH-26 labeled hAMSCs was observed by immunofluorescence microscopy, and TUNEL staining was used to detect apoptosis in liver cells.Results The rat blood biochemical test showed that compared with normal control group, the serum content of ALT, AST, Tp and TBIL in the model group was significantly higher,compared with those of the model group; the serum contents of ALT, AST, TBIL and Tp in the hAMSCs transplantation group were significantly decreased(P<0.05), compared with hose of the normal control group. The content of ALB in the model group was significantly decreased, and the content of ALB in hAMSCs transplantation group was significantly higher (P<0.05)compared with those of the model group. The contents of SOD GSH- PX and CAT in the liver tissues were significantly increased in the hAMSCs transplantation group. The contents of MDA and IL-4 were decreased significantly, compared with those of the normal control group. The contents of SOD GSH- PX, CAT in the liver tissues were decreased in the hAMSCs transplantation group, and the content of MDA and IL-4 in the liver tissues were significantly increased(P<0.05). PKH-26-labeled positive hAMSCs cells were observed to be distributed in the liver tissue of the hAMSCs transplantation group but not in the liver tissue of other groups (P<0.05).TUNEL assay detected apoptotic cells in the liver of all model groups, with the highest number in the model group (34.27±571) and less in the hAMSCs transplantation group (18.42±3.95), but not found in the normal control group.Conclusions Human amniotic mesenchymal stem cell transplantation can improve the blood biochemical indexes of rats with cirrhosis, and hAMSCs can reduce the apoptosis in liver cells in rats with chronic alcoholic liver injury.

Human amniotic mesenchymal stem cells; Rat; Transplantation; Repair; Alcoholic liver injury

韓海燕(1983-)，女；宋文廣(1982-)，男。研究方向：醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)。E-mail: hanhaiyangyh@126.com。

薛占國(guó)(1983-)，男，研究方向：重癥醫(yī)學(xué)。E-mail: weiyanxiahn@163.com。

R-33

A

1671-7856(2017) 02-0049-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.02.009

2016-09-09