MIF基因rs755622位點(diǎn)多態(tài)性與廣西壯族人群炎癥性腸病的關(guān)系

覃立鋒，呂曉丹，呂小平，黃力毅，陳蘭

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021)

·臨床研究·

MIF基因rs755622位點(diǎn)多態(tài)性與廣西壯族人群炎癥性腸病的關(guān)系

覃立鋒，呂曉丹，呂小平，黃力毅，陳蘭

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021)

目的 探討巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(MIF)基因rs755622位點(diǎn)多態(tài)性與廣西壯族人群炎癥性腸病(IBD)的關(guān)系。方法 選擇廣西壯族潰瘍性結(jié)腸炎(UC)患者144例(UC組)、克羅恩病(CD)患者101例(CD組)，另選廣西壯族健康志愿者202例(對(duì)照組)，取各組腸黏膜組織，抽提基因組DNA，采用PCR技術(shù)擴(kuò)增MIF基因目的片段，并進(jìn)行產(chǎn)物測(cè)序，結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)上進(jìn)行序列比對(duì)。結(jié)果 所有目的片段的測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)上序列一致。以CC基因型為參照，UC組GG、GC基因型與對(duì)照組同基因型比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。以CC基因型為參照，CD組GG、GC基因型與對(duì)照組同基因型比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。UC組、CD組G、C等位基因頻率與對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。結(jié)論 MIF基因rs755622位點(diǎn)多態(tài)性與廣西壯族人群IBD的易感性無(wú)明顯相關(guān)性。

炎癥性腸病；潰瘍性結(jié)腸炎；克羅恩?。痪奘杉?xì)胞移動(dòng)抑制因子；單核苷酸多態(tài)性

炎癥性腸病(IBD)是一種病因尚未明確的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和克羅恩病(CD)。IBD在不同國(guó)家、地區(qū)、種族間發(fā)病率不同，有明顯的地域和種族差異，既往在歐洲和北美地區(qū)高發(fā)，近年來(lái)其發(fā)病率在亞洲地區(qū)呈逐漸升高趨勢(shì)。IBD的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，目前認(rèn)為可能是環(huán)境等多種因素作用于遺傳易感者，并在腸道菌群或尚未明確的特異性微生物參與下，啟動(dòng)了腸道免疫及非免疫系統(tǒng)，最終導(dǎo)致免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)過(guò)程[1]；其中遺傳易感性是IBD發(fā)病的一個(gè)基礎(chǔ)因素。巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(MIF)是一種具有多種生物活性的細(xì)胞因子，在機(jī)體的炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，MIF基因(rs755622位點(diǎn))與先天性關(guān)節(jié)炎、銀屑病、遺傳性過(guò)敏癥等自身免疫性疾病的發(fā)病有關(guān)[2～4]，但其與IBD相關(guān)性研究的報(bào)道結(jié)論并不一致。廣西是我國(guó)壯族人口最大的聚居地，其疾病遺傳性和易感基因非常獨(dú)特[5]。本研究探討MIF基因rs755622位點(diǎn)多態(tài)性與廣西壯族人群IBD的關(guān)系，旨在為壯族人群IBD的基因診斷及治療提供線索。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2013年1月～2016年2月在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診的IBD患者245例，其中UC患者144例(UC組)、CD患者101例(CD組)。UC組男71例、女73例，年齡(39.5±15.94)歲；CD組男49例、女52例，年齡(38.9±16.14)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①在廣西長(zhǎng)期生活、近三代直系親屬均為壯族且未與其他民族通婚的廣西居民；②符合《炎癥性腸病診斷與治療的共識(shí)意見(jiàn)(2012年·廣州)》[6]。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他感染性結(jié)腸炎和非感染性結(jié)腸炎者；②合并其他自身免疫性疾病的IBD者；③相互之間有親緣關(guān)系的IBD者。同期另選健康志愿者202例(對(duì)照組)，均為在廣西長(zhǎng)期生活、近三代直系親屬為壯族且未與其他民族通婚的廣西居民，相互之間無(wú)親緣關(guān)系，且與IBD患者無(wú)親緣關(guān)系。其中，男99例、女103例，年齡(39.2±16.23)歲。三組性別、年齡具有可比性。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，患者均知情同意。

1.2 MIF基因rs755622位點(diǎn)檢測(cè) ①標(biāo)本收集：在行電子結(jié)腸鏡檢查過(guò)程中，鉗取適量腸黏膜組織，生理鹽水清洗干凈，液氮罐中凍存。②基因組DNA提取：取各組腸黏膜組織30～50 mg，剪碎，液氮下研磨成粉末。采用基因組提取試劑盒抽提基因組DNA。使用微量核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)DNA濃度和純度合格，-20 ℃冰箱保存。③PCR擴(kuò)增：根據(jù)NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)設(shè)計(jì)MIF基因(包含rs755622位點(diǎn))引物，由大連寶生物工程有限公司合成。上游引物：5′-GGCGACTAACATCGGTGA-3′，下游引物：5′-GCAGAAGGACCAGGAGAC-3′，目的片段長(zhǎng)度358 bp。采用降落PCR程序擴(kuò)增目的片段。PCR反應(yīng)體系共20 μL：DNA 1 μL，2×Gflex PCR Buffer 10 μL，上下游引物各0.5 μL，Tks Gflex DNA polymerase 1 μL，ddH2O 7 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，3個(gè)循環(huán)；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，3個(gè)循環(huán)；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25個(gè)循環(huán)；95 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，5個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。取PCR產(chǎn)物5 μL在含核酸染料的2%瓊脂糖凝膠上電泳(120 V，45 min)，紫外光分析儀鑒定目的片段。④基因測(cè)序：采用切膠純化試劑盒將目的片段純化回收，并將回收的目的片段送南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)上進(jìn)行序列比對(duì)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件?；蛐头植歼z傳平衡采用Hardy-Weinberg遺傳平衡性檢驗(yàn)，P>0.05提示群體基因遺傳平衡，樣本來(lái)自同一孟德?tīng)柸后w。各組間基因型頻率和等位基因頻率比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果 所有PCR產(chǎn)物呈清晰均一條帶，大小為358 bp，與目的片段大小一致。

2.2 PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果 通過(guò)比對(duì)，確定所有目的片段的測(cè)序結(jié)果與GenBank基因庫(kù)上序列一致。rs755622位點(diǎn)共得到3種基因型：CC、GC和GG型。見(jiàn)插頁(yè)Ⅱ圖4。其基因型頻率及等位基因頻率分布見(jiàn)表1。UC組、CD組、對(duì)照組基因型分布均符合遺傳平衡定律(P均>0.05)，具有群體代表性。以CC基因型為參照，UC組GG、GC基因型與對(duì)照組同基因型比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2分別為0.261、0.287，P均>0.05)。以CC基因型為參照，CD組GG、GC基因型與對(duì)照組同基因型比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2分別為0.311、1.645，P均>0.05)。UC組、CD組G、C等位基因頻率與對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2分別為0.019、0.317，P均>0.05)。

3 討論

表1 各組MIF基因rs755622位點(diǎn)基因型與等位基因頻率分布

IBD的發(fā)病具有明顯的地域和種族差異。雖然IBD的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，但普遍認(rèn)為是由于環(huán)境或其他多種因素作用于遺傳易感者所致[7～9]。單卵雙胞胎高共患率以及IBD的家族聚集性和種族差異性，表明IBD的發(fā)病亦與遺傳因素密切相關(guān)。2001年Hugot等[10]報(bào)道了第一個(gè)CD易感基因NOD2/CARD15。到目前為止，人們通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)性研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了160多個(gè)IBD易感位點(diǎn)。

1966年Bloom等[11]用豚鼠進(jìn)行變態(tài)反應(yīng)研究時(shí)發(fā)現(xiàn)了一種炎癥因子，其具有限制巨噬細(xì)胞游走的功能，因此被命名為MIF。MIF是一種含有115個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，相對(duì)分子量為12 500，具有α鏈和β鏈組成的三維晶體結(jié)構(gòu)，與其他已知蛋白質(zhì)之間無(wú)明顯的同源性。MIF的晶體結(jié)構(gòu)是由3個(gè)同源三聚體(含2個(gè)反向平行α螺旋和6個(gè)β片層單體)形成的一個(gè)末端開(kāi)放的中空結(jié)構(gòu)[12]。MIF的表達(dá)具有組織特異性，主要表達(dá)于胃腸道、肺、皮膚表層、泌尿生殖道等組織[13]。MIF是一種具有限制巨噬細(xì)胞游走活性的多源性促炎細(xì)胞因子，能控制巨噬細(xì)胞在炎癥部位的浸潤(rùn)、聚集，并促使巨噬細(xì)胞分泌多種化學(xué)物質(zhì)及細(xì)胞因子，因此是人體炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答過(guò)程中關(guān)鍵性的細(xì)胞因子。健康個(gè)體腸道內(nèi)的促炎癥反應(yīng)和抗炎癥反應(yīng)處于精密調(diào)控的平衡之中。但在IBD患者體內(nèi)該平衡被打破，大量的促炎癥因子高表達(dá)，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)的過(guò)度活化，促炎癥反應(yīng)明顯增強(qiáng)，而抗炎癥反應(yīng)被抑制。由于MIF在機(jī)體炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答過(guò)程中具有重要作用，其在IBD中的作用亦受到重視。但目前其研究結(jié)果并不一致。Ohkawara等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在正常大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞中僅有微量MIF表達(dá)，而在葡聚糖硫酸酯鈉誘導(dǎo)的結(jié)腸炎組織中MIF表達(dá)顯著增加。張啟芳等[15]研究發(fā)現(xiàn)，UC患者外周血和病變腸黏膜組織中MIF表達(dá)顯著增加，而在CD患者外周血和病變腸黏膜組織中表達(dá)并未明顯增加。

人類MIF基因定位于染色體22q11.2，長(zhǎng)度約為0.8 kb，由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成[16]。在MIF的cDNA序列中，其rs755622位點(diǎn)G或C的變化構(gòu)成了MIF基因的多態(tài)性。該多態(tài)性位點(diǎn)位于MIF基因的啟動(dòng)子區(qū)，-173G/C多態(tài)性會(huì)影響MIF基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，進(jìn)而影響體內(nèi)MIF水平，并決定疾病的易感性[17]。研究發(fā)現(xiàn)，MIF基因rs755622位點(diǎn)突變與青少年先天性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病有關(guān)[2]； 有研究亦發(fā)現(xiàn)，MIF基因rs755622位點(diǎn)為炎性關(guān)節(jié)炎的易感基因[16]； MIF-173*C等位基因，特別是CATT(7)-MIF-173*C單倍體與銀屑病的發(fā)病相關(guān)[3]；MIF基因rs755622位點(diǎn)多態(tài)性是遺傳性過(guò)敏癥的一個(gè)危險(xiǎn)因素[4]；IBD患者與健康人群的MIF基因rs755622位點(diǎn)基因型分布和等位基因頻率比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但GC基因型人群可能有更高的發(fā)病趨勢(shì)。Nohara等[18]在日本人群中未發(fā)現(xiàn)MIF基因rs755622位點(diǎn)多態(tài)性在UC患者與健康人群有分布差異。費(fèi)保瑩等[19]對(duì)浙江地區(qū)漢族人群的研究發(fā)現(xiàn)，UC患者M(jìn)IF基因rs755622 C/C基因型頻率顯著高于正常人，提示CC基因型可能為其易感基因。譚詩(shī)云等[20]Meta分析發(fā)現(xiàn)，MIF基因rs755622位點(diǎn)可能是UC發(fā)病的易感基因，但與CD發(fā)病無(wú)明顯相關(guān)性。

本研究UC、CD患者M(jìn)IF基因rs755622位點(diǎn)各基因型分布和等位基因頻率與健康人群比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明MIF基因rs755622位點(diǎn)多態(tài)性與廣西壯族人群IBD的易感性無(wú)明顯相關(guān)性。與Nohara等[18]報(bào)道基本一致。本研究并未發(fā)現(xiàn)IBD患者基因型頻率與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與Mrowicki等[17]報(bào)道并不一致。其原因可能與地域和種族差異有關(guān)。

綜上所述，MIF基因rs755622位點(diǎn)多態(tài)性可能與廣西壯族人群IBD無(wú)明顯相關(guān)性。但本研究的樣本量偏小，且為單一種族研究，其結(jié)果的準(zhǔn)確性有待于更大規(guī)模研究或在其他人群中進(jìn)一步驗(yàn)證。

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國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81460114)；廣西醫(yī)科大學(xué)青年科學(xué)基金(GXMUYSF201334)。

陳蘭(E-mail： chenll2008@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.08.017

R574

B

1002-266X(2017)08-0056-03

2016-10-31)