原發(fā)性肝癌患者癌組織、血清miR-202表達(dá)變化及其意義

於琳，張開炯，柴利，李寶林，楊志惠，劉靳波(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院,四川瀘州646000)

·論著·

原發(fā)性肝癌患者癌組織、血清miR-202表達(dá)變化及其意義

於琳，張開炯，柴利，李寶林，楊志惠，劉靳波
(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院,四川瀘州646000)

目的 觀察原發(fā)性肝癌患者癌組織及血清微小RNA 202(miR-202)水平變化，并探討其意義。方法 70例原發(fā)性肝癌患者，留取其術(shù)前血清標(biāo)本及手術(shù)切除的原發(fā)性肝細(xì)胞癌組織標(biāo)本；30例份正常肝組織來自本院手術(shù)切除的肝血管瘤旁組織(病理檢查證實(shí)無腫瘤浸潤)，30例體檢健康者留取血清標(biāo)本，檢測(cè)原發(fā)性肝癌患者癌組織、正常肝組織miR-202，檢測(cè)原發(fā)性肝癌患者、健康體檢者血清miR-202。分析miR-202表達(dá)與原發(fā)性肝癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，繪制ROC曲線評(píng)價(jià)miR-202、AFP、miR-202聯(lián)合AFP對(duì)原發(fā)性肝癌的診斷價(jià)值。結(jié)果 原發(fā)性肝癌組織標(biāo)本中miR-202的相對(duì)表達(dá)量低于正常肝組織標(biāo)本(P均<0.05)，原發(fā)性肝癌患者血清中miR-202的相對(duì)表達(dá)量低于健康體檢者(P<0.05)；原發(fā)性肝癌組織中miR-202的相對(duì)表達(dá)量高于血清miR-202(P<0.05)。原發(fā)性肝癌組織中miR-202表達(dá)與原發(fā)性肝癌性別、年齡、血清AFP水平、腫瘤直徑、腫瘤數(shù)目、腫瘤部位、分化程度、TNM分期、轉(zhuǎn)移與否、包膜浸潤、HBV感染、是否伴隨肝硬化以及門靜脈癌栓均無關(guān)(P均>0.05)；原發(fā)性肝癌血清中miR-202的水平僅與腫瘤數(shù)目有關(guān)(P<0.05)，與性別、年齡、血清AFP水平、腫瘤直徑、腫瘤數(shù)目、腫瘤部位、分化程度、TNM分期、轉(zhuǎn)移與否、包膜浸潤、HBV感染、是否伴隨肝硬化以及門靜脈癌栓均無關(guān)(P均>0.05)。miR-202聯(lián)合AFP診斷原發(fā)性肝癌的ROC曲線下面積0.942，敏感度81.8%，特異度93.0%。結(jié)論 原發(fā)性肝癌組織中miR-202低表達(dá)，血清miR-202水平降低。血清miR-202水平與原發(fā)性肝癌腫瘤數(shù)目有關(guān)。miR-202聯(lián)合AFP診斷原發(fā)性肝癌的敏感度、特異度均較高。

肝癌；原發(fā)性肝癌；肝腫瘤；微小RNA；微小RNA202

原發(fā)性肝癌是常見的肝臟惡性疾病之一，目前已有的生物學(xué)標(biāo)志物特異度及敏感度均不高導(dǎo)致對(duì)肝癌的診斷價(jià)值欠佳[1]，因此亟需尋找對(duì)肝癌具有特異診斷價(jià)值的標(biāo)志物。微小RNA(miRNA)是一類內(nèi)源性非編碼小RNA，其異常表達(dá)可影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程[2，3]，提示miRNA可作為潛在的腫瘤診斷標(biāo)志物。miR-202在肝癌患者癌組織中呈低表達(dá)[4]，但目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道原發(fā)性肝癌組織及患者血清miR-202水平與肝癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。我們觀察了原發(fā)性肝癌患者癌組織及血清miR-202表達(dá)變化，并分析血清miR-202檢測(cè)診斷原發(fā)性肝癌的效能。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2014年7月～2015年1月西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院就診的原發(fā)性肝癌患者70例，男59例，女11例，年齡23～72歲，中位年齡48歲。均行手術(shù)切除，留取其術(shù)前血清標(biāo)本及手術(shù)切除的原發(fā)性肝細(xì)胞癌組織標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理檢查確診為原發(fā)性肝癌者；②在此次治療前均未接受任何治療者；③存在外科手術(shù)指征者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有嚴(yán)重營養(yǎng)不良者；②存在雙相情感障礙、應(yīng)激相關(guān)性精神障礙、偏執(zhí)性精神障礙、分裂情感性精神障礙、精神分裂癥等重型精神疾病，對(duì)自己的行為無完全刑事承擔(dān)能力者；③不愿意參加本次研究者。同時(shí)收集30例份正常肝組織甲醛固定石蠟包埋標(biāo)本,標(biāo)本均取自本院手術(shù)切除的肝血管瘤旁組織，病理組織學(xué)證實(shí)無腫瘤浸潤，患者中男16例、女14例，年齡26～61歲、中位年齡42歲。選擇同期在本院體檢中心體檢30例體檢健康者的血清標(biāo)本，檢查者中男18例、女12例，年齡21～55歲、中位年齡38歲。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，均獲得患者知情同意。

1.2 原發(fā)性肝癌患者癌組織及血清miR-202檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)原發(fā)性肝癌患者癌組織、正常肝組織miR-202及原發(fā)性肝癌患者、健康體檢者血清miR-202。取保存于1.5 mL滅酶、滅菌EP管中的原發(fā)性肝癌組織切片，加入二甲苯320 μL，漩渦震蕩10 s，瞬時(shí)離心后，將切片浸入二甲苯中，56 ℃干浴鍋中溫育3 min，待石蠟完全溶解后取出，置于室溫冷卻，按照miRNeasy FFPE Kit說明書操作提取RNA；血清RNA提取：將血清從-80 ℃冰箱取出，置室溫解凍，待完全溶解后取200 μL血清至1.5 mL滅菌、滅酶EP管中，按照miRNeasy Serum/Plasma Kit說明書操作提取RNA。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit說明書操作將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，樣本置-80 ℃保存。通過miRBase數(shù)據(jù)庫查找miR-202成熟序列：AGAGGUAUAGGGCAUGGGAA，采用莖環(huán)原則設(shè)計(jì)miR-202(GeneBank序列號(hào)：NC_000010.11)引物，其中上游引物序列：5′-GCTGGAGAGGTATAGGGCA-3′；下游引物序列：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。U6基因(GeneBank序列號(hào)：NC_000015.10)上游引物序列：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，下游引物序列：5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′，引物均由美國Invitrogen公司合成。PCR總反應(yīng)體系為20 μL，包括上、下游引物各0.8 μL，SYBR?Premix Ex Taq Ⅱ 10μL, ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL，模板cDNA 2 μL，無菌ddH2O補(bǔ)足體積至20 μL。反應(yīng)參數(shù):95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 3 s、60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。用ABI 7500 Fast Real-time PCR儀自帶軟件進(jìn)行熔解曲線分析， miR-202的相對(duì)表達(dá)量以2-ΔΔCt表示，ΔΔCt=[(樣本Ct目的基因-樣本Ct內(nèi)參基因)/(對(duì)照組Ct目的基因-對(duì)照組Ct內(nèi)參基因)]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0 統(tǒng)計(jì)軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)(四分位數(shù))[M(P25,P75)]表示，兩組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，多組間比較采用Cruskal-Wallis H檢驗(yàn)。同時(shí)記錄原發(fā)性肝癌患者腫瘤直徑、腫瘤數(shù)目、腫瘤部位、TNM分期[參照國際抗癌聯(lián)盟/美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)(UICC/AJCC)標(biāo)準(zhǔn)]、分化程度、是否轉(zhuǎn)移、HBV感染(采用乙肝 DNA定量PCR法判定，以<100 IU/mL為陰性)、AFP濃度(采用德國西門子公司ADVIA Centaur?XP 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測(cè))等臨床資料。以血清miR-202表達(dá)水平為變量繪制ROC曲線并進(jìn)行二元Logistics回歸分析評(píng)價(jià)miR-202單項(xiàng)和聯(lián)合AFP檢測(cè)對(duì)原發(fā)性肝癌的診斷價(jià)值。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 原發(fā)性肝癌組織及血清中miR-202相對(duì)表達(dá)量比較 正常肝組織、原發(fā)性肝癌組織標(biāo)本中miR-202的相對(duì)表達(dá)量分別為為1.05(0.85,1.39)、0.44(0.34,0.63)，原發(fā)性肝癌患者和健康體檢者血清中miR-202的相對(duì)表達(dá)量分別為0.26(0.10,0.51)、1.15(0.88,1.43)。原發(fā)性肝癌組織標(biāo)本中miR-202的相對(duì)表達(dá)量均低于正常肝組織標(biāo)本(P均<0.05)，原發(fā)性肝癌患者血清中miR-202的相對(duì)表達(dá)量低于健康體檢者(P<0.05)，原發(fā)性肝癌組織標(biāo)本中miR-202的相對(duì)表達(dá)量高于血清中(P<0.05)。

2.2 miR-202表達(dá)與原發(fā)性肝癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 miR-202表達(dá)與原發(fā)性肝癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系見表1。 原發(fā)性肝癌組織中miR-202表達(dá)與原發(fā)性肝癌性別、年齡、血清AFP水平、腫瘤直徑、腫瘤數(shù)目、腫瘤部位、分化程度、TNM分期、轉(zhuǎn)移與否、包膜浸潤、HBV感染、是否伴隨肝硬化以及門靜脈癌栓均無關(guān)(P均>0.05)；原發(fā)性肝癌血清中miR-202的水平僅與腫瘤數(shù)目有關(guān)(Z=-2.74，P<0.05)，與性別、年齡、血清AFP水平、腫瘤直徑、腫瘤數(shù)目、腫瘤部位、分化程度、TNM分期、轉(zhuǎn)移與否、包膜浸潤、HBV感染、是否伴隨肝硬化以及門靜脈癌栓均無關(guān)(P均>0.05)。

以血清miR-202水平為變量繪制ROC曲線(miR-202 值取 0.35, AFP值取400 g/L)評(píng)價(jià)miR-202、AFP、mR-202聯(lián)合AFP對(duì)原發(fā)性肝癌的診斷價(jià)值。與miR-202、AFP單獨(dú)檢測(cè)比較，miR-202聯(lián)合AFP診斷原發(fā)性肝癌的ROC曲線下面積(AUCROC)0.942，敏感度81.8%，特異度93.0%。見圖1、表1。

3 討論

肝癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多因素、多階段的復(fù)雜過程，由于起病隱匿，僅有小部分肝癌患者在確診時(shí)能夠手術(shù)治療，此為造成肝癌患者預(yù)后不良的關(guān)鍵因素。目前肝癌的診斷主要依靠血清AFP水平聯(lián)合影像學(xué)檢查(包括腹部超聲、MRI、CT增強(qiáng)掃描等)，但各有其不足之處，影像學(xué)檢查對(duì)組織細(xì)微改變的靈敏度不高，血清AFP對(duì)肝癌的診斷靈敏度和特異度分別為39%～64%與76%～91%[5]，導(dǎo)致其診斷價(jià)值受限，因此尋找一種有效的肝癌早期診斷標(biāo)志物尤為重要。

圖1 血清miR-202、AFP、miR-202聯(lián)合AFP診斷原發(fā)性肝癌的ROC曲線

指標(biāo)AUCROC敏感度(%)特異度(%)Younden指數(shù)陽性似然比/陰性似然比AFP0．92886．580．066．525．6miR?2020．72391．665．056．620．3miR?202聯(lián)合AFP0．94281．893．074．859．7

研究[6，7]報(bào)道肝癌組織中存在多種miRNAs的表達(dá)異常，但其在肝癌發(fā)生、發(fā)展過程中的具體調(diào)控機(jī)制仍有待闡明。在眾多肝癌相關(guān)miRNAs中，miR-202位于10q26的脆性位點(diǎn)，其丟失與子宮內(nèi)膜結(jié)核及大腦腫瘤有關(guān)，盡管許多文獻(xiàn)已報(bào)道m(xù)iR-202胃癌、食管癌、宮頸癌、白血病中表達(dá)異常降[8～10]，但關(guān)于肝癌組織中miR-202的表達(dá)情況目前僅有1例報(bào)道[4]，且肝癌組織及患者血清標(biāo)本中的水平及其與肝癌臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性至今尚無報(bào)道。在福爾馬林固定石蠟包埋標(biāo)本(FFPE)中，miRNA雖然含量相對(duì)較少但穩(wěn)定存在，不受標(biāo)本制作過程影響導(dǎo)致降解[11]。此外有學(xué)者分析新鮮組織與FFPE中提取出的miRNA水平發(fā)現(xiàn)，兩種組織樣本中的miRNA含量具有較好的相關(guān)性[12]，且FFPE較新鮮組織樣本易于保存和獲取。盡管目前已有大量文獻(xiàn)[13,14]報(bào)道m(xù)iRNAs在腫瘤中有表達(dá)譜改變，但是大部分研究僅采集組織標(biāo)本，導(dǎo)致其臨床應(yīng)用受到一定的限制。miRNA在血清標(biāo)本中穩(wěn)定存在，不會(huì)輕易被RNA酶降解，且其水平具有組織特異性[15]。miRNA的上述優(yōu)點(diǎn)均使其可能成為潛在的生物標(biāo)志物。

本研究結(jié)果表明，原發(fā)性肝癌組織標(biāo)本中miR-202的相對(duì)表達(dá)量均低于正常肝組織標(biāo)本，原發(fā)性肝癌患者血清中miR-202的相對(duì)表達(dá)量低于健康體檢者。與以往文獻(xiàn)[4]報(bào)道m(xù)iR-202在肝癌組織中表達(dá)降低的結(jié)果基本一致，提示miR-202在肝癌中發(fā)揮類似抑癌基因的作用。肝癌組織中miR-202表達(dá)與肝癌細(xì)胞系中miR-202表達(dá)一致，表明 miR-202作為一種可能的肝癌抑制基因，其表達(dá)下調(diào)在肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用。miR-202表達(dá)與肝癌患者生物學(xué)特性之間相關(guān)性分析表明，肝癌組織中miR-202的表達(dá)與肝癌患者性別、年齡、腫瘤直徑、分化程度、臨床分期、腫瘤部位、AFP濃度、包膜浸潤、門靜脈癌栓、包膜浸潤、HBV感染、是否肝硬化、是否轉(zhuǎn)移均無關(guān)。本研究同時(shí)檢測(cè)了miR-202在上述70例肝癌患者血清中的表達(dá)情況，結(jié)果與組織標(biāo)本相符，其在肝癌患者血清中的水平明顯低于健康志愿者，但在肝癌血清標(biāo)本中miR-202的表達(dá)水平與患者臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性分析結(jié)果表明，miR-202表達(dá)水平僅與腫瘤數(shù)目有關(guān)，而與患者性別、年齡、腫瘤直徑等無關(guān)，二者分析并不完全一致，可能是由于其在組織和血清中的調(diào)控機(jī)制不同導(dǎo)致。多發(fā)性腫瘤患者miR-202表達(dá)水平顯著低于單發(fā)性腫瘤患者，提示miR-202可能在影響肝癌細(xì)胞增殖方面起到一定作用。miR-202在肝癌各進(jìn)展期組織及血清中表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，提示其可作為肝癌診斷標(biāo)志物。本研究中原發(fā)性肝癌組織標(biāo)本中miR-202的相對(duì)表達(dá)量高于血清中，分析原因其一可能由于miR-202的調(diào)控機(jī)制不同所致;其二，血清miRNA主要來源于細(xì)胞主動(dòng)分泌釋放入血，故血清miRNA水平本就低于組織水平。由miR-202、AFP及兩者聯(lián)合對(duì)肝癌診斷的ROC曲線來看，miR-202對(duì)血清AFP具有一定的補(bǔ)充診斷意義。

綜上，原發(fā)性肝癌組織中miR-202低表達(dá)，血清miR-202水平降低。血清miR-202水平與原發(fā)性肝癌腫瘤數(shù)目有關(guān)；miR-202聯(lián)合AFP診斷原發(fā)性肝癌的敏感度、特異度均較高。

[1] Chauhan R, Lahiri N. Tissue-and serum-associated biomarkers of hepatocellular carcinoma [J]. Biomark Cancer, 2016,8(Suppl 1):37-55.

[2] Wu Y, Yu J, Ma Y, et al. miR-148a and miR-375 may serve as predictive biomarkers for early diagnosis of laryngeal carcinoma [J]. Oncol Lett, 2016,12(2):871-878.

[3] Espinosa-Parrilla Y, Muoz X, Bonet C, et al. Genetic association of gastric cancer with miRNA clusters including the cancer-related genes MIR29, MIR25, MIR93 and MIR106: results from the EPIC-EURGAST study [J]. Int J Cancer, 2014,135(9):2065-2076.

[4] Zhang Y, Zheng D, Xiong Y, et al. miR-202 suppresses cell proliferation in human hepatocellular carcinoma by downregulating LRP6 post-transcriptionally [J]. FEBS Lett, 2014,588(10):1913-1920.

[5] Marrero JA, Lok AS. Newer markers for hepatocellular carcinoma [J]. Gastroenterology, 2004,127(5):113-119.

[6] Wu SG, Huang YJ, Bao B, et al. miR-508-5p acts as an anti-oncogene by targeting MESDC1 in hepatocellular carcinoma [J]. Neoplasma, 2016,64(1):85-87.

[7] Zhang X, Jiang P, Shuai L, et al. miR-589-5p inhibits MAP3K8 and suppresses CD90+cancer stem cells in hepatocellular carcinoma [J]. J Exp Clin Cancer Res, 2016,35(1):176.

[8] Zhao Y, Li C, Wang M, et al. Decrease of miR-202-3p expression, a novel tumor suppressor, in gastric cancer[J]. PLoS One, 2013,8(7):69756.

[9] Meng X, Chen X, Lu P, et al. MicroRNA-202 inhibits tumor progression by targeting LAMA1 in esophageal squamous cell carcinoma[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2016,473(4):821-827.

[10] Farahani M, Rubbi C, Liu L, et al. CLL exosomes modulate the transcriptome and behaviour of recipient stromal cells and are selectively enriched in miR-202-3p[J]. PLoS One, 2015,10(10):0141429.

[11] Doleshal M, Magotra AA, Choudhury G, et al. Evaluation and Validation of Total RNA Extraction Methods for MicroRNA Expression Analyses in Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissues[J]. J Mol Diagn，2008,10(3):203-211.

[12] Lim LP, Lau NC, Garrett-Engele P, et al. Microarray analysis shows that some microRNAs down regulate large numbers of target mRNAs [J]. Nature, 2005,433(7027):769-773.

[13] Yang G, Zhang P, Lv A, et al. MiR-205 functions as a tumor suppressor via targeting TGF-α in osteosarcoma [J]. Exp Mol Pathol, 2016,100(1):160-166.

[14] Li Y, Chen D, Jin L, et al. MicroRNA-20b-5p functions as a tumor suppressor in renal cell carcinoma by regulating cellular proliferation, migration and apoptosis[J]. Mol Med Rep, 2016,13(2):1895-1901.

[15] Fu Y, Wei X, Tang C, et al. Circulating microRNA?101 as a potential biomarker for hepatitis B virus?related hepatocellular carcinoma[J]. Oncol Lett, 2013,6(6):1811-1815.

Expression changes of miR-202 in cancerous tissues and serum of patients with primary hepatocellular carcinoma

YULin,ZHANGKaijiong,CHAILi,LIBaolin,YANGZhihui,LIUJinbo

(TheAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou646000,China)

Objective To observe the expression changes and clinical significance of microRNA-202 (miR-202) in the cancerous tissues and serum of patients with primary hepatocellular carcinoma (HCC). Methods We collected 70 cases of primary HCC tissues and preoperative serum from 70 HCC patients, 30 cases of normal liver tissues which were confirmed with no tumor infiltration by pathology from 30 hepatic hemangioma patients, as well as 30 cases of serum from 30 healthy volunteers. RT-PCR was used to detect the expression of miR-202 in the normal liver tissues and primary HCC tissues, and in the serum of HCC patients and healthy volunteers, respectively. The relationship between miR-202 expression and the clinicopathological parameters in HCC patients was analyzed. We drew the ROC curve to evaluate the diagnostic value of miR-202, AFP, miR-202 combined with AFP in primary liver cancer.Results The relative expression of miR-202 in the primary HCC tissues was lower than that in the normal liver tissues (allP<0.05). The relative expression of miR-202 in the serum of HCC patients was lower than that in healthy subjects (P<0.05). The relative expression of miR-202 in primary HCC tissues was higher than that in the serum of HCC patients (P<0.05). The expression of miR-202 in primary HCC tissues was not correlated with gender, age, serum AFP level, tumor diameter, tumor size, tumor location, TNM stage, metastasis, invasion, HBV infection, with or without liver cirrhosis and portal vein thrombosis in HCC patients (allP>0.05).The serum levels of miR-202 in HCC pateints were only correlated with the number of tumors (P<0.05), but were not correlated with sex, age, serum AFP, tumor diameter, tumor number, tumor location, TNM stage, metastasis or not, capsule infiltration, HBV infection, with or without liver cirrhosis and portal vein thrombosis (allP>0.05). Combined detection of miR-202 and tumor marker AFP could get the higher sensitivity (81.8%) and specificity (93.0%) in the diagnosis of HCC, the AUC was 0.942. Conclusions The miR-202 expression in HCC tissues and serum is significantly lower in HCC patients, the miR-202 expression in HCC serum is correlated with tumor number, and the combined detection of miR-202 and AFP could get the higher sensitivity and specificity in the diagnosis of HCC.

hepatocellular carcinoma; primary hepatocellular carcinoma; liver neoplasm; microRNA; microRNA 202

四川省科學(xué)技術(shù)廳基金資助項(xiàng)目(14JC0801)；西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院科研項(xiàng)目(2015-QS-017)。

於琳(1989-)，女，碩士研究生在讀，主要研究方向?yàn)槟[瘤的分子診斷。E-mail: 790460087@qq.com

劉靳波(1970-)，女，博士，碩士研究生導(dǎo)師，教授，主要研究方向?yàn)槟[瘤的分子診斷。E-mail: liujb7203@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.07.001

R735.7

A

1002-266X(2017)07-0001-04

2016-07-31)